Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Анализ проточной цитометрии гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга мышей и стромальных нишевых клеток

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64248
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3,4
1Instituto de Investigação e Inovação em Saúde (i3S), Universidade do Porto, 2Department of Onco-Hematology, Instituto Português de Oncologia (IPO)-Porto, 3Unit of Biochemistry, Department of Biomedicine, Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 4Porto Comprehensive Cancer Center (P.CCC)

Summary

Здесь мы описываем простой протокол выделения и окрашивания клеток костного мозга мышей для фенотипа гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников вместе с поддерживающими нишевыми эндотелиальными и мезенхимальными стволовыми клетками. Также включен метод обогащения клеток, расположенных в эндостальных и центральных областях костного мозга.

Abstract

Костный мозг (БМ) - это мягкие ткани, обнаруженные в костях, где в первую очередь происходит кроветворение, процесс, посредством которого образуются новые клетки крови. Таким образом, он содержит гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (HSPC), а также поддерживающие стромальные клетки, которые способствуют поддержанию и регуляции HSPC. Гематологические и другие нарушения КМ нарушают кроветворение, воздействуя непосредственно на гемопоэтические клетки и/или через изменение ниши КМ. Здесь мы описываем метод изучения гемопоэза в норме и злокачественных новообразований с помощью фенотипического анализа БМ мышей HSPC и популяций стромальных ниш с помощью проточной цитометрии. В нашем методе подробно описаны необходимые шаги для обогащения клеток БМ в эндостальных и центральных фракциях КМ, а также соответствующие стратегии стробирования для идентификации двух ключевых типов нишевых клеток, участвующих в регуляции HSPC, эндотелиальных клеток и мезенхимальных стволовых клеток. Предложенный здесь фенотипический анализ может быть объединен с мутантами мышей, моделями заболеваний и функциональными анализами для характеристики компартмента HSPC и его ниши.

Introduction

Проточная цитометрия является бесценным методом для характеристики и проспективного выделения иммунных и кроветворных клеток. Он также все чаще используется для анализа стромальных и эпителиальных популяций различных тканей. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) обладают уникальными свойствами самообновления и мультипотентности. У взрослых млекопитающих ГСК в основном находятся в костном мозге (БМ), где они получают сигналы покоя и выживания из окружающей микросреды или ниши1. ГСК формально определяются в соответствии с функциональными анализами2. Тем не менее, несколько знаковых работ показали полезность проточной цитометрии для идентификации ГСК. Благодаря использованию ограниченных маркеров клеточной поверхности можно различать гемопоэтические популяции, которые сильно обогащены ГСК3. Таким образом, проточная цитометрия является центральным методом в области стволовых клеток. Он широко используется для оценки влияния предполагаемых типов нишевых клеток и нишевых факторов на ГСК. Сочетая проточную цитометрию с визуализацией и функциональными анализами, было показано, что ГСК критически поддерживаются периваскулярными мезенхимальными стволовыми клетками (МСК) и эндотелиальными клетками (ЭК). МСК BM представляют собой гетерогенную группу и имеют различные вклады цитокинов4, но хорошо известно, что рецептор лептина (LepR) + МСК являются ключевыми нишевыми клетками1. КМ ЭК также очень гетерогены и могут входить в состав синусоидов, артериол и сосудов типа Н/переходных сосудов5. Различные исследования показали нюансы вклада этих различных ЭК. Например, эндостальные синусоидальные ЭК пространственно ближе к покоящимся ГСК6, в то время как немигрирующие ГСК с более низкими уровнями активных форм кислорода расположены вблизи артериолярных ЭК7. Эндостальное расположение ниш по сравнению с центральным также очень важно. Эндостальные сосуды типа H связаны с периваскулярными стромальными клетками, которые теряются с возрастом, что приводит к потере ГСК8. При остром миелоидном лейкозе центральные ЭК расширяются, в то время как эндостальные сосуды и эндостальные ГСК теряются9.

Большинство исследований в этой области были сосредоточены на самом кроветворении и на внешней регуляции клеток ГСК. Тем не менее, все шире признается необходимость более четкой характеристики ниш, которые регулируют другие предшественники, а именно мультипотентные предшественники (MPP), особенно с учетом того, что они являются основными движущими силами кроветворения в устойчивом состоянии10. В отличие от фиксированной иерархической структуры, недавние исследования показали, что кроветворение представляет собой континуум, в котором ГСК дифференцируются в смещенные MPP на ранней стадии11. MPP были названы в честь различных классификационных схем12, но в недавнем консенсусном документе Международного общества экспериментальной гематологии (ISEH) предлагалось различать MPP как ранние MPP и в соответствии с их лимфоидным (MPP-Ly), мегакариоцитарным и эритроидным (MPP-Mk / E) и миелоидным (MPP-G / M) смещением13. Использование проточной цитометрии будет иметь решающее значение для дальнейшего изучения важности ниш КМ в регуляции этих популяций. Современные методы проточной цитометрии используют стратегии переменного стробирования для дифференциации HSPC и идентификации стромальных клеток, а именно EC, с использованием противоречивых маркеров. Целью данного метода является представление простого и воспроизводимого рабочего процесса окрашивания БМ для идентификации субпопуляций HSPC, гетерогенных групп EC и LepR+ MSCs. Мы считаем, что этот метод, хотя и сопоставимый с ранее описанными методами (см., например, ссылку 14), обеспечивает обновленный и простой в реализации протокол фенотипического анализа гемопоэтических клеток в двух функциональных областях костного мозга, эндостальной и центральной BM 8,15, а также стромальных нишевых клеток BM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Животные, использованные в этом протоколе, были размещены на животноводческом объекте i3S в определенных условиях, свободных от патогенов, в 12-часовом цикле свет-темнота и в среде с контролируемой температурой. Был обеспечен свободный доступ к стандартному корму для грызунов и воде. Все животные получали гуманный уход в соответствии с критериями, изложенными Федерацией европейских ассоциаций лабораторных животных по уходу и обращению с лабораторными животными (Директива ЕС 2010/63/ЕС). Экспериментальная процедура, проведенная на животных (эвтаназия), была одобрена Комитетом по этике животных i3S (ссылка DD_2019_15) и Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Подробную информацию о материалах, используемых в этом протоколе, можно найти в таблице материалов.

1. Приготовление растворов и окрашивание коктейлей

  1. Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS): растворите пять таблеток PBS в 1 л дистиллированной воды. Хранить при комнатной температуре (RT).
  2. PBS 2% фетальная бычья сыворотка (FBS): добавьте 10 мл FBS к 500 мл PBS. Хранить при температуре 4 °C.
  3. Буфер для лизиса эритроцитов (1x): Добавьте 50 мл 10-кратного буфера для лизиса эритроцитов к 450 мл деионизированной воды. Хранить при температуре 4 °C.
  4. Раствор коллагеназы IV и диспазы II: растворите 30 мг коллагеназы IV и 60 мг диспазы II в 30 мл HBSS для 1 мг / мл раствора коллагеназы IV и 2 мг / мл раствора диспазы II. Перед употреблением подготовьте свежий.
  5. Раствор, блокирующий Fc-рецепторы: добавьте 10 мкл очищенного антитела CD16/32 против мыши к 490 мкл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C до использования.
  6. Раствор для окрашивания красителя жизнеспособности флуоресцентных клеток: добавьте 2 мкл красителя жизнеспособности флуоресцентных клеток к 1 мл PBS. Перед употреблением подготовьте свежий.
  7. Коктейль происхождения биотина: смешайте 100 мкл каждого из следующих антител: биотин против мыши CD3ε, биотин против мыши CD4, биотин против мыши CD8a, биотин против мыши / CD11b человека, биотин против мыши / человека CD45R / B220, биотин против мыши Ly-6G / Ly-6C (Gr-1) и биотин против мыши TER-119 / эритроидные клетки. Хранить при температуре 4 °C до использования.
  8. Первичный коктейль окрашивания ГСК: добавьте 10 мкл коктейля линии биотина, 10 мкл иммунофлуоресцентно меченного 510 антимышиного CD150 (SLAM), 10 мкл фикоэритрина (PE) против мыши Flk2 (CD135), 10 мкл перидинин-хлорофилл-протеина (PerCP) против мыши Ly-6A / E (Sca-1), 10 мкл PE / Cyanine7 против мыши CD48 и 10 мкл аллофикоцианина (APC) / Cyanine7 против мыши CD117 (c-kit) к 940 мкл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до использования.
  9. Коктейль для первичного окрашивания стромы: добавьте 5 мкл биотинилированного антитела мыши к лептину R, 6,7 мкл антитела к эндомуцину мыши против ПЭ, 10 мкл антимышиного Ly-6A/E (Sca-1) PerCP, 4 мкл PE/Cyanine7 антимышиного CD31, 10 мкл APC/Cyanine7 антимышиного CD45 и 10 мкл APC/Cyanine7 антимышиного TER-119/эритроидных клеток к 954 мкл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до использования.
  10. ГСК / раствор для вторичного окрашивания стромы: добавьте 1 мкл стрептавидина APC к 1 мл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до использования.
  11. Коктейль для окрашивания ECs: добавьте 10 мкл антитела к эндомуцину PE против мыши, 10 мкл PerCP против мыши Ly-6A / E (Sca-1), 10 мкл PE / Cyanine7 против мыши CD31, 10 мкл Alexa Fluor 647 против мыши CD54 / ICAM-1, 10 мкл APC / Cyanine7 против мыши CD45 и 10 мкл APC / Cyanine7 против мыши TER-119 / эритроидных клеток к 940 мкл PBS 2% FBS. Готовьте свежими или в предыдущий день. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до использования.
  12. Раствор для окрашивания DAPI: добавьте 1 каплю реагента DAPI в 500 мкл PBS. Перед употреблением подготовьте свежий.

