Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.
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Artículo de método
Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal
En este artículo
Resumen
Resumen
La médula ósea (BM) es el tejido blando que se encuentra dentro de los huesos donde se produce principalmente la hematopoyesis, el proceso por el cual se generan nuevas células sanguíneas. Como tal, contiene células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), así como células estromales de soporte que contribuyen al mantenimiento y regulación de las HSPC. Los trastornos hematológicos y otros trastornos del BM interrumpen la hematopoyesis al afectar a las células hematopoyéticas directamente y/o a través de la alteración del nicho del BM. Aquí, describimos un método para estudiar la hematopoyesis en salud y malignidad a través del análisis fenotípico de HSPC de BM murino y poblaciones de nicho estromal por citometría de flujo. Nuestro método detalla los pasos necesarios para enriquecer las células BM en fracciones endosteal y central BM, así como las estrategias de compuerta apropiadas para identificar los dos tipos clave de células de nicho involucradas en la regulación de HSPC, células endoteliales y células madre mesenquimales. El análisis fenotípico propuesto aquí puede combinarse con mutantes de ratón, modelos de enfermedades y ensayos funcionales para caracterizar el compartimiento HSPC y su nicho.
Introducción
La citometría de flujo es un método invaluable para caracterizar y aislar prospectivamente células inmunes y hematopoyéticas. También se utiliza cada vez más para analizar poblaciones estromales y epiteliales de diferentes tejidos. La célula madre hematopoyética (HSC) tiene propiedades únicas de autorrenovación y multipotencia. En los mamíferos adultos, las HSC residen principalmente en la médula ósea (BM), donde reciben señales de quiescencia y supervivencia del microambiente circundante o nicho1. Las HSC se definen formalmente de acuerdo con los ensayos funcionales2. Sin embargo, varios artículos históricos han demostr....
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Protocolo
Los animales utilizados en este protocolo fueron alojados en la instalación de animales i3S bajo condiciones específicas libres de patógenos en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y un ambiente de temperatura controlada. Se proporcionó acceso gratuito a comida y agua estándar para roedores. Todos los animales recibieron cuidados humanitarios de acuerdo con los criterios descritos por la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencia de Animales de Laboratorio para el cuidado y manejo de animales de laboratorio (Directiva de la UE 2010/63 / UE). El procedimiento experimental realizado en los animales (eutanasia) fue aprobado por el Comité de Ética Animal del i3S (ref. DD....
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Resultados
En la Figura 1 se muestran gráficos representativos del análisis de citometría de flujo de HSC y MPP en un ratón C57Bl/6 adulto joven sano. La estrategia de cierre sigue la última nomenclatura armonizadora propuesta por el ISEH13. Al analizar el impacto de una perturbación, como una infección o cáncer, es importante utilizar un ratón de control como referencia para las puertas normales. Los controles de fluorescencia menos uno (FMO) pueden ser particularmente útiles p.......
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Discusión
Si bien el protocolo descrito es simple y fácil de realizar, se debe prestar especial atención a los pasos específicos. Por ejemplo, al obtener BM enjuagado (paso 5.2), no se debe exceder el volumen o el número de veces indicado para pasar PBS 2% FBS a través del interior de la parte central del hueso, ya que esto podría resultar en una contaminación significativa de la muestra enjuagada por poblaciones de células endosteal.
Se pueden hacer alteraciones al protocolo para facilitar su ejecución.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
LM fue apoyado por una subvención del Lady Tata Memorial Trust. JR fue apoyado por una beca de doctorado de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Beca FCT UI/BD/150833/2021). ML fue apoyado por una beca de doctorado de FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Americana de Hematología, la Fundación Pablove, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522 / 2021) y la Sociedad Portuguesa de Hematología. Catarina Meireles y Emilia Cardoso de TRACY facility en i3s.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 647 anticuerpo CD54/ICAM-1 contra ratones | BioLegend | 116114 | |
| APC Estreptavidina | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-ratón CD117 (c-kit) Anticuerpo BioLegend | 105826 | ||
| APC/Cyanine7 anti-ratón CD45 BioLegend | 103116 | ||
| APC/Cyanine7 anticuerpo anti-ratón TER-119/células eritroides | BioLegend | 116223 | |
| Biotina anti-ratón CD3 y épsilon; anticuerpo | BioLegend | 100304 | |
| Biotina anti-ratón CD4 | BioLegend | 100404 | |
| Biotina anticuerpo CD8a anti-ratón | BioLegend | 100704 | |
| Biotina anti-ratón Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) | BioLegend | 108404 | |
| Biotina anti-ratón TER-119/células eritroides | anticuerpo BioLegend | 116204 | |
| Biotina anti-ratón/humano anti-CD11b | BioLegend | 101204 | |
| Biotina anti-ratón/humano anti-ratón/humano CD45R/B220 | bioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-ratón anti-ratón CD150 (SLAM) | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | ||
| Colagenasa IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispasa II | Merck Life Science | D4693 | |
| Suero fetal bovino, calificado, inactivado por calor, aprobado por la UE, Origen en América del Sur ThermoFisher | Scientific | 10500064 | |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Leptina de ratón R Anticuerpo biotinilado | R& D systems | BAF497 | |
| NucBlue Reactivo de célula fija (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | Reactivo DAPI |
| anticuerpo de endomucina de ratón | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE antiratón Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anticuerpo CD31 de ratón | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cianina7 anticuerpo CD48 de ratón | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anticuerpo antiratón Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 108122 | |
| Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Merck Life Science | P4417 | |
| Anticuerpo CD16/32 antiratón purificado | Tampón | 101302 | |
| RBC 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | tinte fluorescente |
Referencias
- Comazzetto, S., Shen, B., Morrison, S. J. Niches that regulate stem cells and hematopoiesis in adult bone marrow. Developmental Cell. 56 (13), 1848-1860 (2021).
- Purton, L. E., Scadden, D. T. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell Stem Cell.
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Reimpresiones y permisos
