Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Flödescytometrianalys av murin, benmärg, hematopoetiska stam- och stamceller och stromala nischceller

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64248
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

Summary

Här beskriver vi ett enkelt protokoll för isolering och färgning av murina benmärgsceller till fenotyp hemopoietiska stam- och stamceller tillsammans med de stödjande nischendotel- och mesenkymala stamcellerna. En metod för att berika celler belägna i endostala och centrala benmärgsområden ingår också.

Abstract

Benmärgen (BM) är den mjukvävnad som finns i ben där hematopoies, processen genom vilken nya blodkroppar genereras, främst förekommer. Som sådan innehåller den hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC), samt stödjande stromaceller som bidrar till underhåll och reglering av HSPC. Hematologiska och andra BM-störningar stör hematopoies genom att påverka hematopoetiska celler direkt och / eller genom förändring av BM-nischen. Här beskriver vi en metod för att studera hematopoes vid hälsa och malignitet genom fenotypisk analys av murina BM HSPC och stromala nischpopulationer genom flödescytometri. Vår metod beskriver de nödvändiga stegen för att berika BM-celler i endostala och centrala BM-fraktioner, samt lämpliga grindstrategier för att identifiera de två viktiga nischcelltyperna som är involverade i HSPC-reglering, endotelceller och mesenkymala stamceller. Den fenotypiska analysen som föreslås här kan kombineras med musmutanter, sjukdomsmodeller och funktionella analyser för att karakterisera HSPC-facket och dess nisch.

Introduction

Flödescytometri är en ovärderlig metod för att karakterisera och prospektivt isolera immun- och hematopoetiska celler. Det används också alltmer för att analysera stromala och epiteliala populationer av olika vävnader. Den hematopoetiska stamcellen (HSC) har unika egenskaper för självförnyelse och multipotens. Hos vuxna däggdjur finns HSC främst i benmärgen (BM), där de får signaler om vilande och överlevnad från den omgivande mikromiljön eller nisch1. HSC definieras formellt enligt funktionella analyser2. Ändå har flera landmärkeartiklar visat användbarheten av flödescytometri för att identifiera HSC. Genom användning av begränsade cellytmarkörer är det möjligt att diskriminera hematopoetiska populationer som är höganrikade i HSCs3. Flödescytometri är därför en central metod inom stamcellsfältet. Det har använts i stor utsträckning för att utvärdera effekterna av förmodade nischcelltyper och nischfaktorer på HSC. Genom att kombinera flödescytometri med avbildning och funktionella analyser har det visats att HSC stöds kritiskt av perivaskulära mesenkymala stamceller (MSC) och endotelceller (EC). BM MSC är en heterogen grupp och har olika cytokinbidrag4, men det är väl etablerat att leptinreceptor (LepR) + MSC är viktiga nischceller1. BM ECs är också mycket heterogena och kan vara en del av sinusoider, arterioler och typ H / övergångskärl5. Olika studier har visat det nyanserade bidraget från dessa olika EC. Till exempel är endosteal sinusformade ECs rumsligt närmare vilande HSCs6, medan icke-migrerande HSC med lägre nivåer av reaktiva syrearter ligger nära arteriolära ECs7. Den endosteala kontra centrala placeringen av nischer är också mycket viktig. Endosteala typ H-kärl är associerade med perivaskulära stromaceller som förloras med åldrande, vilket leder till förlust av HSC8. Vid akut myeloisk leukemi expanderas centrala EC, medan endostala kärl och endostala HSC förloras9.

De flesta studier inom området har fokuserat på själva hematopoesen och på cellens yttre reglering av HSC. Det har dock blivit alltmer erkänt att det finns ett behov av att bättre karakterisera de nischer som reglerar andra förfäder, nämligen multipotenta förfäder (MPP), särskilt med tanke på att de är de främsta drivkrafterna för hematopoies i steady state10. I motsats till en fast hierarkisk struktur har nyligen genomförda studier visat att hematopoies är ett kontinuum där HSC differentieras till partiska MPP i ett tidigt skede11. MPP har namngivits efter olika klassificeringssystem12, men ett nyligen konsensusdokument från International Society for Experimental Hematology (ISEH) föreslog att MPP skulle diskrimineras som tidiga MPP och enligt deras lymfoid (MPP-Ly), megakaryocytisk och erytroid (MPP-Mk / E) och myeloisk (MPP-G / M) bias13. Användningen av flödescytometri kommer att vara avgörande för att ytterligare studera betydelsen av BM-nischer i regleringen av dessa populationer. Nuvarande flödescytometrimetoder använder variabla grindstrategier för att differentiera HSPC och identifiera stromaceller, nämligen EC, med hjälp av inkonsekventa markörer. Målet med den nuvarande metoden är att presentera ett enkelt och reproducerbart arbetsflöde för BM-färgning för att identifiera HSPC-subpopulationer, heterogena grupper av ECs och LepR+ MSC. Vi tror att denna teknik, även om den är jämförbar med tidigare rapporterade metoder (se till exempel referens 14), ger ett uppdaterat och lättimplementerat protokoll för fenotypisk analys av hematopoetiska celler i de två funktionella märgområdena, endosteala och centrala BM 8,15, samt BM stromala nischceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djuren som användes i detta protokoll hölls på i3S djuranläggning under specifika patogenfria förhållanden i en 12 timmars ljus-mörk cykel och temperaturkontrollerad miljö. Fri tillgång till standard gnagare chow och vatten tillhandahölls. Alla djuren fick human vård enligt de kriterier som fastställts av Federation of European Laboratory Animal Science Associations för vård och hantering av försöksdjur (EU-direktiv 2010/63/EU). Det försöksförfarande som utfördes på djuren (avlivning) godkändes av i3S djurförsöksetiska kommitté (ref. DD_2019_15) och Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Detaljer om de material som används i hela detta protokoll finns i materialförteckningen.

1. Beredning av lösningar och färgning av cocktails

  1. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS): Lös fem PBS-tabletter i 1 liter destillerat vatten. Förvaras i rumstemperatur (RT).
  2. PBS 2% fetalt bovint serum (FBS): Tillsätt 10 ml FBS till 500 ml PBS. Förvaras vid 4 °C.
  3. Lysbuffert för röda blodkroppar (RBC) (1x): Tillsätt 50 ml 10x RBC-lysbuffert till 450 ml avjoniserat vatten. Förvaras vid 4 °C.
  4. Kollagenas IV och dispase II-lösning: Lös 30 mg kollagenas IV och 60 mg dispase II i 30 ml HBSS för en 1 mg/ml kollagenas IV och 2 mg/ml dispase II-lösning. Förbered färskt före användning.
  5. Lösning som blockerar Fc-receptorer: Tillsätt 10 μL renad CD16/32-antikropp mot mus till 490 μL PBS 2% FBS. Förbered färskt eller föregående dag. Förvaras vid 4 °C fram till användning.
  6. Färgningslösning för fluorescerande cellviabilitet: Tillsätt 2 μL fluorescerande cellviabilitetsfärgämne till 1 ml PBS. Förbered färskt före användning.
  7. Biotin härstamningscocktail: Blanda 100 μL av var och en av följande antikroppar: biotin anti-mus CD3ε, biotin anti-mus CD4, biotin anti-mus CD8a, biotin anti-mus / human CD11b, biotin anti-mus / human CD45R / B220, biotin anti-mus Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) och biotin anti-mus TER-119 / erytroida celler. Förvaras vid 4 °C fram till användning.
  8. HSCs primära färgningscocktail: Tillsätt 10 μL biotin härstamningscocktail, 10 μL immunofluorescerande märkt 510 anti-mus CD150 (SLAM), 10 μL phycoerytrin (PE) anti-mus Flk2 (CD135), 10 μL peridinin-klorofyll-protein (PerCP) anti-mus Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL PE/Cyanine7 anti-mus CD48 och 10 μL allophycocyanin (APC)/Cyanine7 anti-mus CD117 (c-kit) till 940 μL PBS 2% FBS. Förbered färskt eller föregående dag. Förvaras vid 4 °C skyddad från ljus fram till användning.
  9. Stromal primärfärgningscocktail: Tillsätt 5 μL musleptin R-biotinylerad antikropp, 6,7 μL PE-antimusendomucinantikropp, 10 μL PerCP-antimus Ly-6A/E (Sca-1), 4 μL PE/Cyanine7-antimus CD31, 10 μL APC/Cyanine7-antimus CD45 och 10 μL APC/Cyanine7-antimus-TER-119/erytroidceller till 954 μL PBS 2% FBS. Förbered färskt eller föregående dag. Förvaras vid 4 °C skyddad från ljus fram till användning.
  10. HSC/stromal sekundärfärgningslösning: Tillsätt 1 μL APC streptavidin till 1 ml PBS 2% FBS. Förbered färskt eller föregående dag. Förvaras vid 4 °C skyddad från ljus fram till användning.
  11. ECs färgningscocktail: Tillsätt 10 μL PE-anti-mus endomucinantikropp, 10 μL PerCP-antimus Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL PE/Cyanine7 anti-mus CD31, 10 μL Alexa Fluor 647 anti-mus CD54/ICAM-1, 10 μL APC/Cyanine7 anti-mus CD45 och 10 μL APC/Cyanine7 anti-mus TER-119/erytroidceller till 940 μL PBS 2% FBS. Förbered färskt eller föregående dag. Förvaras vid 4 °C skyddad från ljus fram till användning.
  12. DAPI-färgningslösning: Tillsätt 1 droppe DAPI-reagens till 500 μL PBS. Förbered färskt före användning.

2. Extraktion av prov

  1. Avliva djuret genom cervikal dislokation (närmare uppgifter om de djur som använts för att ta fram de data som presenteras i denna studie finns i kompletterande tabell 1). Placera djuret med magen upp på en petriskål och spraya med 70% etanol. Gör ett snitt ovanför buken med sax och dra bort huden hela vägen till anklarna.
  2. Ta tag i ett ben och skär med sax i botten (där fogen mellan benet och höften är) för att skilja det från djuret. Detta steg kommer också att fungera som en sekundär bekräftande metod för eutanasi. Ta bort foten från benet genom att klippa vid fotleden. Placera benet i iskallt PBS 2% FBS. Om det behövs, upprepa steget med det andra benet.
  3. Ta tag i höftbenet och klipp med sax bakom det för att skilja det från djuret. Placera höftbenet i iskall PBS 2% FBS. Om det behövs, upprepa steget med det andra höftbenet.
  4. Placera benen och höftbenen i en petriskål och rengör benen med en steril skalpell. Separera skenbenet och lårbenet genom att skära i knäet med skalpellen. Placera de rena benen i iskall PBS 2% FBS.

3. Provbearbetning för analys av hematopoetiska cellpopulationer i total benmärg

  1. Placera ett lårben eller skenben i en murbruk med iskall PBS 2% FBS och krossa benet genom att försiktigt trycka det mot murbrukets vägg med mortelstöten. BM-celler släpps ut i lösningen i morteln.
  2. Pipettera den resulterande cellsuspensionen upp och ner med en 10 ml pipett för att homogenisera och överföra till ett 50 ml rör genom en 40 μm cellsil placerad ovanpå röret.
  3. Om de krossade benen inte ser vita ut vid denna punkt, tillsätt mer PBS 2% FBS till murbruk och upprepa krossningen och pipettera sedan upp och ner och överför lösningen till samma 50 ml rör genom samma 40 μm cellsil.
  4. Skölj morteln med lite mer PBS 2% FBS och överför lösningen till samma 50 ml rör genom samma 40 μm cellsil. Centrifugera 50 ml röret vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
  5. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 5 ml RBC-lysbuffert (1x) vid RT genom att pipettera upp och ner flera gånger. Efter en 2 minuters inkubation vid RT, tillsätt 15 ml PBS 2% FBS.
  6. Centrifugera 50 ml röret vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Om cellpelleten fortfarande ser rödaktig ut, gå tillbaka till steg 3.5. Om inte, kassera supernatanten, suspendera pelleten igen i 200 μL PBS och överför cellsuspensionen till en brunn på en 96-brunns V-bottenplatta för färgning.
  7. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 min vid 4 °C. Kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper och suspendera pelleten igen i 200 μL fluorescerande färgfärgningslösning. Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  8. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 min vid 4 °C. Kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper och återsuspendera pelleten i 200 μL PBS 2% FBS för att tvätta.
  9. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper och återsuspendera pelleten i 100 μl lösning som blockerar Fc-receptorer. Inkubera plattan i 10 minuter vid 4 °C skyddad från ljus.
  10. Tillsätt 100 μL PBS 2% FBS och pipettera upp och ner några gånger för att tvätta. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper och återsuspendera pelleten i 100 μL HSCs primära färgningscocktail. Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  11. Tillsätt 100 μL PBS 2% FBS och pipettera upp och ner några gånger för att tvätta. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper och återsuspendera pelleten i 100 μL HSCs sekundära färgningslösning. Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  12. Tillsätt 100 μL PBS 2% FBS och pipettera upp och ner några gånger för att tvätta. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper.
  13. Återsuspendera pelleten i 250 μL PBS 2% FBS och överför cellsuspensionen till ett 5 ml polystyren rundbottenrör genom en 40 μm cellsil. Håll på is skyddad från ljus tills flödescytometrianalys.
    OBS: Om du är intresserad av att bestämma det absoluta antalet hematopoetiska cellpopulationer, tillsätt Calibrite Beads till polystyrenrören före analys i cytometer16.

4. Provbearbetning för analys av stromacellspopulationer i total benmärg

  1. Placera ett lårben eller skenben i en murbruk med iskall PBS 2% FBS och krossa benet genom att försiktigt trycka det mot murbrukets vägg med mortelstöten. Klipp spetsen på en P1000-spets med sax och använd den för att överföra allt innehåll i murbruk till ett 50 ml rör (passera inte genom en cellsil).
  2. Centrifugera 50 ml röret vid 500 x g i 5 min vid 4 °C, kassera supernatanten och suspendera pelleten igen i 3 ml kollagenas IV och dispase II-lösning. Inkubera röret vid 37 °C i 40 minuter.
  3. Fyll på röret till 25 ml med PBS, 2%, FBS och virvel för att blanda. Överför innehållet i 50 ml röret till ett nytt 50 ml rör genom en 100 μm cellsil. Tillsätt 15 ml PBS 2% FBS till det gamla 50 ml röret och överför lösningen till samma nya 50 ml rör genom samma cellsil. Centrifugera vid 500 x g i 5 min vid 4 °C.
  4. Kassera supernatanten och suspendera cellpelleten igen i 5 ml RBC-lysbuffert (1x) vid RT genom att pipettera upp och ner flera gånger. Efter en 2 minuters inkubation vid RT, tillsätt 15 ml PBS 2% FBS.
  5. Centrifugera 50 ml röret vid 500 x g i 5 min vid 4 °C. Om cellpelleten fortfarande ser rödaktig ut, gå tillbaka till steg 4.4. Om inte, kassera supernatanten, återsuspendera pelleten i 200 μL PBS 2% FBS och överför cellsuspensionen till en brunn på en 96-brunns V-bottenplatta för färgning. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 min vid 4 °C.
  6. Om du utför stromal färgning, fortsätt till steg 4.7. Om du utför EG-färgning, fortsätt till steg 4.12.
  7. Kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper och återsuspendera pelleten i 100 μL stromal primärfärgningscocktail. Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  8. Tillsätt 100 μL PBS 2% FBS och pipettera upp och ner några gånger för att tvätta. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 minuter vid 4 °C, kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper och återsuspendera pelleten i 100 μl sekundärfärgningslösning av stroma. Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  9. Tillsätt 100 μL PBS 2% FBS och pipettera upp och ner några gånger för att tvätta. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 min vid 4 °C. Kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper.
  10. Återsuspendera pelleten i 250 μL PBS 2% FBS och överför cellsuspensionen till ett 5 ml polystyren rundbottenrör genom en 40 μm cellsil. Håll på is skyddad mot ljus.
  11. Strax innan du går till cytometern, tillsätt 35 μL DAPI-färgningslösning till röret som innehåller cellsuspensionen för flödescytometrianalys och inkubera röret vid RT i 5 minuter i mörkret. Efter denna inkubation, håll på is skyddad från ljus tills flödescytometrianalys.
  12. Kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper och återsuspendera pelleten i 100 μL ECs färgningscocktail. Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  13. Tillsätt 100 μL PBS 2% FBS och pipettera upp och ner några gånger för att tvätta. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 min vid 4 °C.
  14. Kassera supernatanten genom att vända plattan på absorberande papper. Återsuspendera pelleten i 250 μL PBS 2% FBS och överför cellsuspensionen till ett 5 ml polystyren rundbottenrör genom en 40 μm cellsil. Håll på is skyddad mot ljus.
  15. Strax innan du går till cytometern, tillsätt 35 μL DAPI-färgningslösning till röret som innehåller cellsuspensionen för flödescytometrianalys och inkubera röret vid RT i 5 minuter i mörkret. Efter denna inkubation, håll på is skyddad från ljus tills flödescytometrianalys.
    OBS: Om du är intresserad av att bestämma det absoluta antalet stroma- och endotelcellspopulationer, tillsätt Calibrite Beads till polystyrenrören före analys i cytometer16.

5. Provbearbetning för analys av hematopoetiska cellpopulationer i krossad och spolad BM

  1. Lägg ett lårben på en petriskål och skär ändarna på benet med en steril skalpell.
  2. Spola den centrala delen av benet (diafys) genom att passera 100 μL PBS 2% FBS genom insidan av benet en gång från varje sida med en 0,5 ml insulinspruta utan död volym och samla lösningen i ett mikrocentrifugrör innehållande 1 ml PBS 2% FBS. Därefter överför cellsuspensionen till ett 50 ml rör märkt som spolad BM innehållande 4 ml PBS 2% FBS. Håll på is.
  3. Placera benets ändar i en murbruk med iskall PBS 2% FBS och krossa genom att försiktigt trycka den mot murbrukväggen med mortelstöten. Pipettera den resulterande cellsuspensionen upp och ner med en 10 ml pipett för att homogenisera och överföra till ett 50 ml rör märkt som krossad BM genom en 40 μm cellsil.
  4. Om det krossade benet inte ser vitt ut vid denna tidpunkt, tillsätt mer PBS 2% FBS till murbruk och upprepa krossningen. Pipettera sedan upp och ner och överför lösningen till samma 50 ml rör (krossad BM) genom samma 40 μm cellsil.
  5. Skölj morteln med lite mer PBS 2% FBS och överför lösningen till samma 50 ml rör (krossad BM) genom samma 40 μm cellsil.
  6. Centrifugera de 50 ml rör som motsvarar de spolade och krossade proverna vid 500 x g i 3 min vid 4 °C.
  7. Följ steg 3.5 till 3.13 (avsnitt 3) med de spolade och krossade BM-proverna.

6. Beredning av enfärgade kontroller (SCC) för flödescytometrianalys

  1. Följ steg 3.1 till 3.6 (avsnitt 3) med ett extra ben från ett av de djur som inte använts för huvudanalysen och överför den slutliga cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör innehållande 1 ml PBS 2% FBS istället för en brunn på en 96-brunns V-bottenplatta.
  2. Överför 100 μL av cellsuspensionen till 8 brunnar på en 96-brunns V-bottenplatta, 100 μL till ett 5 ml polystyren rundbottenrör innehållande 100 μL PBS 2% FBS märkt som DAPI SCC och den återstående cellsuspensionen till ett 5 ml polystyren rundbottenrör innehållande 100 μL PBS 2% FBS märkt som ofärgad. Håll rören på is skyddade från ljus.
  3. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 minuter vid 4 °C och kassera supernatanterna genom att vända plattan på absorberande papper.
  4. Resuspendera en pellet i 100 μL fluorescerande färgfärgningslösning och de återstående i 100 μL PBS 2% FBS.
  5. Tillsätt 0,5 μL av följande antikroppar, förutom härstamningscocktailen av antikroppar för vilka 2 μL och PECy7 CD31-antikroppen för vilken 0,3 μL tillsätts, till var och en av brunnarna med cellsuspension i PBS 2% FBS (en antikropp per brunn, samma antikroppar som används i huvudanalyspanelerna eller samma fluoroforantikroppar med liknande fluorescensintensitet och epitopmängd): biotin härstamningscocktail, immunofluorescerande märkt 510 anti-mus CD150 (SLAM), PE anti-mus Flk2 (CD135), PerCP anti-mus Ly-6A / E (SCA-1), immunofluorescerande märkt 647 anti-mus CD54 / ICAM-1, PE / Cyanine7 anti-mus CD48 och APC / Cyanine7 anti-mus CD117 (c-kit). Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  6. Tillsätt 100 μL PBS 2% FBS till varje brunn och pipettera upp och ner några gånger för att tvätta. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 minuter vid 4 °C och kassera supernatanterna genom att vända plattan på absorberande papper.
  7. Återsuspendera alla pellets utom den som motsvarar cellerna som inkuberats med härstamningscocktailen av antikroppar i 180 μL PBS 2% FBS och överför cellsuspensionerna till 5 ml polystyren rundbottenrör genom 40 μm cellsilar. Håll på is skyddad från ljus tills flödescytometrianalys.
  8. Resuspendera cellerna som inkuberats med härstamningscocktailen av antikroppar i 100 μl HSC/stromal sekundärfärgningslösning. Inkubera plattan i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
  9. Tillsätt 100 μL PBS 2% FBS och pipettera upp och ner några gånger för att tvätta. Centrifugera plattan vid 500 x g i 3 min vid 4 °C.
  10. Återsuspendera pelleten i 180 μL PBS 2% FBS och överför cellsuspensionen till ett 5 ml polystyren rundbottenrör genom en 40 μm cellsil. Håll på is skyddad från ljus tills flödescytometrianalys.
  11. Strax innan du går till cytometern, tillsätt 35 μL DAPI-färgningslösning till DAPI SCC-röret och inkubera röret vid RT i 5 minuter i mörkret. Efter denna inkubation, håll på is skyddad från ljus tills flödescytometrianalys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representativa diagram för flödescytometrianalys av HSC och MPP hos en frisk ung vuxen C57Bl/6-mus visas i figur 1. Grindstrategin följer den senaste harmoniseringsnomenklaturen som föreslagits av ISEH13. När man analyserar effekterna av en störning, såsom infektion eller cancer, är det viktigt att använda en kontrollmus som referens för normala grindar. FMO-kontroller (fluorescens-minus-en) kan vara särskilt användbara för att avgränsa grindarnas gränser, men det bör noteras att blind inställning av grindgränser baserade på FMO kan utelämna målceller eller inkludera icke-målceller. Till exempel, ju lägre intensiteten hos CD48-uppsättningen, desto högre anrikning för vilande långsiktiga HSC17. Dessutom är olika egenskaper hos vissa populationer beroende av intensiteten hos specifika markörer. Till exempel är HSC som uttrycker högre CD150-nivåer mer myeloid-förspända18.

