يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل التدفق الخلوي للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم لنخاع عظم الفئران والخلايا المتخصصة اللحمة

6.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/64248

⸱

سبتمبر 28, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف بروتوكولا بسيطا لعزل وتلطيخ خلايا نخاع عظم الفئران إلى النمط الظاهري للخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية جنبا إلى جنب مع الخلايا الجذعية البطانية والوسيطة المتخصصة. كما يتم تضمين طريقة لإثراء الخلايا الموجودة في مناطق نخاع العظم الداخلية والمركزية.

الملخص

نخاع العظم (BM) هو النسيج الرخو الموجود داخل العظام حيث يحدث تكون الدم ، وهي العملية التي يتم من خلالها توليد خلايا دم جديدة ، بشكل أساسي. على هذا النحو ، فإنه يحتوي على الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) ، بالإضافة إلى دعم الخلايا اللحمية التي تساهم في صيانة وتنظيم HSPCs. اضطرابات الدم وغيرها من اضطرابات BM تعطل تكون الدم من خلال التأثير على الخلايا المكونة للدم مباشرة و / أو من خلال تغيير مكانة BM. هنا ، نصف طريقة لدراسة تكون الدم في الصحة والأورام الخبيثة من خلال تحليل النمط الظاهري للفئران BM HSPCs ومجموعات اللحمة المتخصصة عن طريق قياس التدفق الخلوي. توضح طريقتنا بالتفصيل الخطوات المطلوبة لإثراء خلايا BM في أجزاء BM الداخلية والمركزية ، بالإضافة إلى استراتيجيات البوابات المناسبة لتحديد نوعين رئيسيين من الخلايا المتخصصة المشاركة في تنظيم HSPC ، الخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة. يمكن دمج تحليل النمط الظاهري المقترح هنا مع طفرات الفئران ونماذج الأمراض والمقايسات الوظيفية لتوصيف حجرة HSPC ومكانتها.

المقدمة

قياس التدفق الخلوي هو طريقة لا تقدر بثمن لتوصيف وعزل الخلايا المناعية والمكونة للدم بشكل مستقبلي. كما يتم استخدامه بشكل متزايد لتحليل المجموعات اللحمية والظهارية للأنسجة المختلفة. تتميز الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) بخصائص فريدة من نوعها للتجديد الذاتي وتعدد القدرات. في الثدييات البالغة ، توجد HSCs بشكل أساسي في نخاع العظم (BM) ، حيث تتلقى إشارات الهدوء والبقاء على قيد الحياة من البيئة المكروية المحيطة أو المتخصصة1. يتم تعريف HSCs رسميا وفقا للمقايسات الوظيفية2. ومع ذلك ، فقد أظهرت العديد من الأوراق التاريخية فائدة قياس التدفق الخلوي لتحديد HSCs. من خلال استخدام علامات سطح الخلية المحدودة ، من الممكن التمييز بين الم....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إيواء الحيوانات المستخدمة في هذا البروتوكول في منشأة الحيوانات i3S في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض في دورة 12 ساعة من الضوء والظلام وبيئة يتم التحكم في درجة حرارتها. تم توفير حرية الوصول إلى طعام القوارض القياسية والمياه. تلقت جميع الحيوانات رعاية إنسانية وفقا للمعايير التي حددها اتحاد جمعيات علوم المختبر الأوروبية لرعاية المختبر والتعامل معها (توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU). تمت الموافقة على الإجراء التجريبي الذي تم إجراؤه على الحيوانات (القتل الرحيم) من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان i3S (المرجع DD_2019_15) و Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. يمكن العثور على تفاصيل المواد المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر الشكل 1 مخططات تمثيلية لتحليل قياس التدفق الخلوي ل HSCs و MPPs في فأر C57Bl / 6 الشاب الأصحاء. تتبع استراتيجية البوابات أحدث تسميات منسقة اقترحها ISEH13. عند تحليل تأثير الاضطراب ، مثل العدوى أو السرطان ، من المهم استخدام ماوس التحكم كمرجع للبوابات العادية. يمكن أن تكون عناصر التحكم في مضان ناقص واحد (FMO) مفيدة بشكل خاص لترسيم حدود البوابات ، ولكن تجدر الإشارة إلى أن الإعداد الأعمى لحدود البوابة بناء على FMOs قد يحذف الخلايا المستهدفة أو يتضمن خلايا غير مستهدفة........

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في حين أن البروتوكول الموصوف بسيط وسهل التنفيذ ، يجب إيلاء اهتمام خاص لخطوات محددة. على سبيل المثال ، عند الحصول على تدفق BM (الخطوة 5.2) ، يجب عدم تجاوز حجم أو عدد المرات المشار إليها لتمرير PBS 2٪ FBS عبر الجزء الداخلي من الجزء المركزي من العظم ، لأن هذا قد يؤدي إلى تلوث كبير للعينة المتدفقة بواسطة مجموعات الخلايا الداخلية.

يمكن إجراء تعديلات على البروتوكول لتسهيل تنفيذه من قبل المحقق. في استخراج العينات (القسم 2) ، يمكن تخزين الأرجل و / أو العظام في PBS 2٪ FBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

تم دعم LM بمنحة من صندوق السيدة تاتا التذكاري. تم دعم JR من خلال زمالة الدكتوراه من Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; زمالة FCT UI/BD/150833/2021). تم دعم ML من خلال زمالة الدكتوراه من FCT (زمالة FCT 2021.04773.BD). تم دعم DD بمنح من الجمعية الأمريكية لأمراض الدم ، ومؤسسة بابلوف ، و FCT (EXPL / MED-ONC / 0522/2021) ، والجمعية البرتغالية لأمراض الدم. نشكر الدعم المقدم من الدكتورة كاتارينا ميريليس وإميليا كاردوسو من منشأة تريسي في i3s.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 647 الأجسام المضادة للفأر CD54 / ICAM-1BioLegend116114
APC StreptavidinBioLegend405207
APC / Cyanine7 المضادة للفأر CD117 (c-kit) الأجسام المضادةBioLegend105826
APC / Cyanine7 المضادة للفأر CD45 BioLegend103116
APC / Cyanine7 المضادة للفأر TER-119 / خلايا الكريات الحمراء المضادةBioLegend116223
البيوتين المضاد للفأر CD3 & إبسيلون ؛ الأجسام المضادةBioLegend100304
Biotin المضادة للفأر CD4 الأجسام المضادةBioLegend100404
Biotin المضادة للفأر CD8aBioLegend100704
Biotin المضاد للفأر Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) الجسم المضادBioLegend108404
Biotin الأجسام المضادة للفأر TER-119 / خلايا الكريات الحمراءBioLegend116204
البيوتين المضاد للفأر / الجسم المضاد البشري CD11bBioLegend101204
البيوتين المضاد للفأر / الإنسان CD45R / B220 الجسم المضادBioLegend103204
Brilliant Violet 510 الأجسام المضادة للفأر CD150 (SLAM)BioLegend115929
Calibrite 2 Color BeadsBD Biosciences349502
Collagenase IVMerck Life ScienceC1889
Dispase IIMerck Life ScienceD4693
مصل الأبقار الجنينية ، مؤهل ، معطل بالحرارة ، معتمد من الاتحاد الأوروبي ،الجنوبية ThermoFisher Scientific10500064
محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS)ThermoFisher Scientific14175095
الفأر Leptin R الأجسام المضادة البيوتينيلR & أنظمة DBAF497
NucBlue كاشف الخلية الثابتة (DAPI) كاشفThermoFisher ScientificR37606DAPI كاشف
PE الأجسام المضادة للاندوموسين المضاد للفأرThermoFisher Scientific12-5851-82
PE المضاد للفأر Flk2 (CD135)ThermoFisher Scientific12-1351-82
PE / Cyanine7 المضاد للفأر CD31 الأجسام المضادةBioLegend102524
PE / Cyanine7 الأجسام المضادة CD48 المضادة للفأرBioLegend103424
PerCP الأجسام المضادة Ly-6A / E (Sca-1) المضادة للفأرBioLegend108122
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أقراصMerck Life ScienceP4417
المضاد النقي المضاد للفأر CD16 / 32BioLegend101302
تحلل كرات الدم الحمراء 10xBioLegend420302
صبغة الزومبي البنفسجي القابلة للإصلاحBioLegend423114صبغة الفلورسنت
من أصل أمريكا محلول الجسم محلول

المراجع

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

خلايا نخاع العظمالخلايا الجذعية المكونة للدمنخاع العظم الداخلينخاع العظم المركزيالخلايا الجذعية الميزنشيميةالخلايا البطانيةالتحليل المظهري
تحليل التدفق الخلوي للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم لنخاع عظم الفئران والخلايا المتخصصة اللحمة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.