Summary
Aquí, describimos un protocolo simple para el aislamiento y tinción de células murinas de médula ósea para fenotipo de células madre hemopoyéticas y progenitoras junto con las células madre endoteliales y mesenquimales de nicho de soporte. También se incluye un método para enriquecer las células ubicadas en las áreas endosteal y central de la médula ósea.
Abstract
La médula ósea (BM) es el tejido blando que se encuentra dentro de los huesos donde se produce principalmente la hematopoyesis, el proceso por el cual se generan nuevas células sanguíneas. Como tal, contiene células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), así como células estromales de soporte que contribuyen al mantenimiento y regulación de las HSPC. Los trastornos hematológicos y otros trastornos del BM interrumpen la hematopoyesis al afectar a las células hematopoyéticas directamente y/o a través de la alteración del nicho del BM. Aquí, describimos un método para estudiar la hematopoyesis en salud y malignidad a través del análisis fenotípico de HSPC de BM murino y poblaciones de nicho estromal por citometría de flujo. Nuestro método detalla los pasos necesarios para enriquecer las células BM en fracciones endosteal y central BM, así como las estrategias de compuerta apropiadas para identificar los dos tipos clave de células de nicho involucradas en la regulación de HSPC, células endoteliales y células madre mesenquimales. El análisis fenotípico propuesto aquí puede combinarse con mutantes de ratón, modelos de enfermedades y ensayos funcionales para caracterizar el compartimiento HSPC y su nicho.
Introduction
La citometría de flujo es un método invaluable para caracterizar y aislar prospectivamente células inmunes y hematopoyéticas. También se utiliza cada vez más para analizar poblaciones estromales y epiteliales de diferentes tejidos. La célula madre hematopoyética (HSC) tiene propiedades únicas de autorrenovación y multipotencia. En los mamíferos adultos, las HSC residen principalmente en la médula ósea (BM), donde reciben señales de quiescencia y supervivencia del microambiente circundante o nicho1. Las HSC se definen formalmente de acuerdo con los ensayos funcionales2. Sin embargo, varios artículos históricos han demostrado la utilidad de la citometría de flujo para identificar HSC. Mediante el uso de marcadores de superficie celular limitada, es posible discriminar poblaciones hematopoyéticas altamente enriquecidas en HSCs3. La citometría de flujo es, por lo tanto, un método central en el campo de las células madre. Se ha utilizado ampliamente para evaluar el impacto de los tipos de células de nicho putativo y los factores de nicho en las HSC. Al combinar la citometría de flujo con imágenes y ensayos funcionales, se ha demostrado que las HSC están críticamente respaldadas por células madre mesenquimales perivasculares (MSC) y células endoteliales (CE). Las MSC BM son un grupo heterogéneo y tienen diferentes contribuciones de citoquinas4, pero está bien establecido que el receptor de leptina (LepR) + MSC son células de nicho clave1. Las CE BM también son muy heterogéneas y pueden formar parte de sinusoides, arteriolas y vasos tipo H/de transición5. Diferentes estudios han demostrado la contribución matizada de estos diferentes CE. Por ejemplo, las CE sinusoidales endosteal están espacialmente más cerca de las HSC quiescentes6, mientras que las HSC no migratorias con niveles más bajos de especies reactivas de oxígeno se encuentran cerca de las CE arteriolares7. El endosteal versus la ubicación central de los nichos también es muy importante. Los vasos endosteal tipo H están asociados con células del estroma perivascular que se pierden con el envejecimiento, lo que lleva a la pérdida de HSCs8. En la leucemia mieloide aguda, las CE centrales se expanden, mientras que los vasos endosteal y las HSC endosteal se pierden9.
La mayoría de los estudios en el campo se han centrado en la hematopoyesis en sí y en la regulación extrínseca de las HSC de la célula. Sin embargo, se ha reconocido cada vez más la necesidad de caracterizar mejor los nichos que regulan otros progenitores, a saber, los progenitores multipotentes (MPP), particularmente considerando que son los principales impulsores de la hematopoyesis en estado estacionario10. En contraste con una estructura jerárquica fija, estudios recientes han demostrado que la hematopoyesis es un continuo en el que las HSC se diferencian en MPP sesgadas en una etapa temprana11. Los MPP han sido nombrados después de diferentes esquemas de clasificación12, pero un reciente documento de consenso de la Sociedad Internacional de Hematología Experimental (ISEH) propuso que los MPP sean discriminados como MPP tempranos y de acuerdo con su sesgo linfoide (MPP-Ly), megacariocítico y eritroide (MPP-Mk / E) y mieloide (MPP-G / M)13. El uso de la citometría de flujo será fundamental para estudiar más a fondo la importancia de los nichos de BM en la regulación de estas poblaciones. Los métodos actuales de citometría de flujo utilizan estrategias de activación variable para diferenciar las HSPC e identificar las células del estroma, es decir, las CE, utilizando marcadores inconsistentes. El objetivo del método actual es presentar un flujo de trabajo simple y reproducible de tinción de BM para identificar subpoblaciones de HSPC, grupos heterogéneos de CE y MSC LepR +. Creemos que esta técnica, aunque comparable con los métodos previamente reportados (ver, por ejemplo, referencia 14), proporciona un protocolo actualizado y fácil de implementar para el análisis fenotípico de células hematopoyéticas en las dos áreas funcionales de la médula, endosteal y central BM 8,15, así como células de nicho estromal BM.