De frekvenser och absoluta tal som erhållits vid analys av hematopoetiska cellpopulationer tillämpade på totalt fyra djur presenteras i tabell 1.

Figur 2 visar representativa diagram för flödescytometrianalys av ECs och MSC. Majoriteten av hematopoetiska celler exkluderas efter ett Ter119/CD45-negativt urval. LepR+ MSC kan sedan lätt identifieras, medan sanna ECs kräver ett efterföljande urval av Sca-1+ celler. Medan Sca-1 ofta används i immunofluorescensstudier för att specifikt markera arterioler, är detta inte fallet i flödescytometri, eftersom denna teknik är mycket känslig och ECs uttrycker alltid en viss (även om låg) grad av Sca-1 vid cellytan. Genom att inte bara välja Sca-1 + -celler skulle andra icke-endotelceller inkluderas i analysen, såsom CD31-uttryckande myeloida celler, vilket kan påverka kvantifieringen av ECs i BM. ECs kan analyseras som en hel population eller baserat på specifika markörer som delvis avslöjar deras heterogenitet. Endomucin i kombination med CD31 är mycket användbart för att identifiera det funktionellt distinkta typ H-endotelet15 (figur 2). Vidare har det tidigare visats att ICAM-1-uttryck möjliggör diskriminering mellan arteriolära (aBMEC) och sinusformade ECs (sBMEC) (figur 3)20.

De frekvenser och absoluta tal som erhållits vid analysen av MSC och endotelcellpopulationer tillämpade på totalt fyra djur presenteras i tabell 2 och tabell 3.

Även om BM-funktionella områden inte är tydligt avgränsade i uppenbara histologiska regioner, är det väl etablerat att benfodrade endostala områden och centrala BM-områden är anrikade i vissa celltyper och händelser (t.ex. frisättning av blodplättar / pro-trombocyter från megakaryocyter i sinusoiderna i centrala BM-områden). Det är därför användbart att berika för celltyper i centrala och endostala områden för att separat analysera dessa två fack. Vi tillämpade en metod för att spola diafysen för att anrika för centrala celltyper och krossa metafysen för att anrika för endostala celltyper (figur 4A). Kvantifieringen av aBMEC och sBMEC i spolad (central) och krossad (endosteal) BM-vävnad (figur 4B) validerar tillämpligheten av denna mekaniska isoleringsmetod, eftersom aBMEC är notoriskt rikligare i endosteala regioner och sinusoider är vanligare i centrala BM-områden.

Figure 1
Figur 1: Analys av hematopoetiska cellpopulationer. Representativa diagram som visar grindstrategin för flödescytometrianalys av hematopoetiska cellpopulationer i total BM med hjälp av den medföljande programvaran. Förkortningar: FSC-H = forward scatter - höjd, FSC-A = forward scatter - area, Lin = härstamning, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit+ hematopoetiska stamceller, MPP Ly = multipotenta stamceller - lymfoid, MPPG/M = multipotenta stamfäder - granulocyt/makrofag, MPPMk/E = multipotenta stamceller - megakaryocyt/erytrocyt, MPP = multipotenta stamceller, HSC = hematopoetiska stamceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Analys av stromacellspopulationer. Representativa diagram som visar grindstrategin för flödescytometrianalys av stromaceller i total BM med hjälp av den medföljande programvaran. Förkortningar: FSC-H = framåtspridning - höjd, FSC-A = framåtspridning - area, MSC = mesenkymala stamceller, LepR = leptinreceptor, ECs = endotelceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Analys av endotelceller. Representativa diagram som visar grindstrategin för flödescytometrianalys av ECs totalt BM med hjälp av den medföljande programvaran. Förkortningar: FSC-H = framåtspridning - höjd, FSC-A = framåtspridning - area, ECs = endotelceller, aBMECs = arteriella benmärgs endotelceller, sBMECs = sinusformade benmärgs endotelceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Analys av EG-populationer i centrala och endostala områden . (A) Representation av de olika delarna av ett murint långt ben. (B) Diagram som visar de statistiskt signifikanta skillnaderna i frekvenserna av CD31+ endotelceller i aBMEC (anrikade i det krossade provet) och sBMEC (anrikade i det spolade provet). Varje punkt representerar en mus (n = 9) och prover paras ihop. Det statistiska testet som användes var det parade T-testet. betecknar tvåsidigt P-värde < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Cellpopulation Medelvärde av frekv. av BM levande celler ± SD (n = 4) totalt BM Medelvärde av cellantal ± SD (n = 4) per lårben totalt BM Medelvärde av frekv. av BM levande celler ± SD (n = 4) i endosteal BM Medelvärde av frekv. av BM levande celler ± SD (n = 4) i centrala BM
Lin- 3.05 ± 0.13 337610 ± 59414 3.56 ± 0.21 3.53 ± 0.19
LKS 0,096 ± 0,026 10206 ± 1794 0,102 ± 0,025 0,133 ± 0,022
Parlamentsledamöter 0,058 ± 0,011 6141 ± 716 0,058 ± 0,011 0,085 ± 0,007
MPPG/M 0,011 ± 0,004 1233 ± 326 0,013 ± 0,003 0,014 ± 0,003
MPPMk/E 0,0010 ± 0,0002 113 ± 21 0,0014 ± 0,0004 0,0012 ± 0,0005
MPP 0,0092 ± 0,0045 940 ± 374 0,0105 ± 0,0048 0,0118 ± 0,0061
HSC 0,0054 ± 0,0023 572 ± 191 0,0055 ± 0,0023 0,0059 ± 0,0016

