Summary

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Published: September 28, 2022
doi:

Summary

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Abstract

Kemik iliği (BM), yeni kan hücrelerinin üretildiği süreç olan hematopoezin öncelikle meydana geldiği kemiklerde bulunan yumuşak dokudur. Bu nedenle, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC’ler) ve HSPC’lerin bakımına ve düzenlenmesine katkıda bulunan destekleyici stromal hücreleri içerir. hematolojik ve diğer BM bozuklukları, hematopoetik hücreleri doğrudan ve / veya BM nişinin değiştirilmesi yoluyla etkileyerek hematopoezi bozar. Burada, murin BM HSPC’lerinin ve stromal niş popülasyonlarının akış sitometrisi ile fenotipik analizi yoluyla sağlık ve malignitede hematopoez incelemek için bir yöntem tanımlanmıştır. Yöntemimiz, endosteal ve santral BM fraksiyonlarında BM hücrelerini zenginleştirmek için gerekli adımları ve HSPC regülasyonunda yer alan iki anahtar niş hücre tipini, endotel hücrelerini ve mezenkimal kök hücreleri tanımlamak için uygun geçit stratejilerini detaylandırmaktadır. Burada önerilen fenotipik analiz, HSPC bölmesini ve nişini karakterize etmek için fare mutantları, hastalık modelleri ve fonksiyonel testlerle birleştirilebilir.

Introduction

Akım sitometrisi, immün ve hematopoetik hücreleri karakterize etmek ve prospektif olarak izole etmek için paha biçilmez bir yöntemdir. Ayrıca, farklı dokuların stromal ve epitel popülasyonlarını analiz etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Hematopoetik kök hücre (HSC) kendini yenileme ve multipotens gibi benzersiz özelliklere sahiptir. Yetişkin memelilerde, HSC’ler öncelikle çevredeki mikro çevreden veya niş1’den sessizlik ve hayatta kalma sinyalleri aldıkları kemik iliğinde (BM) bulunur. HSC’ler resmi olarak fonksiyonel tahlilleregöre tanımlanır 2. Bununla birlikte, birkaç dönüm noktası makalesi, HSC’leri tanımlamak için akış sitometrisinin yararlılığını göstermiştir. Sınırlı hücre yüzey belirteçlerinin kullanılmasıyla, HSC’lerde oldukça zenginleştirilmiş hematopoetik popülasyonları ayırt etmek mümkündür3. Bu nedenle akım sitometrisi, kök hücre alanında merkezi bir yöntemdir. Varsayımsal niş hücre tiplerinin ve niş faktörlerin HSC’ler üzerindeki etkisini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Akım sitometrisini görüntüleme ve fonksiyonel testlerle birleştirerek, HSC’lerin perivasküler mezenkimal kök hücreler (MSC’ler) ve endotel hücreleri (EC’ler) tarafından kritik olarak desteklendiği gösterilmiştir. BM MSC’ler heterojen bir gruptur ve farklı sitokin katkılarına sahiptir4, ancak leptin reseptörü (LepR) + MSC’lerin anahtar niş hücreler olduğu iyi bilinmektedir1. BM EC’leri ayrıca oldukça heterojendir ve sinüzoidlerin, arteriollerin ve tip H / geçiş damarlarının bir parçası olabilir5. Farklı çalışmalar, bu farklı EC’lerin nüanslı katkısını göstermiştir. Örneğin, endosteal sinüzoidal EC’ler sessiz HSC’ler6’ya mekansal olarak daha yakınken, daha düşük reaktif oksijen türlerine sahip göçmen olmayan HSC’ler arteriyolar ECs7’nin yakınında bulunur. Nişlerin endosteal ve merkezi konumu da çok önemlidir. Endosteal tip H damarları, yaşlanma ile birlikte kaybedilen perivasküler stromal hücrelerle ilişkilidir ve HSC’lerin kaybına yol açar8. Akut miyeloid lösemide santral EC’ler genişlerken, endosteal damarlar ve endosteal HSC’ler kaybolur9.

Alandaki çalışmaların çoğu, hematopoezin kendisine ve hücrenin HSC’lerin dışsal düzenlemesine odaklanmıştır. Bununla birlikte, diğer progenitörleri, yani multipotent progenitörleri (MPP’ler) düzenleyen nişlerin, özellikle de kararlı durumda hematopoezin ana itici güçleri oldukları göz önüne alındığında, daha iyi karakterize edilmesine ihtiyaç duyulduğu giderek daha fazla kabul edilmiştir10. Sabit bir hiyerarşik yapının aksine, son çalışmalar hematopoezin HSC’lerin erken evre11’de önyargılı MPP’lere farklılaştığı bir süreklilik olduğunu göstermiştir. MPP’ler farklı sınıflandırma şemalarından sonra adlandırılmıştır12, ancak Uluslararası Deneysel Hematoloji Derneği (ISEH) tarafından yakın zamanda yayınlanan bir fikir birliği makalesi, MPP’lerin erken MPP’ler olarak ve lenfoid (MPP-Ly), megakaryositik ve eritroid (MPP-Mk / E) ve miyeloid (MPP-G / M) önyargılarına göre ayrım yapılmasını önermiştir13. Akış sitometrisinin kullanımı, bu popülasyonların düzenlenmesinde BM nişlerinin önemini daha fazla incelemek için kritik öneme sahip olacaktır. Mevcut akış sitometri yöntemleri, HSPC’leri ayırt etmek ve tutarsız belirteçler kullanarak stromal hücreleri, yani EC’leri tanımlamak için değişken geçit stratejileri kullanır. Mevcut yöntemin amacı, HSPC alt popülasyonlarını, heterojen ECs gruplarını ve LepR + MSC’leri tanımlamak için BM boyamasının basit ve tekrarlanabilir bir iş akışını sunmaktır. Bu tekniğin, daha önce bildirilen yöntemlerle karşılaştırılabilir olmasına rağmen (örneğin, referans 14’e bakınız), iki fonksiyonel kemik iliği alanında, endosteal ve merkezi BM 8,15 ve BM stromal niş hücrelerindeki hematopoetik hücrelerin fenotipik analizi için güncellenmiş ve uygulanması kolay bir protokol sağladığına inanıyoruz.

Protocol

Bu protokolde kullanılan hayvanlar, i3S hayvan tesisinde belirli patojensiz koşullar altında 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsünde ve sıcaklık kontrollü bir ortamda barındırılmıştır. Standart kemirgen chow ve suya ücretsiz erişim sağlandı. Tüm hayvanlar, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilim Dernekleri Federasyonu tarafından belirtilen kriterlere göre insancıl bakım almıştır (AB Direktifi 2010/63/EU). Hayvanlar üzerinde yapılan…

Representative Results

Sağlıklı bir genç yetişkin C57Bl/6 farede HSC’lerin ve MPP’lerin akış sitometri analizinin temsili grafikleri Şekil 1’de gösterilmiştir. Geçit stratejisi, ISEH13 tarafından önerilen en son uyumlaştırıcı isimlendirmeyi takip eder. Enfeksiyon veya kanser gibi bir pertürbasyonun etkisini analiz ederken, normal kapılar için referans olarak bir kontrol faresi kullanmak önemlidir. Floresan eksi bir (FMO) kontrolleri, kapıların sınırlarını tanımla…

Discussion

Açıklanan protokol basit ve gerçekleştirilmesi kolay olsa da, belirli adımlara özel dikkat gösterilmelidir. Örneğin, yıkanmış BM elde ederken (adım 5.2), PBS% 2 FBS’yi kemiğin orta kısmının içinden geçirmek için belirtilen hacim veya sayı aşılmamalıdır, çünkü bu, yıkanmış numunenin endosteal hücre popülasyonları tarafından önemli ölçüde kontaminasyonuna neden olabilir.

Araştırmacı tarafından yürütülmesini kolaylaştırmak için protokolde değişik…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

LM, Lady Tata Memorial Trust’tan bir hibe ile desteklendi. JR, Fundação para a Ciência e Tecnologia’dan (FCT; FCT bursu UI/BD/150833/2021). ML, FCT’den bir doktora bursu (FCT bursu 2021.04773.BD) ile desteklenmiştir. DD, Amerikan Hematoloji Derneği, Pablove Vakfı, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522/2021) ve Portekiz Hematoloji Derneği’nden gelen hibelerle desteklendi. i3s’deki TRACY tesisinden Dr. Catarina Meireles ve Emilia Cardoso’nun desteğine teşekkür ederiz.

Materials

Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody BioLegend 116114
APC Streptavidin BioLegend 405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody BioLegend 105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody BioLegend 103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody BioLegend 100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody BioLegend 108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody BioLegend 101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody BioLegend 103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody BioLegend 115929
Calibrite 2 Color Beads BD Biosciences 349502
Collagenase IV Merck Life Science C1889
Dispase II Merck Life Science D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin ThermoFisher Scientific 10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D systems BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) ThermoFisher Scientific R37606 DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody ThermoFisher Scientific 12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135) ThermoFisher Scientific 12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody BioLegend 102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody BioLegend 103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody BioLegend 108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets Merck Life Science P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody BioLegend 101302
RBC lysis buffer 10x BioLegend 420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye BioLegend 423114 fluorescent dye

References

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).

Play Video

Cite This Article
Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L., Lopes, M., Duarte, D. Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells. J. Vis. Exp. (187), e64248, doi:10.3791/64248 (2022).

View Video