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Protocol
Los animales utilizados en este protocolo fueron alojados en la instalación de animales i3S bajo condiciones específicas libres de patógenos en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y un ambiente de temperatura controlada. Se proporcionó acceso gratuito a comida y agua estándar para roedores. Todos los animales recibieron cuidados humanitarios de acuerdo con los criterios descritos por la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencia de Animales de Laboratorio para el cuidado y manejo de animales de laboratorio (Directiva de la UE 2010/63 / UE). El procedimiento experimental realizado en los animales (eutanasia) fue aprobado por el Comité de Ética Animal del i3S (ref. DD_2019_15) y la Direção-Geral de Alimentação e Veterinária. Los detalles de los materiales utilizados a lo largo de este protocolo se pueden encontrar en la Tabla de materiales.
1. Preparación de soluciones y cócteles de tinción
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS): Disuelva cinco tabletas de PBS en 1 L de agua destilada. Conservar a temperatura ambiente (RT).
- PBS 2% suero fetal bovino (FBS): Agregue 10 ml de FBS a 500 ml de PBS. Conservar a 4 °C.
- Tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) (1x): agregue 50 ml de tampón de lisis RBC 10x a 450 ml de agua desionizada. Conservar a 4 °C.
- Solución de colagenasa IV y dispasa II: Disuelva 30 mg de colagenasa IV y 60 mg de dispasa II en 30 ml de HBSS para una solución de 1 mg/ml de colagenasa IV y 2 mg/ml de dispasa II. Preparar fresco antes de usar.
- Solución bloqueadora de receptores Fc: Agregue 10 μL de anticuerpo anti-ratón purificado CD16/32 a 490 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco o el día anterior. Conservar a 4 °C hasta su uso.
- Solución de tinción de colorante de viabilidad celular fluorescente: Agregue 2 μL de colorante de viabilidad celular fluorescente a 1 ml de PBS. Preparar fresco antes de usar.
- Cóctel de linaje de biotina: Mezcle 100 μL de cada uno de los siguientes anticuerpos: biotina anti-ratón CD3ε, biotina anti-ratón CD4, biotina anti-ratón CD8a, biotina anti-ratón/humano CD11b, biotina anti-ratón/humano CD45R/B220, biotina anti-ratón Ly-6G/Ly-6C (Gr-1), y biotina anti-ratón TER-119/células eritroides. Conservar a 4 °C hasta su uso.
- Cóctel de tinción primaria HSC: Agregue 10 μL de cóctel de linaje de biotina, 10 μL de 510 CD150 anti-ratón (SLAM) marcado inmunofluorescentemente, 10 μL de ficoeritrina (PE) anti-ratón Flk2 (CD135), 10 μL de peridina-clorofila-proteína (PerCP) anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL de PE/Cyanine7 anti-ratón CD48 y 10 μL de aloficocianina (APC)/cianina7 anti-ratón CD117 (c-kit) a 940 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco o el día anterior. Conservar a 4 °C protegido de la luz hasta su uso.
- Cóctel de tinción primaria del estroma: Agregue 5 μL de anticuerpo biotinilado leptina R de ratón, 6.7 μL de anticuerpo de endomucina de ratón anti-ratón PE, 10 μL de PerCP anti-ratón Ly-6A / E (Sca-1), 4 μL de PE / Cyanine7 anti-ratón CD31, 10 μL de APC / Cyanine7 anti-ratón CD45 y 10 μL de APC / Cyanine7 anti-ratón TER-119 / células eritroides a 954 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco o el día anterior. Conservar a 4 °C protegido de la luz hasta su uso.
- HSCs/solución de tinción secundaria estromal : Añadir 1 μL de estreptavidina APC a 1 ml de PBS 2% FBS. Preparar fresco o el día anterior. Conservar a 4 °C protegido de la luz hasta su uso.
- Cóctel de tinción de EC: Agregue 10 μL de anticuerpo de endomucina de ratón anti-ratón PE, 10 μL de PerCP anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1), 10 μL de PE/Cyanine7 anti-ratón CD31, 10 μL de Alexa Fluor 647 anti-ratón CD54/ICAM-1, 10 μL de APC/Cyanine7 anti-ratón CD45 y 10 μL de APC/Cyanine7 anti-ratón TER-119/células eritroides a 940 μL de PBS 2% FBS. Preparar fresco o el día anterior. Conservar a 4 °C protegido de la luz hasta su uso.
- Solución de tinción DAPI: Agregue 1 gota de reactivo DAPI a 500 μL de PBS. Preparar fresco antes de usar.
2. Extracción de muestras
- Eutanasia del animal por luxación cervical (los detalles de los animales utilizados para producir los datos presentados en este estudio se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1). Coloque al animal con la barriga hacia arriba en una placa de Petri y rocíe con etanol al 70%. Haga un corte por encima del abdomen con tijeras y retire la piel hasta los tobillos.
- Agarra una pierna y, usando unas tijeras, corta en su parte inferior (donde está la articulación entre la pierna y la cadera) para separarla del animal. Este paso también servirá como un método confirmatorio secundario de eutanasia. Retire el pie de la pierna cortando el tobillo. Coloque la pierna en PBS 2% FBS helado. Si es necesario, repita el paso con la otra pierna.
- Agarra el hueso de la cadera y, usando tijeras, corta detrás de él para separarlo del animal. Coloque el hueso de la cadera en PBS helado 2% FBS. Si es necesario, repita el paso con el otro hueso de la cadera.
- Coloque la(s) pierna(s) y la(s) cadera(s) hueso(s) en una placa de Petri y, usando un bisturí estéril, limpie los huesos. Separe la tibia y el fémur cortando la rodilla con el bisturí. Coloque los huesos limpios en PBS helado 2% FBS.
3. Procesamiento de muestras para el análisis de poblaciones de células hematopoyéticas en médula ósea total
- Coloque un fémur o tibia en un mortero con PBS 2% FBS helado y aplaste el hueso presionándolo suavemente contra la pared del mortero con el mortero. Las células BM se liberan en la solución contenida en el mortero.
- Pipetear la suspensión celular resultante hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de 10 ml para homogeneizar y transferir a un tubo de 50 ml a través de un filtro celular de 40 μm colocado en la parte superior del tubo.
- Si los huesos triturados no se ven blancos en este punto, agregue más PBS 2% FBS al mortero y repita la trituración, y luego pipete hacia arriba y hacia abajo y transfiera la solución al mismo tubo de 50 ml a través del mismo filtro de celda de 40 μm.
- Enjuague el mortero con un poco más de PBS 2% FBS y transfiera la solución al mismo tubo de 50 ml a través del mismo filtro celular de 40 μm. Centrifugar el tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 5 ml de tampón de lisis RBC (1x) en RT pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Después de una incubación de 2 minutos en RT, agregue 15 ml de PBS 2% FBS.
- Centrifugar el tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Si el pellet de la celda todavía se ve rojizo, vuelva al paso 3.5. Si no es así, deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 200 μL de PBS y transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa de fondo en V de 96 pocillos para teñir.
- Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente y vuelva a suspender el pellet en 200 μL de solución de tinción de colorante fluorescente. Incubar la placa durante 15 minutos a RT en la oscuridad.
- Placa centrífuga a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente y vuelva a suspender el pellet en 200 μL de PBS 2% FBS para lavar.
- Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, desechar el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente y resuspender el pellet en 100 μL de solución bloqueadora de receptores Fc. Incubar la placa durante 10 min a 4 °C protegida de la luz.
- Agregue 100 μL de PBS 2% FBS y pipete hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar. Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, desechar el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente y volver a suspender el pellet en 100 μL de cóctel de tinción primaria HSC. Incubar la placa durante 15 minutos a RT en la oscuridad.
- Agregue 100 μL de PBS 2% FBS y pipete hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar. Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, desechar el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente y resuspender el pellet en 100 μL de solución de tinción secundaria HSCs. Incubar la placa durante 15 minutos a RT en la oscuridad.
- Agregue 100 μL de PBS 2% FBS y pipete hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar. Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C y desechar el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente.
- Resuspender el pellet en 250 μL de PBS 2% FBS y transferir la suspensión celular a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml a través de un filtro celular de 40 μm. Mantener en hielo protegido de la luz hasta el análisis de citometría de flujo.
NOTA: Si está interesado en determinar el número absoluto de poblaciones de células hematopoyéticas, agregue perlas de calibrita a los tubos de poliestireno antes del análisis en el citómetro16.
4. Procesamiento de muestras para el análisis de poblaciones de células estromales en médula ósea total
- Coloque un fémur o tibia en un mortero con PBS 2% FBS helado y aplaste el hueso presionándolo suavemente contra la pared del mortero con el mortero. Corte la punta de una punta P1000 con tijeras y úsela para transferir todo el contenido del mortero a un tubo de 50 ml (no pase a través de un colador de celda).
- Centrifugar el tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 3 ml de colagenasa IV y solución de dispasa II. Incubar el tubo a 37 °C durante 40 min.
- Rellene el tubo a 25 ml con PBS 2% FBS y vórtice para mezclar. Transfiera el contenido del tubo de 50 ml a un nuevo tubo de 50 ml a través de un filtro celular de 100 μm. Agregue 15 ml de PBS 2% FBS al tubo antiguo de 50 ml y transfiera la solución al mismo tubo nuevo de 50 ml a través del mismo filtro celular. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 5 ml de tampón de lisis RBC (1x) en RT pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Después de una incubación de 2 minutos en RT, agregue 15 ml de PBS 2% FBS.
- Centrifugar el tubo de 50 ml a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Si el pellet de la célula todavía se ve rojizo, vuelva al paso 4.4. Si no, deseche el sobrenadante, resuspenda el pellet en 200 μL de PBS 2% FBS y transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa de fondo en V de 96 pocillos para teñir. Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
- Si realiza tinción estromal , continúe con el paso 4.7. Si realiza la tinción CE, continúe con el paso 4.12.
- Deseche el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente y resuspenda el pellet en 100 μL de cóctel de tinción primaria estromal . Incubar la placa durante 15 minutos a RT en la oscuridad.
- Agregue 100 μL de PBS 2% FBS y pipete hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar. Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C, desechar el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente y resuspender el pellet en 100 μL de solución de tinción secundaria estromal. Incubar la placa durante 15 minutos a RT en la oscuridad.
- Agregue 100 μL de PBS 2% FBS y pipete hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar. Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente.
- Resuspender el pellet en 250 μL de PBS 2% FBS y transferir la suspensión celular a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml a través de un filtro celular de 40 μm. Mantener sobre hielo protegido de la luz.
- Justo antes de ir al citómetro, agregue 35 μL de solución de tinción DAPI al tubo que contiene la suspensión celular para el análisis de citometría de flujo e incube el tubo a RT durante 5 minutos en la oscuridad. Después de esta incubación, mantener en hielo protegido de la luz hasta el análisis de citometría de flujo.
- Deseche el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente y vuelva a suspender el pellet en 100 μL de cóctel de tinción de AE. Incubar la placa durante 15 minutos a RT en la oscuridad.
- Agregue 100 μL de PBS 2% FBS y pipete hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar. Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante volteando la placa sobre papel absorbente. Resuspender el pellet en 250 μL de PBS 2% FBS y transferir la suspensión celular a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml a través de un filtro celular de 40 μm. Mantener sobre hielo protegido de la luz.
- Justo antes de ir al citómetro, agregue 35 μL de solución de tinción DAPI al tubo que contiene la suspensión celular para el análisis de citometría de flujo e incube el tubo a RT durante 5 minutos en la oscuridad. Después de esta incubación, mantener en hielo protegido de la luz hasta el análisis de citometría de flujo.
NOTA: Si está interesado en determinar el número absoluto de poblaciones de células estromales y endoteliales, agregue perlas de calibrita a los tubos de poliestireno antes del análisis en el citómetro16.
5. Procesamiento de muestras para el análisis de poblaciones de células hematopoyéticas en BM trituradas y enjuagadas
- Coloque un fémur en una placa de Petri y corte los extremos del hueso con un bisturí estéril.
- Enjuague la parte central del hueso (diáfisis) pasando 100 μL de PBS 2% FBS a través del interior del hueso una vez desde cada lado usando una jeringa de insulina sin volumen muerto de 0.5 ml y recolectando la solución en un tubo de microcentrífuga que contenga 1 ml de PBS 2% FBS. Posteriormente, transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 ml etiquetado como BM enjuagado que contenga 4 ml de PBS 2% FBS. Manténgase en hielo.
- Coloque los extremos del hueso en un mortero con PBS 2% FBS helado y aplaste presionándolo suavemente contra la pared del mortero con el mortero. Pipetear la suspensión celular resultante hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de 10 ml para homogeneizar y transferir a un tubo de 50 ml etiquetado como BM triturado a través de un filtro celular de 40 μm.
- Si el hueso triturado no se ve blanco en este punto, agregue más PBS 2% FBS al mortero y repita la trituración. Luego pipetear hacia arriba y hacia abajo y transferir la solución al mismo tubo de 50 ml (BM triturado) a través del mismo filtro celular de 40 μm.
- Enjuague el mortero con un poco más de PBS 2% FBS y transfiera la solución al mismo tubo de 50 ml (BM triturado) a través del mismo filtro celular de 40 μm.
- Centrifugar los tubos de 50 ml correspondientes a las muestras enjuagadas y trituradas a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
- Siga los pasos 3.5 a 3.13 (sección 3) con las muestras de BM enjuagadas y trituradas.
6. Preparación de controles monocolor (SCC) para el análisis de citometría de flujo
- Siga los pasos 3.1 a 3.6 (sección 3) con un hueso adicional de uno de los animales no utilizados para el análisis principal, transfiriendo la suspensión celular final a un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de PBS 2% FBS en lugar de un pocillo de una placa de fondo en V de 96 pocillos.
- Transfiera 100 μL de la suspensión celular a 8 pocillos de una placa de fondo en V de 96 pocillos, 100 μL a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml que contenga 100 μL de PBS 2% FBS etiquetado como DAPI SCC, y la suspensión celular restante a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml que contenga 100 μL de PBS 2% FBS etiquetado como no teñido. Mantenga los tubos en hielo protegidos de la luz.
- Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C y desechar los sobrenadantes volteando la placa sobre papel absorbente.
- Resuspender un pellet en 100 μL de solución de tinción de colorante fluorescente y los restantes en 100 μL de PBS 2% FBS.
- Añadir 0,5 μL de los siguientes anticuerpos, aparte del cóctel de linaje de anticuerpos para los que se añaden 2 μL y el anticuerpo PECy7 CD31 para el que se añaden 0,3 μL, a cada uno de los pocillos con suspensión celular en PBS 2% FBS (un anticuerpo por pocillo, los mismos anticuerpos utilizados en los paneles principales de análisis o los mismos anticuerpos fluoróforos con intensidad de fluorescencia y abundancia de epítopos similares): cóctel de linaje de biotina, marcado inmunofluorescentemente 510 anti-ratón CD150 (SLAM), PE anti-ratón Flk2 (CD135), PerCP anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1), inmunofluorescentemente marcado 647 anti-ratón CD54/ICAM-1, PE/Cyanine7 anti-ratón CD48 y APC/Cyanine7 anti-ratón CD117 (c-kit). Incubar la placa durante 15 minutos a RT en la oscuridad.
- Agregue 100 μL de PBS 2% FBS a cada pocillo y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar. Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C y desechar los sobrenadantes volteando la placa sobre papel absorbente.
- Resuspender todos los pellets excepto el correspondiente a las células incubadas con el cóctel de linaje de anticuerpos en 180 μL de PBS 2% FBS y transferir las suspensiones celulares a tubos de fondo redondo de poliestireno de 5 mL a través de filtros celulares de 40 μm. Mantener en hielo protegido de la luz hasta el análisis de citometría de flujo.
- Resuspender las células incubadas con el cóctel de linaje de anticuerpos en 100 μL de HSCs/solución de tinción secundaria estromal . Incubar la placa durante 15 minutos a RT en la oscuridad.
- Agregue 100 μL de PBS 2% FBS y pipete hacia arriba y hacia abajo varias veces para lavar. Centrifugar la placa a 500 x g durante 3 min a 4 °C.
- Resuspender el pellet en 180 μL de PBS 2% FBS y transferir la suspensión celular a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml a través de un filtro celular de 40 μm. Mantener en hielo protegido de la luz hasta el análisis de citometría de flujo.
- Justo antes de ir al citómetro, agregue 35 μL de solución de tinción DAPI al tubo DAPI SCC e incube el tubo a RT durante 5 minutos en la oscuridad. Después de esta incubación, mantener en hielo protegido de la luz hasta el análisis de citometría de flujo.
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Representative Results
En la Figura 1 se muestran gráficos representativos del análisis de citometría de flujo de HSC y MPP en un ratón C57Bl/6 adulto joven sano. La estrategia de cierre sigue la última nomenclatura armonizadora propuesta por el ISEH13. Al analizar el impacto de una perturbación, como una infección o cáncer, es importante utilizar un ratón de control como referencia para las puertas normales. Los controles de fluorescencia menos uno (FMO) pueden ser particularmente útiles para delinear los límites de las puertas, pero debe tenerse en cuenta que la configuración ciega de límites de puerta basados en FMO puede omitir celdas objetivo o incluir celdas no objetivo. Por ejemplo, cuanto menor es la intensidad del conjunto CD48, mayor es el enriquecimiento para las HSC quiescentes a largo plazo17. Además, las diferentes propiedades de ciertas poblaciones dependen de la intensidad de marcadores específicos. Por ejemplo, las HSC que expresan niveles más altos de CD150 tienen más sesgo mieloide18.
Las frecuencias y números absolutos obtenidos en el análisis de poblaciones de células hematopoyéticas aplicadas a un total de cuatro animales se presentan en la Tabla 1.
La Figura 2 muestra gráficos representativos del análisis de citometría de flujo de CE y MSC. La mayoría de las células hematopoyéticas se excluyen después de una selección negativa de Ter119/CD45. Las MSC LepR+ se pueden identificar fácilmente, mientras que las CE verdaderas requieren una selección posterior de células Sca-1+. Si bien Sca-1 se usa a menudo en estudios de inmunofluorescencia para marcar específicamente arteriolas, este no es el caso en la citometría de flujo, ya que esta técnica es altamente sensible y las CE siempre expresan un cierto grado (aunque bajo) de Sca-1 en la superficie celular. Al no seleccionar solo las células Sca-1+, se incluirían otras células no endoteliales en el análisis, como las células mieloides que expresan CD31, lo que podría afectar significativamente la cuantificación de las CE en el BM. Las CE pueden analizarse como una población completa o basarse en marcadores específicos que revelan parcialmente su heterogeneidad. La endomucina en combinación con CD31 es muy útil para identificar el endotelio tipo H funcionalmente distinto15 (Figura 2). Además, se ha demostrado previamente que la expresión de ICAM-1 permite la discriminación entre CE arteriolares (aBMECs) y sinusoidales (sBMECs) (Figura 3)20.
Las frecuencias y números absolutos obtenidos en el análisis de MSCs y poblaciones de células endoteliales aplicadas a un total de cuatro animales se presentan en la Tabla 2 y Tabla 3.
Aunque las áreas funcionales de BM no están claramente delineadas en regiones histológicas evidentes, está bien establecido que las áreas endosteal de revestimiento óseo y las áreas centrales de BM están enriquecidas en ciertos tipos y eventos celulares (por ejemplo, la liberación de plaquetas / proplaquetas de megacariocitos en los sinusoides de las áreas centrales de BM). Por lo tanto, es útil enriquecer para los tipos de células en las áreas central y endosteal para analizar por separado estos dos compartimentos. Aplicamos un método de lavado de la diáfisis para enriquecer los tipos de células centrales y triturar la metáfisis para enriquecer los tipos de células endosteal (Figura 4A). La cuantificación de aBMECs y sBMECss en tejido BM enjuagado (central) y triturado (endosteal) (Figura 4B) valida la aplicabilidad de este método de aislamiento mecánico, ya que los aBMEC son notoriamente más abundantes en regiones endosteal, y los sinusoides son más frecuentes en áreas centrales de BM.
Figura 1: Análisis de poblaciones de células hematopoyéticas. Gráficos representativos que muestran la estrategia de compuerta para el análisis de citometría de flujo de poblaciones de células hematopoyéticas en BM total utilizando el software proporcionado. Abreviaturas: FSC-H = dispersión hacia adelante - altura, FSC-A = dispersión hacia adelante - área, Lin = linaje, LKS = Lin- Sca-1+ c-Kit+ células progenitoras hematopoyéticas, MPPsLy = progenitores multipotentes - linfoide, MPPsG/M = progenitores multipotentes - granulocitos/macrófagos, MPPsMk/E = progenitores multipotentes - megacariocitos/eritrocitos, MPPs = progenitores multipotentes, HSCs = células madre hematopoyéticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de poblaciones de células estromales. Gráficos representativos que muestran la estrategia de compuerta para el análisis de citometría de flujo de células estromales en BM total utilizando el software proporcionado. Abreviaturas: FSC-H = dispersión directa - altura, FSC-A = dispersión hacia adelante - área, MSC = células madre mesenquimales, LepR = receptor de leptina, CE = células endoteliales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de células endoteliales. Gráficos representativos que muestran la estrategia de compuerta para el análisis de citometría de flujo de CE en BM total utilizando el software proporcionado. Abreviaturas: FSC-H = dispersión hacia adelante - altura, FSC-A = dispersión hacia adelante - área, CE = células endoteliales, aBMEC = células endoteliales de la médula ósea arterial, sBMEC = células endoteliales de la médula ósea sinusoidal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de las poblaciones de CE en las zonas central y endosteal . (A) Representación de las diferentes partes de un hueso largo murino. (B) Gráficos que muestran las diferencias estadísticamente significativas en las frecuencias de células endoteliales CD31+ en aBMEC (enriquecidas en la muestra triturada) y sBMEC (enriquecidas en la muestra enjuagada). Cada punto representa un ratón (n = 9), y las muestras están emparejadas. La prueba estadística utilizada fue la prueba T pareada. denota un valor P de dos colas < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Población celular | Media de frecuencia de células vivas de BM ± SD (n=4) en BM total | Media del recuento celular ± DE (n=4) por fémur en BM total | Media de frecuencia de células vivas de BM ± SD (n=4) en BM endosteal | Media de frecuencia de células vivas de BM ± SD (n=4) en BM central |
| Lin- | 3,05 ± 0,13 | 337610 ± 59414 | 3,56 ± 0,21 | 3,53 ± 0,19 |
| LKS | 0,096 ± 0,026 | 10206 ± 1794 | 0,102 ± 0,025 | 0,133 ± 0,022 |
| MPPsLy | 0,058 ± 0,011 | 6141 ± 716 | 0,058 ± 0,011 | 0,085 ± 0,007 |
| MPPG/M | 0,011 ± 0,004 | 1233 ± 326 | 0,013 ± 0,003 | 0,014 ± 0,003 |
| MPPsMk/E | 0,0010 ± 0,0002 | 113 ± 21 | 0,0014 ± 0,0004 | 0,0012 ± 0,0005 |
| MPP | 0,0092 ± 0,0045 | 940 ± 374 | 0,0105 ± 0,0048 | 0,0118 ± 0,0061 |
| HSC | 0,0054 ± 0,0023 | 572 ± 191 | 0,0055 ± 0,0023 | 0,0059 ± 0,0016 |
Tabla 1: Datos cuantitativos para poblaciones de células hematopoyéticas. Media de frecuencia en células vivas de BM de las diferentes poblaciones de células hematopoyéticas analizadas en BM total, endosteal y central y recuento de células por fémur en BM total. Datos mostrados como media ± desviación estándar (DE), n = 4.
| Población celular | Media de frecuencia de células vivas de BM ± SD (n=4) | Media del recuento de células ± DE (n=4) por tibia |
| Ecs | 0,080 ± 0,011 | 4523 ± 1521 |
| CE de tipo H | 0,041 ± 0,006 | 2299 ± 752 |
| CE de tipo L | 0,038 ± 0,005 | 2103 ± 736 |
| MSCs | 0,180 ± 0,048 | 10270 ± 4282 |
Tabla 2: Datos cuantitativos para poblaciones de células del estroma. Media de frecuencia en células vivas de BM y recuentos celulares por tibia para las diferentes poblaciones de células estromales analizadas en BM total. Datos mostrados como media ± desviación estándar (DE), n = 4.
| Población celular | Media de frecuencia de células vivas de BM ± SD (n=4) | Media del recuento de células ± DE (n=4) por tibia |
| Ecs | 0,064 ± 0,006 | 2255 ± 150 |
| aBMECs | 0,041 ± 0,010 | 1419 ± 286 |
| sBMECs | 0,023 ± 0,006 | 819 ± 250 |
Tabla 3: Datos cuantitativos para poblaciones de células endoteliales. Media de frecuencia en células vivas de BM y recuentos celulares por tibia para las diferentes poblaciones de células endoteliales analizadas en BM total. Datos mostrados como media ± desviación estándar (DE), n = 4.
Cuadro complementario 1: Detalles de los animales utilizados en el estudio. Cepa, sexo, edad y peso de los animales utilizados para producir los datos que se muestran en la Figura 1, Figura 2 y Figura 3 y Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3. Abreviatura: g = gramos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Si bien el protocolo descrito es simple y fácil de realizar, se debe prestar especial atención a los pasos específicos. Por ejemplo, al obtener BM enjuagado (paso 5.2), no se debe exceder el volumen o el número de veces indicado para pasar PBS 2% FBS a través del interior de la parte central del hueso, ya que esto podría resultar en una contaminación significativa de la muestra enjuagada por poblaciones de células endosteal.
Se pueden hacer alteraciones al protocolo para facilitar su ejecución por parte del investigador. En la extracción de muestras (sección 2), las patas y/o los huesos pueden almacenarse en PBS 2% FBS a 4 °C durante un máximo de 24 h antes de proceder al procesamiento y análisis de la muestra. Sin embargo, este tiempo debe minimizarse cuando sea posible. Durante la incubación con cóctel de tinción primaria HSC (paso 3.10) y cóctel de tinción secundaria (paso 3.11), mientras se indica una incubación de 15 minutos a RT, esto puede cambiarse por una incubación de 30 minutos a 4 °C.
Lo mismo se aplica a la incubación con cóctel de tinción primaria estromal (paso 4.7), solución de tinción secundaria estromal (paso 4.8), cóctel de tinción CE (paso 4.12) e incubación con anticuerpos para CCE (paso 6.5); mientras que se indica una incubación de 15 minutos a RT, esto puede cambiarse por una incubación de 30 minutos a 4 °C.
Recientemente se describió otro protocolo para el aislamiento de BM por centrifugación de huesos largos murinos21. Si bien este protocolo presenta la ventaja de un aislamiento más rápido de las células BM, el protocolo descrito aquí permite el análisis de las poblaciones celulares que residen en diferentes áreas de los huesos.
Una limitación particular del método actual es que se basa únicamente en el análisis fenotípico por citometría de flujo. Esto es particularmente relevante en el caso de las CSS, que requerirían una mayor validación funcional. Sin embargo, este método puede combinarse con la clasificación de poblaciones enriquecidas y el estudio de estas células en ensayos de reconstitución a largo plazo y ensayos de colonias in vitro .
En cuanto al análisis de células estromales, en particular las MSC y las CE, se ha demostrado previamente que, a pesar de la optimización del procesamiento de BM para el análisis de citometría de flujo, un número significativo de células no están aisladas del tejido y existe una cuantificación subóptima de estas células en comparación con otros métodos, como la imagen de montaje completo19. Sin embargo, la citometría de flujo es extremadamente útil para realizar el análisis cuantitativo y cualitativo de BM ECs y MSCs y para aislarlos prospectivamente para ensayos funcionales y de expresión.
Otra limitación del método actual es el uso de una técnica mecánica para separar las fracciones endosteal y central, que en cierta medida están inevitablemente contaminadas por células del otro compartimento. Sin embargo, la cuantificación de aBMECs y sBMECs como se explica en la sección de resultados representativos muestra que el aislamiento mecánico es un método robusto para enriquecer las poblaciones celulares en estas áreas.
El método descrito permite el estudio de la hematopoyesis en diferentes entornos y nichos estromales de las HSPC. El análisis fenotípico aquí presentado puede ser útil para estudiar nichos de HSPC cuando se combina con mutantes específicos de ratón, a saber, líneas EC y MSC Cre que permiten la manipulación selectiva de la expresión génica en estas poblaciones. Por ejemplo, las líneas Cdh5(PAC)-CreERT222 y LepR-Cre23 se pueden utilizar para inducir la expresión de ciertos genes de forma selectiva en CE y MSCs, respectivamente. El método es útil para estudiar su impacto en el compartimiento estromal así como en las HSPC. Las líneas de Cre disponibles para estudiar el nicho vascular de BM han sido revisadas recientemente en Mosteo et al.5. El estudio prospectivo de LT-HSC sin trasplante se ha visto limitado por la falta de líneas de reporteros sólidas. Sin embargo, se ha demostrado que el recientemente descrito Mds1GFP/+Flt3Cre 6 logra un alto enriquecimiento de LT-HSC y una buena discriminación de los progenitores aguas abajo que expresan Flt324. La combinación de esta línea de ratón y otras cepas hematopoyéticas, como Vav-iCre25, con citometría de flujo permitirá el estudio de las HSPCs y su relación con el nicho. Las neoplasias hematológicas se asocian frecuentemente a la interrupción de la hematopoyesis desde las etapas más tempranas, lo que se refleja en la alteración de las frecuencias de las células madre y progenitoras hematopoyéticas y de las poblaciones estromales9 que aquí hemos presentado para C57Bl/6 sanos. Los estudios futuros deberían explorar la aplicación de métodos similares al aquí descrito utilizando nuevos equipos basados en citometría de flujo espectral que permita una caracterización fenotípica más extensa a través del análisis de más marcadores (por encima de 30 simultáneamente).
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
LM fue apoyado por una subvención del Lady Tata Memorial Trust. JR fue apoyado por una beca de doctorado de la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT; Beca FCT UI/BD/150833/2021). ML fue apoyado por una beca de doctorado de FCT (FCT fellowship 2021.04773.BD). DD fue apoyado por subvenciones de la Sociedad Americana de Hematología, la Fundación Pablove, FCT (EXPL / MED-ONC / 0522 / 2021) y la Sociedad Portuguesa de Hematología. Catarina Meireles y Emilia Cardoso de TRACY facility en i3s.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD54/ICAM-1 antibody | BioLegend | 116114 | |
| APC Streptavidin | BioLegend | 405207 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) antibody | BioLegend | 105826 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 antibody | BioLegend | 103116 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116223 | |
| Biotin anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100304 | |
| Biotin anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100404 | |
| Biotin anti-mouse CD8a antibody | BioLegend | 100704 | |
| Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | BioLegend | 108404 | |
| Biotin anti-mouse TER-119/erythroid cells antibody | BioLegend | 116204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD11b antibody | BioLegend | 101204 | |
| Biotin anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | BioLegend | 103204 | |
| Brilliant Violet 510 anti-mouse CD150 (SLAM) antibody | BioLegend | 115929 | |
| Calibrite 2 Color Beads | BD Biosciences | 349502 | |
| Collagenase IV | Merck Life Science | C1889 | |
| Dispase II | Merck Life Science | D4693 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| Mouse Leptin R Biotinylated Antibody | R&D systems | BAF497 | |
| NucBlue Fixed Cell Reagent (DAPI) | ThermoFisher Scientific | R37606 | DAPI reagent |
| PE anti-mouse endomucin antibody | ThermoFisher Scientific | 12-5851-82 | |
| PE anti-mouse Flk2 (CD135) | ThermoFisher Scientific | 12-1351-82 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD31 antibody | BioLegend | 102524 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD48 antibody | BioLegend | 103424 | |
| PerCP anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) antibody | BioLegend | 108122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablets | Merck Life Science | P4417 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 antibody | BioLegend | 101302 | |
| RBC lysis buffer 10x | BioLegend | 420302 | |
| Zombie Violet Fixable Viability Dye | BioLegend | 423114 | fluorescent dye |
References
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