Tabell 1: Kvantitativa data för hematopoetiska cellpopulationer. Medelvärde av frekvensen i BM-levande celler i de olika hematopoetiska cellpopulationerna analyserade totalt, endosteal och central BM och celltal per lårben totalt BM. Data visas som medelvärde ± standardavvikelse (SD), n = 4.

Cellpopulation Medelvärde av frekv. av BM levande celler ± SD (n = 4) Medelvärde av cellantal ± SD (n = 4) per skenben
Ecs 0,080 ± 0,011 4523 ± 1521
Typ H EG 0,041 ± 0,006 2299 ± 752
Typ L EG 0,038 ± 0,005 2103 ± 736
MSC 0,180 ± 0,048 10270 ± 4282

Tabell 2: Kvantitativa data för stromacellspopulationer. Medelvärde av frekvensen i BM levande celler och cellantal per tibia för de olika stromacellspopulationer som analyserats i total BM. Data visas som medelvärde ± standardavvikelse (SD), n = 4.

Cellpopulation Medelvärde av frekv. av BM levande celler ± SD (n = 4) Medelvärde av cellantal ± SD (n = 4) per skenben
Ecs 0,064 ± 0,006 2255 ± 150
aBMEC 0,041 ± 0,010 1419 ± 286
sBMEC 0,023 ± 0,006 819 ± 250

Tabell 3: Kvantitativa data för endotelcellspopulationer. Medelvärde av frekvensen i BM levande celler och cellantal per tibia för de olika endotelcellpopulationerna analyserade i total BM. Data visas som medelvärde ± standardavvikelse (SD), n = 4.

Kompletterande tabell 1: Uppgifter om de djur som använts i studien. Stam, kön, ålder och vikt hos de djur som använts för att ta fram de data som visas i figur 1, figur 2 och figur 3 och tabell 1, tabell 2 och tabell 3. Förkortning: g = gram. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Medan det beskrivna protokollet är enkelt och lätt att utföra, bör särskild uppmärksamhet ägnas åt specifika steg. Till exempel, när man erhåller spolad BM (steg 5.2), bör volymen eller antalet gånger som anges för att passera PBS 2% FBS genom insidan av den centrala delen av benet inte överskridas, eftersom detta kan resultera i signifikant kontaminering av det spolade provet av endosteala cellpopulationer.

Ändringar i protokollet kan göras för att underlätta dess genomförande av utredaren. Vid provextraktion (avsnitt 2) kan ben och/eller ben förvaras i PBS 2% FBS vid 4 °C i upp till 24 timmar innan de fortsätter till provbearbetning och analys. Denna tid bör dock minimeras när det är möjligt. Under inkubation med HSCs primära färgningscocktail (steg 3.10) och sekundära färgningscocktail (steg 3.11), medan en 15 minuters inkubation vid rumstemperatur indikeras, kan detta bytas ut mot en 30 minuters inkubation vid 4 °C.

Detsamma gäller inkubation med stromal primärfärgningscocktail (steg 4.7), sekundärfärgningslösning av stromal (steg 4.8), EC-färgningscocktail (steg 4.12) och inkubation med antikroppar mot SCC (steg 6.5). medan en 15 minuters inkubation vid rumstemperatur indikeras, kan denna bytas ut mot en 30 minuters inkubation vid 4 °C.

Ett annat protokoll för BM-isolering genom centrifugering av murina långa ben beskrevs nyligen21. Även om detta protokoll ger fördelen med snabbare isolering av BM-cellerna, möjliggör protokollet som beskrivs här analys av cellpopulationer som bor i olika delar av benen.

En särskild begränsning med den nuvarande metoden är att den enbart bygger på fenotypisk analys med flödescytometri. Detta är särskilt relevant när det gäller HSC, som skulle kräva ytterligare funktionell validering. Denna metod kan dock kombineras med sortering av anrikade populationer och studier av dessa celler i långtidsrekonstitueringsanalyser och in vitro-kolonianalyser .

När det gäller stromacellsanalys, särskilt MSC och EC, har det tidigare visats att, trots optimeringen av BM-bearbetning för flödescytometrianalys, ett betydande antal celler inte isoleras från vävnaden och det finns en suboptimal kvantifiering av dessa celler jämfört med andra metoder såsom helmonterad avbildning19. Ändå är flödescytometri extremt användbar för att utföra kvantitativ och kvalitativ analys av BM ECs och MSC och att prospektivt isolera dem för funktionella och expressionsanalyser.

En annan begränsning av den nuvarande metoden är användningen av en mekanisk teknik för att separera de endostala och centrala fraktionerna, som till viss del oundvikligen förorenas av celler från det andra facket. Kvantifieringen av aBMEC och sBMEC som förklaras i avsnittet med representativa resultat visar dock att den mekaniska isoleringen är en robust metod för att berika för cellpopulationer i dessa områden.

Den beskrivna metoden möjliggör studier av hematopoies i olika inställningar och stromala nischer av HSPC. Den fenotypiska analysen som presenteras här kan vara användbar för att studera HSPC-nischer i kombination med specifika musmutanter, nämligen EC- och MSC Cre-linjer som möjliggör selektiv manipulation av genuttryck i dessa populationer. Till exempel kan linjerna Cdh5(PAC)-CreERT22och LepR-Cre23 användas för att inducera uttrycket av vissa gener selektivt i EC respektive MSC. Metoden är användbar för att studera deras inverkan på stromakompartmentet såväl som på HSPC. Tillgängliga Cre-linjer för att studera den vaskulära BM-nischen har nyligen granskats i Mosteo et al.5. Den prospektiva studien av LT-HSC utan transplantation har begränsats av bristen på robusta rapportlinjer. Den nyligen beskrivna Mds1GFP/+Flt3 Cre 6 har dock visat sig uppnå hög anrikning av LT-HSC och god diskriminering från förfäder nedströms som uttrycker Flt324. Kombinationen av denna muslinje och andra hematopoetiska stammar, såsom Vav-iCre25, med flödescytometri möjliggör studier av HSPC och deras förhållande till nischen. Hematologiska maligniteter är ofta förknippade med störningen av hematopoies från de tidigaste stadierna, vilket återspeglas i förändringen av frekvenserna av hematopoetiska stam- och stamceller och stromapopulationer9 som vi här har presenterat för friska C57Bl/6. Framtida studier bör undersöka tillämpningen av liknande metoder som den som här beskrivs med hjälp av ny utrustning baserad på spektralflödescytometri som möjliggör en mer omfattande fenotypisk karakterisering genom analys av fler markörer (över 30 samtidigt).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

LM stöddes av ett bidrag från Lady Tata Memorial Trust. JR stöddes av ett doktorandstipendium från Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; FCT-stipendium UI/BD/150833/2021). ML stöddes av ett doktorandstipendium från FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD stöddes av bidrag från American Society of Hematology, Pablove Foundation, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) och Portuguese Society of Hematology. Vi tackar stödet från Dr. Catarina Meireles och Emilia Cardoso från TRACY facility på i3s.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody BioLegend 116114
APC Streptavidin BioLegend 405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody BioLegend 105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody BioLegend 103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody BioLegend 100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody BioLegend 108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody BioLegend 101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody BioLegend 103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody BioLegend 115929
Calibrite 2 Color Beads BD Biosciences 349502
Collagenase IV Merck Life Science C1889
Dispase II Merck Life Science D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin ThermoFisher Scientific 10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D systems BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) ThermoFisher Scientific R37606 DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody ThermoFisher Scientific 12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135) ThermoFisher Scientific 12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody BioLegend 102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody BioLegend 103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody BioLegend 108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets Merck Life Science P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody BioLegend 101302
RBC lysis buffer 10x BioLegend 420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye BioLegend 423114 fluorescent dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).

Tags

Indragning utgåva 187
Flödescytometrianalys av murin, benmärg, hematopoetiska stam- och stamceller och stromala nischceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L.,… More

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L., Lopes, M., Duarte, D. Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells. J. Vis. Exp. (187), e64248, doi:10.3791/64248 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter