Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.
Kemik iliği (BM), yeni kan hücrelerinin üretildiği süreç olan hematopoezin öncelikle meydana geldiği kemiklerde bulunan yumuşak dokudur. Bu nedenle, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC’ler) ve HSPC’lerin bakımına ve düzenlenmesine katkıda bulunan destekleyici stromal hücreleri içerir. hematolojik ve diğer BM bozuklukları, hematopoetik hücreleri doğrudan ve / veya BM nişinin değiştirilmesi yoluyla etkileyerek hematopoezi bozar. Burada, murin BM HSPC’lerinin ve stromal niş popülasyonlarının akış sitometrisi ile fenotipik analizi yoluyla sağlık ve malignitede hematopoez incelemek için bir yöntem tanımlanmıştır. Yöntemimiz, endosteal ve santral BM fraksiyonlarında BM hücrelerini zenginleştirmek için gerekli adımları ve HSPC regülasyonunda yer alan iki anahtar niş hücre tipini, endotel hücrelerini ve mezenkimal kök hücreleri tanımlamak için uygun geçit stratejilerini detaylandırmaktadır. Burada önerilen fenotipik analiz, HSPC bölmesini ve nişini karakterize etmek için fare mutantları, hastalık modelleri ve fonksiyonel testlerle birleştirilebilir.
Akım sitometrisi, immün ve hematopoetik hücreleri karakterize etmek ve prospektif olarak izole etmek için paha biçilmez bir yöntemdir. Ayrıca, farklı dokuların stromal ve epitel popülasyonlarını analiz etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Hematopoetik kök hücre (HSC) kendini yenileme ve multipotens gibi benzersiz özelliklere sahiptir. Yetişkin memelilerde, HSC’ler öncelikle çevredeki mikro çevreden veya niş1’den sessizlik ve hayatta kalma sinyalleri aldıkları kemik iliğinde (BM) bulunur. HSC’ler resmi olarak fonksiyonel tahlilleregöre tanımlanır 2. Bununla birlikte, birkaç dönüm noktası makalesi, HSC’leri tanımlamak için akış sitometrisinin yararlılığını göstermiştir. Sınırlı hücre yüzey belirteçlerinin kullanılmasıyla, HSC’lerde oldukça zenginleştirilmiş hematopoetik popülasyonları ayırt etmek mümkündür3. Bu nedenle akım sitometrisi, kök hücre alanında merkezi bir yöntemdir. Varsayımsal niş hücre tiplerinin ve niş faktörlerin HSC’ler üzerindeki etkisini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Akım sitometrisini görüntüleme ve fonksiyonel testlerle birleştirerek, HSC’lerin perivasküler mezenkimal kök hücreler (MSC’ler) ve endotel hücreleri (EC’ler) tarafından kritik olarak desteklendiği gösterilmiştir. BM MSC’ler heterojen bir gruptur ve farklı sitokin katkılarına sahiptir4, ancak leptin reseptörü (LepR) + MSC’lerin anahtar niş hücreler olduğu iyi bilinmektedir1. BM EC’leri ayrıca oldukça heterojendir ve sinüzoidlerin, arteriollerin ve tip H / geçiş damarlarının bir parçası olabilir5. Farklı çalışmalar, bu farklı EC’lerin nüanslı katkısını göstermiştir. Örneğin, endosteal sinüzoidal EC’ler sessiz HSC’ler6’ya mekansal olarak daha yakınken, daha düşük reaktif oksijen türlerine sahip göçmen olmayan HSC’ler arteriyolar ECs7’nin yakınında bulunur. Nişlerin endosteal ve merkezi konumu da çok önemlidir. Endosteal tip H damarları, yaşlanma ile birlikte kaybedilen perivasküler stromal hücrelerle ilişkilidir ve HSC’lerin kaybına yol açar8. Akut miyeloid lösemide santral EC’ler genişlerken, endosteal damarlar ve endosteal HSC’ler kaybolur9.
Alandaki çalışmaların çoğu, hematopoezin kendisine ve hücrenin HSC’lerin dışsal düzenlemesine odaklanmıştır. Bununla birlikte, diğer progenitörleri, yani multipotent progenitörleri (MPP’ler) düzenleyen nişlerin, özellikle de kararlı durumda hematopoezin ana itici güçleri oldukları göz önüne alındığında, daha iyi karakterize edilmesine ihtiyaç duyulduğu giderek daha fazla kabul edilmiştir10. Sabit bir hiyerarşik yapının aksine, son çalışmalar hematopoezin HSC’lerin erken evre11’de önyargılı MPP’lere farklılaştığı bir süreklilik olduğunu göstermiştir. MPP’ler farklı sınıflandırma şemalarından sonra adlandırılmıştır12, ancak Uluslararası Deneysel Hematoloji Derneği (ISEH) tarafından yakın zamanda yayınlanan bir fikir birliği makalesi, MPP’lerin erken MPP’ler olarak ve lenfoid (MPP-Ly), megakaryositik ve eritroid (MPP-Mk / E) ve miyeloid (MPP-G / M) önyargılarına göre ayrım yapılmasını önermiştir13. Akış sitometrisinin kullanımı, bu popülasyonların düzenlenmesinde BM nişlerinin önemini daha fazla incelemek için kritik öneme sahip olacaktır. Mevcut akış sitometri yöntemleri, HSPC’leri ayırt etmek ve tutarsız belirteçler kullanarak stromal hücreleri, yani EC’leri tanımlamak için değişken geçit stratejileri kullanır. Mevcut yöntemin amacı, HSPC alt popülasyonlarını, heterojen ECs gruplarını ve LepR + MSC’leri tanımlamak için BM boyamasının basit ve tekrarlanabilir bir iş akışını sunmaktır. Bu tekniğin, daha önce bildirilen yöntemlerle karşılaştırılabilir olmasına rağmen (örneğin, referans 14’e bakınız), iki fonksiyonel kemik iliği alanında, endosteal ve merkezi BM 8,15 ve BM stromal niş hücrelerindeki hematopoetik hücrelerin fenotipik analizi için güncellenmiş ve uygulanması kolay bir protokol sağladığına inanıyoruz.
Açıklanan protokol basit ve gerçekleştirilmesi kolay olsa da, belirli adımlara özel dikkat gösterilmelidir. Örneğin, yıkanmış BM elde ederken (adım 5.2), PBS% 2 FBS’yi kemiğin orta kısmının içinden geçirmek için belirtilen hacim veya sayı aşılmamalıdır, çünkü bu, yıkanmış numunenin endosteal hücre popülasyonları tarafından önemli ölçüde kontaminasyonuna neden olabilir.
Araştırmacı tarafından yürütülmesini kolaylaştırmak için protokolde değişik…
The authors have nothing to disclose.
LM, Lady Tata Memorial Trust’tan bir hibe ile desteklendi. JR, Fundação para a Ciência e Tecnologia’dan (FCT; FCT bursu UI/BD/150833/2021). ML, FCT’den bir doktora bursu (FCT bursu 2021.04773.BD) ile desteklenmiştir. DD, Amerikan Hematoloji Derneği, Pablove Vakfı, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522/2021) ve Portekiz Hematoloji Derneği’nden gelen hibelerle desteklendi. i3s’deki TRACY tesisinden Dr. Catarina Meireles ve Emilia Cardoso’nun desteğine teşekkür ederiz.
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |