Isolering och karakterisering av den naturliga mikrobiotan i modellen Nematode Caenorhabditis elegans
Summary
Caenorhabditis elegans är en av de viktigaste modellarterna inom biologi, men nästan all forskning utförs i avsaknad av dess naturligt associerade mikrober. De metoder som beskrivs här kommer att bidra till att förbättra vår förståelse för mångfalden av associerade mikrober som grund för framtida funktionell C. elegans-forskning.
Abstract
Nematoden Caenorhabditis elegans interagerar med en stor mångfald av mikroorganismer i naturen. I allmänhet finns C. elegans vanligtvis i ruttna växtmaterial, särskilt ruttna frukter som äpplen eller på komposthögar. Det är också förknippat med vissa ryggradslösa värdar som sniglar och trälök. Dessa livsmiljöer är rika på mikrober, som fungerar som mat för C. elegans och som också ihållande kan kolonisera nematoden tarmen. Hittills är den exakta mångfalden och konsistensen hos den inhemska C. elegans-mikrobioten över livsmiljöer och geografiska platser inte helt förstådd. Här beskriver vi ett lämpligt tillvägagångssätt för att isolera C. elegans från naturen och karakterisera maskarnas mikrobiota. Nematoder kan lätt isoleras från kompostmaterial, ruttnande äpplen, sniglar eller lockas genom att placera äpplen på komposthögar. Den bästa tiden för att hitta C. elegans på norra halvklotet är från september till november. Ormar kan tvättas ur uppsamlat substratmaterial genom att nedsänka substratet i buffertlösning, följt av insamling av nematoder och deras överföring till nematodtillväxtmedium eller PCR-buffert för efterföljande analys. Vi illustrerar vidare hur proverna kan användas för att isolera och rena de maskassocierade mikroorganismerna och för att bearbeta maskar för 16S ribosomal RNA-analys av mikrobiotasamhällets sammansättning. Sammantaget kan de beskrivna metoderna stimulera ny forskning om karakterisering av C. elegans-mikrobiotan över livsmiljöer och geografiska platser, vilket bidrar till att få en omfattande förståelse för mångfalden och stabiliteten hos nematodens mikrobiota som grund för framtida funktionell forskning.
Introduction
I naturen finns C. elegans vanligtvis i ruttna växtmaterial, särskilt ruttna frukter som äpplen eller på komposthögar1. Det är också förknippat med vissa ryggradslösa värdar som sniglar och skogslök 2,3. Dessa livsmiljöer är rika på mikrober, som inte bara fungerar som mat för masken, men kan också bilda stabila föreningar med den. Information om mångfalden av naturligt associerade mikroorganismer publicerades först 2016 4,5,6. Sedan dess har dessa och bara några nyare studier avslöjat att C. elegans är associerad med en mängd olika bakterier och svampar, oftast inklusive bakterier av släktet Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter och flera andra 6,7,8. Flera associerade bakterier kan stabilt kolonisera masktarmen, men inte alla 6,9,10,11,12. De kommer sannolikt att vara av avgörande betydelse för vår förståelse av C. elegans biologi eftersom de kan ge näring, skydda mot patogener och eventuellt andra stressfaktorer och påverka centrala livshistoriska egenskaper som reproduktionshastighet, utveckling eller beteendemässiga svar.
Som ett exempel kan naturligt associerade isolat av släktena Pseudomonas, Ochrobactrum och även Enterobacter eller Gluconobacter skydda masken från patogeninfektion och dödande på olika sätt 5,6,11,13,14. Ett specifikt isolat av släktet Comamonas påverkar nematodens kostrespons, utveckling, livslängd och fertilitet15,16,17. Providencia-bakterier producerar neuromodulatortyramin och modulerar därmed värdens nervsystemaktivitet och resulterande beteendemässiga svar18. En uppsättning olika naturligt associerade bakterier visade sig påverka befolkningstillväxt, fertilitet och beteendemässiga svar 5,6,9,11,19.
Hittills är den exakta mångfalden och konsistensen hos den inhemska C. elegans-mikrobioten över livsmiljöer och geografiska platser inte helt förstådd, och ytterligare föreningar mellan masken och mikroberna från dess miljö återstår att avslöja. Flera tidigare studier använde bakteriestammar isolerade från någon markmiljö, naturliga C. elegans-livsmiljöer eller från mesokosmexperiment (dvs. laboratoriebaserade miljöer som återskapar naturliga livsmiljöer) med C. elegans laboratoriestammar 4,5,20. Även om dessa studier fick nya insikter om mikrobernas påverkan på specifika nematodegenskaper (t.ex. nematodmetabolism21), är relevansen av dessa interaktioner för C. elegans biologi i naturen oklar. Därför beskriver detta manuskript metoderna för att direkt isolera C. elegans från naturen och att isolera och därefter karakterisera de naturligt associerade mikroberna från både enskilda maskar och grupper av maskar. De beskrivna metoderna är en uppdaterad och förbättrad version av de procedurer som tidigare använts för isolering och karakterisering av naturliga C. elegans och dess ursprungliga mikrobiota 2,6,7. Med tanke på att C. elegans finns i stor utsträckning i sönderdelande växtmaterial över hela världen (särskilt i ruttnande frukter, tempererade regioner och på hösten)1,2,22,23,24,25, kan detta protokoll tillämpas av alla laboratorier när det finns intresse för att relatera C. elegans egenskaper till naturligt associerade mikrober och därmed ett mer naturligt relevant sammanhang. Det senare är avgörande för en fullständig förståelse av nematodens biologi eftersom det är känt från en mångfald av andra värdsystem att den associerade mikrobiotan kan påverka olika livshistoriska egenskaper26, en aspekt som för närvarande till stor del försummas i mängden C. elegans-studier inom nästan alla life science-discipliner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nematoden Caenorhabditis elegans är en av de mest intensivt studerade modellorganismerna inom biologisk forskning. Det introducerades av Sydney Brenner på 1960-talet, ursprungligen för att förstå nervsystemets utveckling och funktion29. Sedan dess har C. elegans blivit en kraftfull modell för att studera grundläggande processer inom alla biologiska discipliner, inklusive beteendebiologi, neurobiologi, åldrande, evolutionsbiologi, cellbiologi, utvecklingsbiologi och immuno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner ekonomiskt stöd från den tyska vetenskapsstiftelsen (projekt A1.1 och A1.2 från Collaborative Research Center 1182 om metaorganismernas ursprung och funktion). Vi tackar medlemmarna i Schulenburg-labbet för deras råd och stöd.
References
- Schulenburg, H., Félix, M. -. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors. BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).
- Petersen, C., et al. Travelling at a slug’s pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes. BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response. Cell. 153 (1), 253-266 (2013).
- Watson, E., et al. Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits. Cell. 156 (4), 759-770 (2014).
- MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
- O’Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
- Snoek, B. L., et al. A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits. BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).
- Avery, L., Shtonda, B. B. Food transport in the C. elegans pharynx. Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).
- Zhang, J., et al. A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development. Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).
- Petersen, C., et al. Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations. Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).
- Félix, M. -. A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).
- Barrière, A., Félix, M. -. A. Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations. Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).
- Dolgin, E. S., Félix, M. -. A., Cutter, A. D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).
- Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).
- Barrière, A., Félix, M. -. A. Isolation of C. elegans and related nematodes. WormBook. , 1-19 (2014).
- Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Crombie, T. A., et al. Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands. Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).
- Haber, M. Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding. Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).
- Watson, E., et al. Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans. eLife. 5, 17670 (2016).