2. Отбор образцов

  1. Усыпить животное путем вывиха шейки матки (подробную информацию о животных, использованных для получения данных, представленных в этом исследовании, можно найти в дополнительной таблице 1). Положите животное животом вверх на чашку Петри и сбрызните 70% этанолом. Сделайте разрез над животом с помощью ножниц и стяните кожу до лодыжек.
  2. Возьмитесь за одну ногу и с помощью ножниц отрежьте ее нижнюю часть (там, где находится сустав между ногой и бедром), чтобы отделить ее от животного. Этот шаг также послужит вторичным подтверждающим методом эвтаназии. Снимите стопу с ноги, разрезав лодыжку. Поместите ногу в ледяной PBS 2% FBS. При необходимости повторите шаг с другой ногой.
  3. Возьмитесь за тазобедренную кость и, используя ножницы, отрежьте за ней отделение, чтобы отделить ее от животного. Поместите тазобедренную кость в ледяной PBS 2% FBS. При необходимости повторите шаг с другой тазобедренной костью.
  4. Поместите ногу (ноги) и тазобедренную кость (кости) в чашку Петри и стерильным скальпелем очистите кости. Разделите большеберцовую и бедренную кости, разрезав колено скальпелем. Поместите чистые кости в ледяной PBS 2% FBS.

3. Обработка образцов для анализа популяций гемопоэтических клеток в общем костном мозге

  1. Поместите бедренную или большеберцовую кость в ступку с ледяным PBS 2% FBS и раздавите кость, осторожно прижав ее к стенке ступки с помощью пестика. Клетки БМ высвобождаются в раствор, содержащийся в растворе.
  2. Пипеткой полученную клеточную суспензию вверх и вниз с помощью пипетки объемом 10 мл гомогенизируют и переносят в пробирку объемом 50 мл через клеточный фильтр размером 40 мкм, расположенный поверх пробирки.
  3. Если измельченные кости не выглядят белыми в этот момент, добавьте больше PBS 2% FBS в раствор и повторите дробление, а затем пипетку вверх и вниз и перенесите раствор в ту же пробирку объемом 50 мл через то же ситечко для клеток 40 мкм.
  4. Промойте раствор еще небольшим количеством PBS 2% FBS и перенесите раствор в ту же пробирку объемом 50 мл через тот же сетчатый фильтр для клеток 40 мкм. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл буфера лизиса эритроцитов (1x) при RT путем пипетки вверх и вниз несколько раз. После 2-минутной инкубации при ЛТ добавьте 15 мл PBS 2% FBS.
  6. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Если гранулы клетки по-прежнему выглядят красноватыми, вернитесь к шагу 3.5. Если нет, выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу в 200 мкл PBS и перенесите клеточную суспензию в лунку 96-луночной пластины с V-образным дном для окрашивания.
  7. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и снова суспендируйте гранулу в 200 мкл раствора для окрашивания флуоресцентного красителя. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  8. Центрифужная пластина при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на впитывающую бумагу, и снова суспендируйте гранулу в 200 мкл PBS 2% FBS для промывки.
  9. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл раствора, блокирующего Fc-рецепторы. Выдерживают пластину в течение 10 мин при температуре 4 °C в защищенном от света месте.
  10. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл коктейля первичного окрашивания ГСК. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  11. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл вторичного окрашивающего раствора ГСК. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  12. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на впитывающую бумагу.
  13. Ресуспендируют гранулу в 250 мкл PBS 2% FBS и переносят суспензию ячейки в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл через сетчатый фильтр ячейки 40 мкм. Хранить на льду в защищенном от света месте до проведения проточного цитометрического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы заинтересованы в определении абсолютного количества популяций гемопоэтических клеток, добавьте шарики калибра в полистирольные пробирки перед анализом в цитометре16.

4. Обработка образцов для анализа популяций стромальных клеток в общем костном мозге

  1. Поместите бедренную или большеберцовую кость в ступку с ледяным PBS 2% FBS и раздавите кость, осторожно прижав ее к стенке ступки с помощью пестика. Отрежьте кончик наконечника P1000 ножницами и используйте его, чтобы перенести все содержимое раствора в пробирку объемом 50 мл (не пропускайте через сетчатое фильтр).
  2. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 3 мл раствора коллагеназы IV и диспазы II. Инкубировать пробирку при 37 °C в течение 40 мин.
  3. Долейте пробирку до 25 мл PBS 2% FBS и перемешайте. Перенесите содержимое пробирки объемом 50 мл в новую пробирку объемом 50 мл через сетчатое фильтр для клеток размером 100 мкм. Добавьте 15 мл PBS 2% FBS в старую пробирку объемом 50 мл и перенесите раствор в ту же новую пробирку объемом 50 мл через тот же клеточный фильтр. Центрифуга при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  4. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 5 мл буфера лизиса эритроцитов (1x) при RT путем пипетки вверх и вниз несколько раз. После 2-минутной инкубации при ЛТ добавьте 15 мл PBS 2% FBS.
  5. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Если гранула ячейки по-прежнему выглядит красноватой, вернитесь к шагу 4.4. Если нет, выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу в 200 мкл PBS 2% FBS и перенесите клеточную суспензию в лунку 96-луночной пластины с V-образным дном для окрашивания. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C.
  6. Если вы выполняете стромальное окрашивание, перейдите к шагу 4.7. Если вы выполняете окрашивание ЕС, перейдите к шагу 4.12.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл коктейля стромального первичного окрашивания. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  8. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл раствора для вторичного окрашивания стромы. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  9. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на впитывающую бумагу.
  10. Ресуспендируют гранулу в 250 мкл PBS 2% FBS и переносят суспензию ячейки в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл через сетчатый фильтр ячейки 40 мкм. Держать на льду в защищенном от света месте.
  11. Непосредственно перед подведением к цитометру добавьте 35 мкл окрашивающего раствора DAPI в пробирку, содержащую клеточную суспензию, для анализа проточной цитометрии и инкубируйте пробирку при ЛТ в течение 5 минут в темноте. После этой инкубации храните на льду в защищенном от света месте до анализа проточной цитометрии.
  12. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу, и снова суспендируйте гранулу в 100 мкл коктейля для окрашивания ЭК. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  13. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C.
  14. Выбросьте надосадочную жидкость, перевернув пластину на впитывающую бумагу. Ресуспендируют гранулу в 250 мкл PBS 2% FBS и переносят суспензию ячейки в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл через сетчатый фильтр ячейки 40 мкм. Держать на льду в защищенном от света месте.
  15. Непосредственно перед подведением к цитометру добавьте 35 мкл окрашивающего раствора DAPI в пробирку, содержащую клеточную суспензию, для анализа проточной цитометрии и инкубируйте пробирку при ЛТ в течение 5 минут в темноте. После этой инкубации храните на льду в защищенном от света месте до анализа проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы заинтересованы в определении абсолютного количества популяций стромальных и эндотелиальных клеток, добавьте шарики калибра в полистирольные пробирки перед анализом в цитометре16.

5. Обработка образцов для анализа популяций гемопоэтических клеток в измельченных и промытых КМ

  1. Поместите бедренную кость на чашку Петри и отрежьте концы кости с помощью стерильного скальпеля.
  2. Промывают центральную часть кости (диафиз), пропуская 100 мкл PBS 2% FBS через внутреннюю часть кости по одному разу с каждой стороны, используя инсулиновый шприц без мертвого объема 0,5 мл и собирая раствор в микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл PBS 2% FBS. Затем перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл, помеченную как промытый BM, содержащую 4 мл PBS 2% FBS. Держитесь на льду.
  3. Поместите концы кости в ступку с ледяным PBS 2% FBS и раздавите, осторожно прижав ее к стенке ступки с помощью пестика. Пипеткой полученную клеточную суспензию вверх и вниз с помощью пипетки объемом 10 мл гомогенизируют и переносят в пробирку объемом 50 мл, помеченную как измельченный BM, через сетчатое фильтр для клеток размером 40 мкм.
  4. Если раздробленная кость не выглядит белой в этот момент, добавьте в ступку еще PBS 2% FBS и повторите дробление. Затем пипеткой вверх и вниз и перенесите раствор в ту же пробирку объемом 50 мл (измельченный BM) через тот же сетчатый фильтр для клеток размером 40 мкм.
  5. Промойте раствор еще небольшим количеством PBS 2% FBS и перелейте раствор в ту же пробирку объемом 50 мл (измельченный BM) через тот же сетчатый фильтр для клеток 40 мкм.
  6. Центрифугируют пробирки объемом 50 мл, соответствующие промытым и измельченным образцам, в концентрации 500 x g в течение 3 мин при 4 °C.
  7. Выполните шаги с 3.5 по 3.13 (раздел 3) с промытыми и измельченными образцами BM.

6. Подготовка одноцветных контрольных (ПКК) для анализа проточной цитометрии

  1. Выполните шаги с 3.1 по 3.6 (раздел 3) с дополнительной костью одного из животных, не используемых для основного анализа, перенеся конечную клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл PBS 2% FBS вместо лунки 96-луночной пластины с V-образным дном.
  2. Перенесите 100 мкл клеточной суспензии в 8 лунок 96-луночной пластины с V-образным дном, 100 мкл в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл, содержащую 100 мкл PBS 2% FBS, помеченного как DAPI SCC, и оставшуюся клеточную суспензию в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл, содержащую 100 мкл PBS 2% FBS, помеченного как неокрашенный. Держите трубки на льду в защищенном от света месте.
  3. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 ° C и выбросьте надосадочные жидкости, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу.
  4. Ресуспендируют одну гранулу в 100 мкл раствора для окрашивания флуоресцентного красителя, а остальные - в 100 мкл PBS 2% FBS.
  5. Добавьте 0,5 мкл следующих антител, кроме коктейля антител по происхождению, для которого добавляют 2 мкл и антитела PECy7 CD31, для которого добавляют 0,3 мкл, в каждую из лунок с клеточной суспензией в PBS 2% FBS (одно антитело на лунку, те же антитела, которые используются в основных панелях анализа, или те же флуорофорные антитела с аналогичной интенсивностью флуоресценции и содержанием эпитопов): коктейль биотиновой линии, иммунофлуоресцентно меченный 510 антимышиный CD150 (SLAM), PE анти-мышиный Flk2 (CD135), PerCP антимышиный Ly-6A/E (Sca-1), иммунофлуоресцентно меченный 647 анти-мышиный CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 анти-мышиный CD48 и APC/Cyanine7 анти-мышиный CD117 (c-kit). Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  6. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS в каждую лунку и несколько раз пипеткой вверх и вниз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 ° C и выбросьте надосадочные жидкости, перевернув пластину на абсорбирующую бумагу.
  7. Ресуспендируют все гранулы, кроме тех, которые соответствуют клеткам, инкубированным с коктейлем антител в 180 мкл PBS 2% FBS, и переносят клеточные суспензии в 5 мл полистирольных пробирок с круглым дном через клеточные сетчатые фильтры 40 мкм. Хранить на льду в защищенном от света месте до проведения проточного цитометрического анализа.
  8. Ресуспендируют клетки, инкубированные с коктейлем антител в 100 мкл раствора вторичного окрашивания ГСК / стромы. Выдерживают пластину в течение 15 минут при РТ в темноте.
  9. Добавьте 100 мкл PBS 2% FBS и пипеткой вверх и вниз несколько раз для промывки. Центрифугируйте пластину при 500 x g в течение 3 мин при 4 °C.
  10. Ресуспендируют гранулу в 180 мкл PBS 2% FBS и переносят клеточную суспензию в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл через сетчатый фильтр ячейки 40 мкм. Хранить на льду в защищенном от света месте до проведения проточного цитометрического анализа.
  11. Непосредственно перед подойдя к цитометру, добавьте 35 мкл окрашивающего раствора DAPI в пробирку DAPI SCC и инкубируйте пробирку при ЛТ в течение 5 минут в темноте. После этой инкубации храните на льду в защищенном от света месте до анализа проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Репрезентативные графики проточного цитометрического анализа ГСК и МПП у здоровой молодой взрослой мыши C57Bl/6 показаны на рисунке 1. Стратегия стробирования соответствует последней гармонизирующей номенклатуре, предложенной ISEH13. При анализе воздействия возмущения, такого как инфекция или рак, важно использовать управляющую мышь в качестве эталона для обычных ворот. Управление флуоресценцией минус один (FMO) может быть особенно полезным для очерчивания границ ворот, но следует отметить, что слепая установка пределов затворов на основе FMO может опускать клетки-мишени или включать нецелевые клетки. Например, чем ниже интенсивность набора CD48, тем выше обогащение для длительных ГСК17 в состоянии покоя. Кроме того, различные свойства определенных популяций зависят от интенсивности специфических маркеров. Например, ГСК, экспрессирующие более высокие уровни CD150, более миелоидно-смещены18.

Частоты и абсолютные числа, полученные при анализе популяций гемопоэтических клеток, примененных в общей сложности к четырем животным, представлены в таблице 1.

На рисунке 2 показаны репрезентативные графики проточного цитометрического анализа ЭК и МСК. Большинство гемопоэтических клеток исключаются после отрицательного отбора Ter119/CD45. Затем можно легко идентифицировать МСК LepR+, в то время как истинные ЭК требуют последующего отбора клеток Sca-1+. В то время как Sca-1 часто используется в иммунофлуоресцентных исследованиях для специфической маркировки артериол, это не относится к проточной цитометрии, поскольку этот метод очень чувствителен, и EC всегда экспрессируют определенную (даже если низкую) степень Sca-1 на поверхности клетки. Не выбирая только клетки Sca-1+, в анализ будут включены другие неэндотелиальные клетки, такие как миелоидные клетки, экспрессирующие CD31, что может существенно повлиять на количественную оценку ЭК в BM. EC могут быть проанализированы как целая популяция, так и на основе специфических маркеров, которые частично раскрывают их гетерогенность. Эндомуцин в комбинации с CD31 очень полезен для идентификации функционально отличного эндотелиятипа H 15 (рис. 2). Кроме того, ранее было показано, что экспрессия ICAM-1 позволяет различать артериолы (aBMEC) и синусоидальные EC (sBMEC) (рис. 3)20.

Частоты и абсолютные числа, полученные при анализе МСК и популяций эндотелиальных клеток, примененных в общей сложности к четырем животным, представлены в таблице 2 и таблице 3.

Хотя функциональные области КМ четко не разграничены в явных гистологических областях, хорошо известно, что эндостальные области костной оболочки и центральные области КМ обогащаются определенными типами клеток и событиями (например, высвобождением тромбоцитов/протромбоцитов из мегакариоцитов в синусоидах центральных областей КМ). Поэтому полезно обогатить типы клеток в центральной и эндостальных областях, чтобы отдельно проанализировать эти два компартмента. Мы применили метод промывки диафиза для обогащения центральных типов клеток и дробления метафиза для обогащения типов эндостальных клеток (рис. 4А). Количественное определение aBMEC и sBMEC в промытой (центральной) и раздробленной (эндостальной) ткани BM (рис. 4B) подтверждает применимость этого метода механической изоляции, поскольку aBMEC, как известно, более распространены в эндостальных областях, а синусоиды чаще встречаются в центральных областях BM.

Figure 1
Рисунок 1: Анализ популяций кроветворных клеток. Репрезентативные графики, показывающие стратегию стробирования для анализа проточной цитометрии популяций гемопоэтических клеток в общем объеме БМ с использованием предоставленного программного обеспечения. Сокращения: FSC-H = прямой разброс - высота, FSC-A = передний разброс - площадь, Lin = линия, LKS = Lin-Sca-1+ c-Kit+ гемопоэтические клетки-предшественники, MPPLy = мультипотентные предшественники - лимфоидные, MPP G/M = мультипотентные предшественники - гранулоциты/макрофаги, MPPMk/E = мультипотентные предшественники - мегакариоциты/эритроциты, MPP = мультипотентные предшественники, ГСК = гемопоэтические стволовые клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Анализ популяций стромальных клеток. Репрезентативные графики, показывающие стратегию стробирования для анализа проточной цитометрии стромальных клеток в общем КМ с использованием предоставленного программного обеспечения. Сокращения: FSC-H = прямое рассеяние - высота, FSC-A = прямое рассеяние - площадь, МСК = мезенхимальные стволовые клетки, LepR = рецептор лептина, ECs = эндотелиальные клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Анализ эндотелиальных клеток. Репрезентативные графики, показывающие стратегию стробирования для проточного цитометрического анализа ЭК в общем КМ с использованием предоставленного программного обеспечения. Сокращения: FSC-H = прямое рассеяние - высота, FSC-A = прямое рассеяние - площадь, ECs = эндотелиальные клетки, aBMECs = артериальные эндотелиальные клетки костного мозга, sBMECs = синусоидальные эндотелиальные клетки костного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ популяций ЭК в центральных и эндостальных районах . (A) Изображение различных частей длинной кости мыши. (B) Графики, показывающие статистически значимые различия в частоте эндотелиальных клеток CD31+ в aBMEC (обогащенных в измельченном образце) и sBMEC (обогащенных в промытом образце). Каждая точка представляет собой мышь (n = 9), а образцы являются парными. В качестве статистического теста использовался парный Т-критерий. обозначает двустороннее P-значение < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Клеточная популяция Среднее значение частоты живых клеток КМ ± SD (n=4) в общем БМ Среднее значение количества клеток ± SD (n = 4) на бедренную кость в общем КМ Среднее значение частоты живых клеток КМ ± SD (n=4) при эндостальном КМ Среднее значение частоты живых клеток КМ ± SD (n=4) в центральном КМ
Лин- 3.05 ± 0.13 337610 ± 59414 3.56 ± 0.21 3.53 ± 0.19
ЛКС 0,096 ± 0,026 10206 ± 1794 0,102 ± 0,025 0,133 ± 0,022
MPPLy 0,058 ± 0,011 6141 ± 716 0,058 ± 0,011 0,085 ± 0,007
МППГ/М 0,011 ± 0,004 1233 ± 326 0,013 ± 0,003 0,014 ± 0,003
МППMk/E 0,0010 ± 0,0002 113 ±21 0,0014 ± 0,0004 0,0012 ± 0,0005
МПП 0,0092 ± 0,0045 940 ± 374 0,0105 ± 0,0048 0,0118 ± 0,0061
ГСК 0,0054 ± 0,0023 572 ± 191 0,0055 ± 0,0023 0,0059 ± 0,0016

Таблица 1: Количественные данные для популяций гемопоэтических клеток. Среднее значение частоты в живых клетках КМ различных популяций гемопоэтических клеток, проанализированных в общем, эндостальном и центральном КМ и количестве клеток на бедренную кость в общем КМ. Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение (SD), n = 4.

Клеточная популяция Среднее значение частоты живых клеток БМ ± SD (n=4) Среднее значение количества клеток ± SD (n=4) на большеберцовую кость
ЭК 0,080 ± 0,011 4523 ± 1521
EC типа H 0,041 ± 0,006 2299 ± 752
EC типа L 0,038 ± 0,005 2103 ± 736
МСК 0,180 ± 0,048 10270 ± 4282

Таблица 2: Количественные данные для популяций стромальных клеток. Среднее значение частоты в живых клетках КМ и количество клеток на большеберцовую кость для различных популяций стромальных клеток, проанализированных в общем КМ. Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение (SD), n = 4.

Клеточная популяция Среднее значение частоты живых клеток БМ ± SD (n=4) Среднее значение количества клеток ± SD (n=4) на большеберцовую кость
ЭК 0,064 ± 0,006 2255 ±150
aBMEC 0,041 ± 0,010 1419 ± 286
sBMEC 0,023 ± 0,006 819 ± 250

Таблица 3: Количественные данные для популяций эндотелиальных клеток. Среднее значение частоты в живых клетках КМ и количество клеток на большеберцовую кость для различных популяций эндотелиальных клеток, проанализированных в общем КМ. Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение (SD), n = 4.

Дополнительная таблица 1: Подробная информация о животных, использованных в исследовании. Штамм, пол, возраст и вес животных, использованных для получения данных, показанных на рисунке 1, рисунке 2 и рисунке 3, а также в таблице 1, таблице 2 и таблице 3. Аббревиатура: g = граммы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя описанный протокол прост и удобен в исполнении, особое внимание следует уделить конкретным шагам. Например, при получении промытого БМ (этап 5.2) не следует превышать объем или количество раз, указанное для прохождения PBS 2% FBS через внутреннюю часть центральной части кости, так как это может привести к значительному загрязнению промытого образца популяциями эндостальных клеток.

В протокол могут быть внесены изменения, облегчающие его выполнение исследователем. При отборе проб (секция 2) ноги и/или кости можно хранить в PBS 2% FBS при 4 °C до 24 часов, прежде чем приступить к обработке и анализу пробы. Однако это время должно быть сведено к минимуму, когда это возможно. Во время инкубации с коктейлем первичного окрашивания ГСК (стадия 3.10) и коктейля вторичного окрашивания (стадия 3.11), в то время как показана 15-минутная инкубация при RT, ее можно заменить на 30-минутную инкубацию при 4 °C.

То же самое относится к инкубации с коктейлем стромального первичного окрашивания (стадия 4.7), раствором для вторичного окрашивания стромы (стадия 4.8), коктейлем для окрашивания ЭК (стадия 4.12) и инкубацией с антителами к ПКК (стадия 6.5); в то время как показана 15-минутная инкубация при RT, ее можно заменить на 30-минутную инкубацию при 4 ° C.

Недавно был описан другой протокол выделения КМ путем центрифугирования длинных костей мышей21. В то время как этот протокол представляет собой преимущество более быстрой изоляции клеток BM, описанный здесь протокол позволяет анализировать клеточные популяции, находящиеся в различных областях костей.

Особым ограничением современного метода является то, что он основан исключительно на фенотипическом анализе методом проточной цитометрии. Это особенно актуально в случае ГСК, которые потребуют дальнейшей функциональной валидации. Однако этот метод можно комбинировать с сортировкой обогащенных популяций и изучением этих клеток в долгосрочных анализах восстановления и анализах колоний in vitro .

Что касается анализа стромальных клеток, в частности МСК и ЭК, ранее было показано, что, несмотря на оптимизацию обработки КМ для анализа проточной цитометрии, значительное количество клеток не выделено из ткани, и существует неоптимальное количественное определение этих клеток по сравнению с другими методами, такими как визуализация всего массива19. Тем не менее, проточная цитометрия чрезвычайно полезна для проведения количественного и качественного анализа КМ ЭК и МСК и проспективного выделения их для функционального и экспрессионного анализов.

Другим ограничением современного метода является использование механического метода для разделения эндостальных и центральных фракций, которые в некоторой степени неизбежно загрязнены клетками из другого компартмента. Тем не менее, количественная оценка aBMEC и sBMEC, как описано в разделе репрезентативных результатов, показывает, что механическая изоляция является надежным методом обогащения клеточных популяций в этих областях.

Описанный метод позволяет проводить исследование кроветворения в различных условиях и стромальных нишах ГСКЦ. Представленный здесь фенотипический анализ может быть полезен для изучения ниш HSPC в сочетании со специфическими мутантами мышей, а именно линиями EC и MSC Cre, которые позволяют селективно манипулировать экспрессией генов в этих популяциях. Например, линии Cdh5(PAC)-CreERT222 и LepR-Cre23 могут быть использованы для селективной индукции экспрессии определенных генов в EC и MSC соответственно. Метод полезен для изучения их влияния на стромальный компартмент, а также на HSPC. Доступные линии Cre для изучения ниши сосудистого BM были недавно рассмотрены в Mosteo et al.5. Проспективное изучение ЛТ-ГСК без трансплантации было ограничено отсутствием надежных репортерных линий. Однако было показано, что недавно описанный Mds1GFP/+Flt3 Cre 6 обеспечивает высокое обогащение LT-HSC и хорошую дискриминацию со стороны нижестоящих предшественников, экспрессирующих Flt324. Сочетание этой мышиной линии и других гемопоэтических штаммов, таких как Vav-iCre25, с проточной цитометрией позволит изучать HSPC и их связь с нишей. Гематологические злокачественные новообразования часто связаны с нарушением кроветворения с самых ранних стадий, что отражается в изменении частот гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток и стромальных популяций9 , которые мы здесь представили для здорового C57Bl / 6. В будущих исследованиях следует изучить применение методов, аналогичных описанному здесь, с использованием нового оборудования, основанного на спектральной проточной цитометрии, которая позволяет проводить более обширную фенотипическую характеристику за счет анализа большего количества маркеров (более 30 одновременно).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Acknowledgments

LM был поддержан грантом Мемориального фонда леди Тата. JR был поддержан стипендией PhD от Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; стипендия FCT UI/BD/150833/2021). ML был поддержан стипендией PhD от FCT (стипендия FCT 2021.04773.BD). DD был поддержан грантами Американского общества гематологов, Фонда Паблова, FCT (EXPL/MED-ONC/0522/2021) и Португальского общества гематологии. Мы благодарим за поддержку доктора Катарину Мейрелеш и Эмилию Кардозо из центра TRACY в i3s.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody BioLegend 116114
APC Streptavidin BioLegend 405207
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody BioLegend 105826
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody BioLegend 103116
APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116223
Biotin anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100304
Biotin anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100404
Biotin anti-mouse CD8a antibody BioLegend 100704
Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody BioLegend 108404
Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody BioLegend 116204
Biotin anti-mouse/human CD11b antibody BioLegend 101204
Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody BioLegend 103204
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody BioLegend 115929
Calibrite 2 Color Beads BD Biosciences 349502
Collagenase IV Merck Life Science C1889
Dispase II Merck Life Science D4693
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin ThermoFisher Scientific 10500064
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14175095
Mouse Leptin R Biotinylated Antibody R&D systems BAF497
NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) ThermoFisher Scientific R37606 DAPI reagent
PE anti-mouse endomucin antibody ThermoFisher Scientific 12-5851-82
PE anti-mouse Flk2 (CD135) ThermoFisher Scientific 12-1351-82
PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody BioLegend 102524
PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody BioLegend 103424
PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody BioLegend 108122
Phosphate-buffered saline (PBS) tablets Merck Life Science P4417
Purified anti-mouse CD16/32 antibody BioLegend 101302
RBC lysis buffer 10x BioLegend 420302
Zombie Violet Fixable Viability Dye BioLegend 423114 fluorescent dye

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
  2. Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell. 1 (3), 263-270 (2007).
  3. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  4. Asada, N., et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nature Cell Biology. 19 (3), 214-223 (2017).
  5. Mosteo, L., et al. The dynamic interface between the bone marrow vascular niche and hematopoietic stem cells in myeloid malignancy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 635189 (2021).
  6. Christodoulou, C., et al. Live-animal imaging of native haematopoietic stem and progenitor cells. Nature. 578 (7794), 278-283 (2020).
  7. Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
  8. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  9. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in AML. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  10. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  11. Laurenti, E., Gottgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  12. Pietras, E. M., et al. Functionally distinct subsets of lineage-biased multipotent progenitors control blood production in normal and regenerative conditions. Cell Stem Cell. 17 (1), 35-46 (2015).
  13. Challen, G. A., Pietras, E. M., Wallscheid, N. C., Signer, R. A. J. Simplified murine multipotent progenitor isolation scheme: Establishing a consensus approach for multipotent progenitor identification. Experimental Hematology. 104, 55-63 (2021).
  14. Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells. Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).
  15. Kusumbe, A. P., Ramasamy, S. K., Adams, R. H. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 507 (7492), 323-328 (2014).
  16. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nature Protocols. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  17. Akinduro, O., et al. Proliferation dynamics of acute myeloid leukaemia and haematopoietic progenitors competing for bone marrow space. Nature Communications. 9 (1), 519 (2018).
  18. Beerman, I., et al. Functionally distinct hematopoietic stem cells modulate hematopoietic lineage potential during aging by a mechanism of clonal expansion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (12), 5465-5470 (2010).
  19. Gomariz, A., et al. Quantitative spatial analysis of haematopoiesis-regulating stromal cells in the bone marrow microenvironment by 3D microscopy. Nature Communications. 9 (1), 2532 (2018).
  20. Xu, C., et al. Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow. Nature Communications. 9 (1), 2449 (2018).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
  22. Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
  23. DeFalco, J., et al. Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus. Science. 291 (5513), 2608-2613 (2001).
  24. Boyer, S. W., Schroeder, A. V., Smith-Berdan, S., Forsberg, E. C. All hematopoietic cells develop from hematopoietic stem cells through Flk2/Flt3-positive progenitor cells. Cell Stem Cell. 9 (1), 64-73 (2011).
  25. Siegemund, S., Shepherd, J., Xiao, C., Sauer, K. hCD2-iCre and Vav-iCre mediated gene recombination patterns in murine hematopoietic cells. PLoS One. 10 (4), 0124661 (2015).

Tags

Опровержение выпуск 187
Анализ проточной цитометрии гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга мышей и стромальных нишевых клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L.,… More

Mosteo, L., Reis, J., Rocha, L., Lopes, M., Duarte, D. Flow Cytometry Analysis of Murine Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and Stromal Niche Cells. J. Vis. Exp. (187), e64248, doi:10.3791/64248 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter