Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Mätning av kompressibiliteten hos cell och kärna baserat på akustofluidisk mikroenhet

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/64225
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sino-French Institute of Nuclear Engineering and Technology, Sun Yat-sen University

Summary

Här presenteras ett protokoll för att bygga ett snabbt och icke-destruktivt system för mätning av cell- eller kärnkompressibilitet baserat på akustofluidisk mikroenhet. Förändringar i mekaniska egenskaper hos tumörceller efter epitel-mesenkymal övergång eller joniserande strålning undersöktes, vilket visar tillämpningsutsikterna för denna metod i vetenskaplig forskning och klinisk praxis.

Abstract

Cellmekanik spelar en viktig roll vid tumörmetastaser, malign omvandling av celler och radiokänslighet. Under dessa processer är det ofta utmanande att studera cellernas mekaniska egenskaper. Konventionella mätmetoder baserade på kontakt såsom kompression eller sträckning är benägna att orsaka cellskador, vilket påverkar mätnoggrannheten och efterföljande cellodling. Mätningar i vidhäftande tillstånd kan också påverka noggrannheten, särskilt efter bestrålning eftersom joniserande strålning kommer att platta ut celler och förbättra vidhäftningen. Här har ett cellmekaniskt mätsystem baserat på akustofluidisk metod utvecklats. Cellkompressibiliteten kan erhållas genom att registrera cellrörelsebanan under verkan av den akustiska kraften, som kan realisera snabb och icke-destruktiv mätning i suspenderat tillstånd. Detta dokument rapporterar i detalj protokollen för chipdesign, provberedning, banregistrering, parameterutvinning och analys. Kompressibiliteten hos olika typer av tumörceller mättes baserat på denna metod. Mätning av kärnans kompressibilitet uppnåddes också genom att justera resonansfrekvensen för den piezoelektriska keramiken och mikrokanalens bredd. I kombination med verifieringen på molekylär nivå av immunofluorescensexperiment jämfördes cellkompressibiliteten före och efter läkemedelsinducerad epitelial till mesenkymal övergång (EMT). Vidare avslöjades förändringen av cellkompressibilitet efter röntgenbestrålning med olika doser. Den cellmekaniska mätmetoden som föreslås i denna uppsats är universell och flexibel och har breda tillämpningsutsikter inom vetenskaplig forskning och klinisk praxis.

Introduction

Cellmekaniska egenskaper spelar en viktig roll vid tumörmetastaser, malign omvandling av celler och radiokänslighet 1,2. För att få en fördjupad förståelse för rollen av cellmekaniska egenskaper i ovanstående process är noggrann mätning av cellulär mekanik kritisk, och mätningen bör inte orsaka skador på cellerna för efterföljande odling och analys. Mätprocessen bör vara så snabb som möjligt, annars kan cellviabiliteten påverkas om celler avlägsnas från odlingsmiljön under lång tid.

Befintliga cellmekaniska mätmetoder står inför vissa begränsningar. Vissa metoder, såsom magnetisk vridcytometri, magnetisk pincett och partikelspårningsmikrorheologi, orsakar cellskador på grund av införandet av partiklar i cellerna 3,4,5. Metoder som mäter genom kontakt med celler, såsom atomkraftmikroskop (AFM), mikropipettaspiration, mikroförträngning och parallellplattteknik, är också benägna att cellskador och genomströmningen är svår att öka 6,7,8. Dessutom kommer joniserande strålning att platta ut celler och öka deras vidhäftning9; Det är därför nödvändigt att mäta hela cellmekaniken i suspension.

Som svar på ovanstående utmaningar har ett cellmekaniskt mätsystem baserat på akustofluidisk metod 10,11,12,13,14 utvecklats. Kanalbredden matchas med den akustiska halvvåglängden, vilket skapar en stående vågnod vid mikrokanalens mittlinje. Under verkan av akustisk strålningskraft kan cellerna eller standardpärlorna flytta till den akustiska trycknoden. Eftersom de fysikaliska egenskaperna hos standardpärlorna (storlek, densitet och kompressibilitet) är kända kan den akustiska energitätheten bestämmas. Därefter kan cellkompressibiliteten erhållas genom att registrera cellernas rörelsebanor i det akustiska fältet. Icke-destruktiv mätning med hög genomströmning av celler i suspensionstillstånd kan uppnås. Detta dokument kommer att introducera utformningen av det mikrofluidiska chipet, upprättandet av systemet och mätstegen. Mätning av olika typer av tumörceller har utförts för att verifiera metodens noggrannhet. Tillämpningsområdet för denna metod hade utvidgats till subcellulära strukturer (såsom kärna) genom att justera resonansfrekvensen för den piezoelektriska keramiken och mikrokanalens bredd. Dessutom undersöktes förändringarna i cellkompressibilitet efter läkemedelsinducerad EMT eller röntgenbestrålning med olika doser. Resultaten visar den breda tillämpbarheten av denna metod som ett kraftfullt verktyg för att studera korrelationen mellan biokemiska förändringar och cellulära mekaniska egenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tillverkning och montering av akustofluidisk mikroenhet

  1. Tillverkning av det mikrofluidiska chipet.
    1. Designa ett enkanaligt chip med endast ett inlopp och utlopp som visas i figur 1. För mätning av celler, håll mikrokanalens rektangulära tvärsnitt vid 740 μm bred och 100 μm djup. För mätning av cellkärna, ändra mikrokanalens bredd och djup till 250 μm respektive 100 μm.
    2. Förbered mikrokanalen på kiselskiva via reaktiv jonetsning. Försegla toppen av mikrokanalen med en bit transparent värmebeständigt glas genom anodisk bindning15. Tvätta chipsen med en ultraljudsrengörare i 10 min. Torka dem i en torkugn vid 50 °C för senare användning.
  2. Tillverka block av polydimetylsiloxan (PDMS).
    1. Tillsätt 30 ml förpolymer till en 100 mm (i diameter) glasskål. Tillsätt 3 ml härdningsmedel till prepolymeren med en spruta.
      OBS: Volymförhållandet mellan härdningsmedlet och prepolymeren är 1:10.
    2. Blanda kraftigt PDMS-förpolymeren och härdningsmedlet med en glasstav i ca 10 min. Leta efter små och jämnt separerade luftbubblor i lösningen, vilket indikerar att PDMS-förpolymeren och härdningsmedlet är väl blandade.
    3. Placera glasskålen i en vakuumtorkator och evakuera i 15-25 s. Upprepa denna process tills det inte finns några luftbubblor i blandningen.
    4. Placera glasskålen i en torkugn inställd på 50 °C i 1 timme så att blandningen härdar. Efter inkubationen, använd en skalpell för att skära PDMS i block av lämplig storlek ca 1,2 cm lång och 1 cm bred.
      OBS: PDMS-blockets längd överensstämmer med chipets bredd och bredden väljs för att säkerställa att det finns tillräckligt med utrymme i mitten för den piezoelektriska keramiken när två PDMS-block fästs på chipet.
  3. Bind PDMS-blocket till chipet.
    1. Stansa hål i PDMS-blocket för inlopps- och utloppsportar med en ihålig nål med en ihålig nål med en diameter på 1 mm. Sätt PDMS-blocken och chipet (baksidan uppåt) i en plasmarengörare i 1 min.
    2. Rikta in hålen på PDMS-blocken med chipinloppet och utloppet. Tryck försiktigt på PDMS-blocken till chipet i 15 s. Detta bör orsaka bindning mellan PDMS-blocken och chipets yta.
  4. Anslut katetern av polytetrafluoretylen (PTFE) till chipet (figur 2B).
    1. Skär två stycken PTFE-kateter med en innerdiameter på 0,8 mm och en längd av 10 cm. Böj en nål i rostfritt stål med en innerdiameter på 0,7 mm och en längd på 1,5 cm x 90° till en L-form. Anslut den till ena änden av katetern. Förbered två sådana katetrar med nålar.
    2. Sätt in nålarna i rostfritt stål i hålen i PDMS-blocken. För inloppet, anslut en 19 G doseringsnål till den andra änden av katetern som en kontakt för en spruta.
    3. Efter att ha slutfört ovanstående steg, injicera avjoniserat vatten för att testa tätheten hos den totala kanalen. Ogenomtränglig för vatten betyder en bra tätning.
  5. Piezoelektrisk keramisk enhet (figur 2C)
    1. Använd en diamanttrådskärare för att skära piezoelektriska keramiska ark med en diameter av 2 cm i fyra remsor med en bredd av 5 mm.
    2. Se till att resonansfrekvensen för den piezoelektriska keramiken matchar bredden på chipmikrokanalen. För den 740 μm och 250 μm breda mikrokanalen, använd piezoelektrisk keramik med resonansfrekvenser på 1 MHz respektive 3 MHz.
    3. Svetstrådar på båda sidor av den piezoelektriska keramiken i ena änden.
    4. Limma den piezoelektriska keramiken på mitten av baksidan av chipet med cyanoakrylatlim.
    5. För att sprida limet jämnt, placera en droppe lim på den piezoelektriska keramiken, släta limet med en tandpetare och ta bort överflödigt lim. Tryck sedan snabbt på det på chipet och fortsätt att trycka i cirka 1 min. Se till att den piezoelektriska keramiken och chipet är ordentligt bundna och jämnt kontaktade.
  6. Montera mikroenheten (bild 2D).
    1. Skär en bit PDMS (ca 1,5 cm lång och 1 cm bred) som bas på mikroenheten. Använd dubbelsidig tejp och fäst ena sidan av basen på inlopps- och utlopps-PDMS-blocken och den andra sidan på en transparent glasskiva. Fäst hela mikroenheten i mikroskopsteget för att hålla chipet i ett fokalplan.

2. Beredning av prov

  1. Framställning av polystyrenstandardpartikellösningar.
    1. Tillsätt 0,05 ml polystyrenpartikellösning (6 μm i diameter) (2,1 x 108 partikel/ml) till 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och blanda väl.
      OBS: För att minska mätfelet som orsakas av förändringen av den akustiska energitätheten blandades polystyrenpartikellösningen med provlösningen i varje experiment som kalibrering.
  2. Framställning av cellsuspensioner.
    1. Tvätta de vidhäftande cellerna (t.ex. MCF7, MDA-MB-231, HCT116) vid 90% sammanflöde (~ 5 x 105 celler) med PBS. Tillsätt 500 μL 0,25% trypsin (1x) i 1-2 min vid rumstemperatur (25 °C). Ta bort trypsinet, tillsätt 1 ml komplett medium och bilda en cellsuspension genom pipettering.
    2. Centrifugera cellsuspensionen vid 100 x g i 5 minuter. Ta bort supernatanten och återsuspendera i 0,5-1 ml PBS för att erhålla en cellsuspension. Cellerna räknades med en hemocytometer och koncentrationen var ca 3-5 x 105 celler/ml.
  3. Framställning av cellkärnans suspension
    1. Utför steg 2.2. Ta sedan bort supernatanten och tillsätt 200 μL cytoplasmatisk proteinextraktionsreagens A (kompletterat med 1% PMSF) per 20 μL cellpellet (cirka 5 miljoner celler) och blanda väl.
    2. Vortex ovanstående blandning vid 220 x g i 5 s och lägg sedan på isbad i 10 min. Efter inkubation tillsätt 10 μL cytoplasmatiskt proteinextraktionsreagens B till lösningen.
    3. Vortex vid 220 x g i 5 s. Lägg på isbad i 1 min och virvla igen vid 220 x g i 5 s. Centrifugera sedan slutligen vid 1 000 x g i 5 minuter vid 4 °C.
      OBS: Volymförhållandet för cytoplasmatiska proteinextraktionsreagens A och B är 20: 1.
    4. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml PBS. Centrifugera sedan vid 1 000 x g vid 4 °C i 4 minuter. Ta bort supernatanten och återsuspendera i 100 μL PBS som cellkärnsuspension.
    5. Tillsätt trypanblått till ovanstående cellkärnans suspension och fläcka vid rumstemperatur (25 °C) i 4 minuter. Volymförhållandet mellan trypanblå lösning och kärnsuspension är 1:1. Räkna antalet kärnor under det inverterade mikroskopet med ett 10x mål.
      OBS: För att tydligt identifiera cellkärnorna under mikroskopet krävs trypanblå färgning. Trypan blå lösning måste vara i ett 37 °C vattenbad i 10 minuter före användning för effektiv färgning.
    6. Späd ovanstående cellkärnsuspension med PBS-buffert till en koncentration av 2-3 x 105 kärna/ml. Filtrera cellkärnans suspension genom en sikt på 70 μm.

3. Mätning av kompressibiliteten hos cell och kärna

  1. Ställ in mätsystemet (bild 3)
    1. Slå på mikroskopets ljuskälla och öppna kameraprogramvaran. Använd 4x-målet för att hitta mikrokanalens mittposition, dvs positionen för den piezoelektriska keramiken.
    2. Anslut ledningarna och svetsa dem till de positiva och negativa terminalerna på signalgeneratorutgången på den piezoelektriska keramiken.
    3. Placera sprutan på mikroinjektionspumpen och anslut den till inloppskatetern. Placera en liten behållare i slutet av utloppskatetern för att hålla vätskan som strömmar ut ur mikrokanalen.
  2. Bestäm mätparametrar
    1. Aspirera polystyrenpartikellösningen med sprutan och injicera den i chipmikrokanalen. Undvik luftbubblor i chipmikrokanalen för att säkerställa noggrann mätning. Se till att partiklarna är jämnt fördelade i chipmikrokanalen.
      OBS: Mätning kan utföras utan flöde eller sprutpump. Vid behov bör mikroinjektionspumpens flödeshastighet ställas in på ett korrekt värde. Här är flödesområdet 0-20 μl / h.
    2. Ställ in signalgeneratorns utgång på en sinussignal med en frekvens på 1 MHz (3 MHz för cellkärnmätning) och topp-till-toppspänning (Vpp) på 10 V.
    3. Finjustera signalens frekvens tills det observeras att partiklarna rör sig mot mikrokanalens mittlinje och förblir i framåtrörelse längs mittlinjen efter att ha nått mittlinjen (figur 4).
      OBS: Hastigheten hos partiklarna som rör sig mot mittlinjen bestäms av spänningsamplituden, som kan justeras mellan 5 Vpp och 20 Vpp.
  3. Mät celler och kärnor
    1. Blanda 1 ml cell- eller kärnsuspension med standardpartikellösningen i förhållandet 1:1 och injicera den i mikrokanalen med en spruta.
    2. Börja spela in med CCD-kamera när cellerna eller kärnorna kommer in i synfältet. Slå sedan på signalgeneratorn. Sluta spela in när cellerna eller kärnorna når mittlinjen.
    3. Skölj mikrokanalen med avjoniserat vatten, 75% alkohol och avjoniserat vatten i följd för senare användning.

4. Behandling av uppgifter

  1. Kartlägg partikel- eller cellbanor.
    1. Importera den inspelade videon till ImageJ-programvaran: Filen > Öppna> Välj mapp. Klicka på ellipsformen i verktygsfältet i ImageJ-programvaran för att välja en cell av intresse och dess intilliggande partikel (figur 5).
    2. Som visas i figur 5, förinställda mätparametrar i ImageJ-programvaran som Analys→ Ställ in mätning →Area, Centroid, Display Label.
    3. Ta ramen där målcellen eller partikeln genomgår längsgående förskjutning som startram; Registrera cellens eller partikelns pixelposition och storlek i varje bildruta tills den når mikrokanalens mittlinje. Exportera data som en kalkylbladsfil och upprepa steget tills banor för alla celler av intresse har erhållits.
  2. Koordinera transformation och korrigering.
    1. Spela in pixelkoordinaterna för mikrokanalens fyra hörn i detta synfält som (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Här x3 = x4.
    2. För varje mätpunkt (xi, yi) beräknar du den nya koordinaten (xi', yi') efter rotationskorrigering med hjälp av följande formler:
      Equation 1
      Equation 2
      Equation 3
    3. Konvertera pixelkoordinater till verkliga storlekskoordinater. De faktiska koordinaterna kan erhållas genom att multiplicera pixelkoordinater med förhållandet. Förhållandet var den faktiska bredden på mikrokanalen dividerad med mikrokanalens pixelbredd (H).
    4. Transformera och korrigera pixelkoordinaterna för cellerna och partiklarna som erhållits i steg 4.1 till de slutliga rörelsebanedata. Alla koordinater minus koordinaterna för det nedre vänstra hörnet, dvs (0, y2). Bildhastigheten för videon är 40 bilder per sekund, så multiplicera antalet bilder som motsvarar varje koordinat med 0,025 s för att erhålla tiden för partikelrörelse och därigenom erhålla förändringen av positionen i y-riktningen med tiden.
  3. Beräkna den akustiska energitätheten (figur 6A,B).
    1. Cellens eller partikelns rörelse i Y-riktningen drivs av den akustiska kraften F ac och den hydrodynamiska kraften FD. Beräkna rörelsebanan med hjälp av följande formler:
      Equation 4(1)
      Equation 5(2)
      Equation 6(3)
      där r och D är cellens eller partikelns radie och diameter, ρ och β är densiteten och kompressibiliteten, ν är hastighetsvektorn. Prenumerationerna c och f betecknar cellen respektive vätskan. d är avståndet från närmaste akustiska trycknod, μ är vätskans dynamiska viskositet, k är vågtalet och E är den akustiska energitätheten.
      OBS: Densiteten hos MCF7, HCT116, A549 och cellkärnor var 1068 kg/m 3, 1077 kg/m 3, 1073 kg/m 3 respektive 1155 kg/m 3 12,16,17.
    2. Enligt de formler som beskrivs i steg 4.3.1, använd MATLAB-programvaran för att erhålla den numeriska lösningen för standardpartikelbanan under det akustiska fältet med ändlig skillnadsmetod.
    3. Inom det förinställda akustiska fältområdet, ändra den akustiska energitätheten och anpassa den numeriska lösningen (erhållen i steg 4.3.2) och den uppmätta rörelsebanan (erhållen i steg 4.2) för standardpartikeln. Välj det bästa passande resultatet enligt det passande medelkvadratfelet. Den akustiska energitätheten som erhålls här används som en parameter för efterföljande beräkning av cellkompressibilitet.
  4. Beräkna cellkompressibiliteten (figur 6C,D).
    1. Ställ in den akustiska energitätheten på det värde som erhålls i steg 4.3.3.
    2. Enligt formlerna som beskrivs i steg 4.3.1, använd MATLAB-programvaran för att erhålla den numeriska lösningen för cellbanan under det akustiska fältet med ändlig skillnadsmetod.
    3. I likhet med steg 4.3.3, inom det förinställda kompressibilitetsområdet, ändra kompressibiliteten och anpassa den numeriska lösningen (erhållen i steg 4.4.2) och den uppmätta rörelsebanan för cellen (erhållen i steg 4.2). Använd kompressibilitetskoefficienten som motsvarar det bäst passande resultatet som den uppmätta cellkompressibiliteten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här presenterade arbetet ett protokoll för konstruktion av ett snabbt och icke-destruktivt cellkompressibilitetsmätningssystem baserat på akustofluidisk mikroenhet och demonstrerade dess fördelar för att mäta cell och kärna under olika situationer. Figur 1 visar schemat för den mikrofluidiska kanalen. Komponenterna och sammansättningen av den akustofluidiska mikroenheten visas i figur 2. Figur 3 visar mätsystemets inställning. Under verkan av den akustiska fältkraften kommer celler och partiklar att röra sig mot mikrokanalens mittlinje, som visas i figur 4A. Mätning av cellernas eller partiklarnas storlek och position visas i figur 5. Beräkningen av energitäthet och cellkompressibilitet genom montering visas i figur 6. För att utvidga tillämpningsområdet för denna anordning till cellulära organeller, särskilt kärnan, isolerades hög renhet och intakta kärnor från celler (figur 7A). Genom att justera resonansfrekvensen för den piezoelektriska keramiken och mikrokanalens bredd erhölls följaktligen kärnans rörelsebana (figur 4B) och mätningen av kärnkompressibilitet uppnåddes (figur 7B).

Baserat på detta system mättes och jämfördes kompressibiliteten hos olika typer av cancerceller (figur 8A). Dessutom undersöktes förändringarna i cellkompressibilitet efter läkemedelsinducerad EMT eller röntgenbestrålning med olika doser (figur 8B,C). För EMT-induktion användes tillväxtfaktor såsom transformerande tillväxtfaktor beta (TGFβ), epidermal tillväxtfaktor (EGF) och basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF). För bestrålning var dosraten 153 mU/min och de doser som användes var 1, 2, 4 och 8 Gy. Dessa resultat visar den breda tillämpligheten av denna metod som ett kraftfullt verktyg för att studera korrelationen mellan biokemiska förändringar och cellulära mekaniska egenskaper. Viktigast av allt var denna metod en icke-förstörelsemätning. De uppmätta cellerna samlades in och såddes i en cellodlingsskål, och det visade sig att det inte fanns någon signifikant skillnad i cellproliferation och viabilitet jämfört med den obehandlade gruppen efter 48 timmars odling, vilket visas i figur 9, vilket indikerar att mätningen inte har någon effekt på cellproliferation och överlevnad.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt diagram över chipmikrokanalen. Denna bild visar strukturen och dimensionerna på chipmikrokanalen med ett enda inlopp och utlopp. Enheten är mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Monteringsfoto för den akustofluidiska mikroenheten . (A) Fram- och bakfoton av chipet. (B) Denna bild visar PTFE-katetern med inloppsdoseringsnål med fäst 19 G doseringsnål och nål i rostfritt stål. (C) Denna bild visar den piezoelektriska keramiken med svetsade ledningar. (D) Denna bild visar sammansättningen av den akustofluidiska mikroenheten med bas för fixering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Inställning av cellkompressibilitetsmätningssystemet. Denna bild visar installationen av mätsystemet som består av signalgenerator, sprutpump, akustofluidisk mikroenhet, mikroskop och CCD-kamera. Denna siffra har modifierats från10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Rörelsen av celler och kärnor. Denna figur visar rörelsen av celler (A) och cellkärnor (B) till mikrokanalens mittlinje under verkan av den akustiska fältkraften. Skalstreck = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Mätning av storleken och positionen för en cell eller partikel med hjälp av ImageJ-programvaran. Den här bilden visar knappklicket för att få parametrar som area och centroid i ImageJ-programvaran. Pixelkoordinaterna för mikrokanalens fyra hörn registrerades som (0, y1), (0, y2), (x3, y3), (x4, y4). Pixelbredden representerades som H. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Beräkning av energitäthet och cellkompressibilitet genom montering. (A) Medelvärde för kvadratfel (LS) vid olika energitätheter. Den akustiska energitätheten erhölls från det bästa passande resultatet. Enheten för energitäthet är J / m3. (B) Denna figur visar den numeriska lösningens anpassning och partikelns uppmätta rörelsebana. (C) Medelvärdet för kvadratfel (LS) vid olika cellkompressibilitet. Cellkompressibiliteten erhölls från det bästa passande resultatet. (D) Denna figur visar anpassningen av den numeriska lösningen och den uppmätta rörelsebanan för cellen. Enheten för cellkompressibilitet är 10-10 Pa-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Kärnextraktion och kompressibilitetsmätning. (A) Denna bild visar cellkärnorna extraherade från A549-celler sett med ett 40x-mål. Skalstreck = 20 μm. (B) Denna bild visar den uppmätta kompressibilitetsjämförelsen av A549-celler (N = 38) och deras kärnor (N = 45). Enheten för cellkompressibilitet är 10-10 Pa-1. Lådans längd representerar standardavvikelsen. Elevens t-test och chi-square-analys användes för att bedöma betydelse. **P < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Kompressibiliteten hos olika typer av cancerceller och celler efter läkemedelsinducerad EMT- eller röntgenbestrålning. (A) Cellkompressibiliteten hos olika typer av cancerceller. HCT116 (N = 36), A549 (N = 68) och MDA-MB-231 (N = 32) var cellinjerna för kolorektalt karcinom, lungadenokarcinom respektive bröstadenokarcinom. (B) Cellkompressibiliteten hos MCF7 och A549 före och efter induktion av EMT. C) Cellkompressibilitet uppmätt vid 3 timmar efter bestrålning med olika doser. Enheten för cellkompressibilitet är 10-10 Pa-1. Boxplotens ändfält representerar värdena 10% respektive 90%. Lådans längd representerar standardavvikelsen. Den mellersta horisontella linjen representerar medianvärdet. ns betyder ingen statistisk signifikans. Elevens t-test och chi-square-analys användes för att bedöma betydelse. *P < 0,05, **P < 0,01. En del av denna siffra har ändrats från18,19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Cellproliferation och viabilitet efter kompressibilitetsmätning. Denna figur visar cellproliferation A549 (A) och viabilitet (B) efter kompressibilitetsmätning. Kontrollgrupper är obehandlade celler. Testgrupper är cellerna som odlas i 48 timmar efter kompressibilitetsmätning. Varje experiment har minst tre replikat. För cellviabilitet räknades minst 300 celler. Elevens t-test och chi-square-analys användes för att bedöma betydelse. ns indikerar inte statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vanliga cellmekaniska mätmetoder är AFM, mikropipettaspiration, mikrofluidikmetoder, parallellplatteteknik, optisk pincett, optisk bår och akustiska metoder20. Mikrofluidikmetoder kan fungera med tre tillvägagångssätt: mikroförträngning, förlängningsflöde och skjuvflöde. Bland dem är optisk bår, optisk pincett, akustiska metoder, förlängningsflöde och skjuvflödesmetoder beröringsfria mätningar. Till skillnad från kontaktmätningar kan beröringsfria mätningar effektivt undvika cellskadeproblem orsakade av kontakt eller lokal deformation. Optisk pincett är mycket känslig för mätmiljön21. Störningar i optiska förhållanden kan orsaka betydande skillnader i mätresultat, och hög lasereffekt under mätningen kan också orsaka cellskador. Dessutom har optisk bår och optisk pincett i allmänhet låg genomströmning20,22. Mikrofluidikmetoder som förlängningsflöde och skjuvflöde kan inte mäta mikromekanik hos tumörceller direkt23. Jämfört med andra metoder har akustiska metoder fördelarna med icke-destruktiv, hög genomströmning och bred tillämplighet vid mätning av cellmekanik.

Mätmetoden baserad på akustofluidisk mikroenhet utformad i detta papper använder beröringsfri akustisk strålningskraft, och den största fördelen är att den inte skadar celler, vilket bekräftades av de experimentella resultaten som visas här (Figur 9). En annan fördel med denna metod är den höga genomströmningen, som kan justeras genom att ändra cellkoncentrationen. För närvarande kan en mäthastighet på cirka 50-70 celler / min uppnås under förutsättning att säkerställa noggrannheten i efterföljande dataanalys. Eftersom cellerna mäts i suspension kan mätningen av icke-vidhäftande celler också uppnås, vilket utökar dess tillämpningsområde. Dessutom uppnåddes mätning av cellkompressibiliteten efter bestrålning i detta papper, och förhållandet mellan cellkompressibilitet och bestrålningsdos avslöjades (figur 8). Dessutom kan mätningen av celler eller kärna med olika styvhet också anpassas genom att justera resonansfrekvensen hos den piezoelektriska keramiken och mikrokanalens bredd. Som visas i figur 7 uppnåddes mätning av kärnans kompressibilitet.

Här beaktades endast cellernas rörelse längs längden och bredden på den mikrofluidiska kanalen. Cellerna ansågs vara i suspension eftersom cellernas densitet ligger nära vätskans. Om det fanns celluppgörelse eller friktion med botten, skulle den hittas i den efterföljande bananpassningsprocessen. Sådana uppgifter kommer att elimineras. För att validera den föreslagna metoden testades två typer av polystyrenpärlor med olika diameter (6 μm och 10 μm). Pärlorna med 6 μm diameter användes som kontroll. Kompressibiliteten hos pärlor med 10 μm diameter erhölls som 2,37 ± 0,11 x 10-10 Pa-1, i överensstämmelse med värdet (2,1-2,4 x 10-10 Pa-1) som rapporterats i en annan forskning 15,24.

Baserat på denna metod mättes kompressibiliteten hos celler och kärnor. Eftersom kärnan spelar en viktig roll vid mekanosens och mekanotransduktion kan mätning av kärnans mekaniska egenskaper hjälpa till att bättre förstå hur de svarar på yttre stimulans såsom joniserande strålningsinducerad DNA-skada (Figur 8). Dessutom visade experiment att cellkompressibilitet kan fungera som en ny indikator för övervakning av EMT-processen (figur 8), vilket visar dess tillämpningsmöjligheter vid cancerdiagnos. Eftersom den akustiska strålningskraften är relaterad till cellstorlek, celltäthet och kompressibilitet kan denna metod också användas för cellisolering, såsom separation av cirkulerande tumörceller (CTC) eller deras kluster från blodprovet. CTC och deras kluster spelar en viktig roll i tidig upptäckt av metastatiska tumörer och övervakning av strålbehandlingseffekt25,26. Därför har denna metod stora kliniska tillämpningsmöjligheter vid tidig screening och effektutvärdering av cancer.

Det är värt att notera att nyckelfaktorn som påverkar mätningen av denna metod är matchningen av resonansfrekvensen med mikrokanalens bredd, vilket resulterar i utseendet på en stående vågnod vid mikrokanalens mittlinje. Samtidigt bör man uppmärksamma klistra in piezoelektrisk keramik. Dessutom, för att exakt identifiera och spåra banan för celler eller partiklar och undvika problemet med cellaggregering på grund av vidhäftning, bör genomströmningen inte vara för hög. Hur förändringar i andra parametrar (såsom cellstorlek, celltäthet etc.) påverkar mätningen av kompressibilitet har studerats i tidigare arbete18. Vid mätning av cellkärnor, på grund av deras mjukhet, krävs dessutom en stor akustisk strålningsdrivkraft för att få dem att röra sig smidigt till mikrokanalens mittlinje, vilket kräver en snabb kamera för att exakt fånga banorna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (bidragsnummer 12075330 och U1932165) och Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (bidragsnummer 2020A1515010270).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin(1x) GIBCO 15050-065
502 glue Evo-bond cyanoacrylate glue
A549 ATCC CCL-185 lung adenocarcinoma
Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit Beyotime P0027 Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)  corning 10-013-CVRC
Fetal Bovine Srum(FBS) AUSGENEX FBS500-S
HCT116 ATCC CCL247 colorectal carcinoma
Heat-resistant glass Pyrex
Leibovitz’s L-15 medium  GIBCO 11415-064
MCF-7 ATCC HTB-22  breast Adenocarcinoma
MDA-MB-231 ATCC HTB-26  breast Adenocarcinoma
Minimum Essential Medium (MEM) corning 10-010-CV
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15140-122
Phosphate buffer corning 21-040-cvc
PMSF Beyotime ST506 100mM
Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere  polysciences 15714 The diameter of microshpere is 6.00µm
propidium iodide(PI) Sigma-Aldrich P4170
SYLGARD 184Silicone ELASTOMER Dow-Corning 1673921 Contains prepolymers and curing agents
Trypan Blue Beyotime C0011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  2. Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
  3. Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
  4. Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
  5. Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
  6. Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
  7. Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
  8. Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
  9. Jung, J. -W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
  10. Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
  11. Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
  12. Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
  13. Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
  14. Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
  15. Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
  16. Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
  17. Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
  18. Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
  19. Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
  20. Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
  21. Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
  22. Wei, M. -T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
  23. Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
  24. Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
  25. Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
  26. Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).

Tags

Cancerforskning nummer 185
Mätning av kompressibiliteten hos cell och kärna baserat på akustofluidisk mikroenhet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu,… More

Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liu, Y. Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice. J. Vis. Exp. (185), e64225, doi:10.3791/64225 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter