साल्मोनेला आंतों के उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला-विशिष्ट रिक्तिकाओं में और साइटोसोल (हाइपर-प्रतिकृति) में मुक्त होता है। इमेजजे के माध्यम से दो पूरक छवि विश्लेषणों द्वारा साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप को निर्धारित करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन और स्कोरिंग तक पहुंचता है।
साल्मोनेला एक एंटरिक रोगज़नक़ है जो आंतों के उपकला पर आक्रमण करने और एंटरोसाइट्स में प्रतिकृति करने में सक्षम है, दोनों साल्मोनेला-विशिष्ट रिक्तिकाओं के अंदर और साइटोसोल (साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति) में मुक्त। इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति के ये अलग-अलग फेनोटाइप रोगजनन के विभिन्न मार्गों को ड्राइव करते हैं, यानी, साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति आंत लुमेन में भड़काऊ कोशिका मृत्यु और एक्सट्रूज़न को प्रेरित करती है, जबकि वैक्यूलर प्रतिकृति ट्रांस-एपिथेलियम प्रवेश और प्रणालीगत प्रसार की ओर ले जाती है। आक्रमण की गई कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए माइक्रोस्कोपी उपकरण बनाने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास किए गए थे, जैसे कि पीपीएआर-डुओ फ्लोरेसेंस रिपोर्टर प्लास्मिड जो एमचेरी और जीएफपी की अंतर अभिव्यक्ति द्वारा वैक्यूलर और साइटोसोलिक बैक्टीरिया के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। हालांकि, इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप्स को अक्सर मैन्युअल रूप से स्कोर किया जाता है, एक समय लेने वाली प्रक्रिया जो विश्लेषण को नमूनों और कोशिकाओं की एक छोटी संख्या तक सीमित करती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, इमेजजे, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दो पूरक और स्वचालित छवि विश्लेषण विकसित किए गए थे। उच्च-थ्रूपुट प्रोटोकॉल में, उपकला कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों का उपयोग करके पीपीएआर-डुओ ले जाने वाले साल्मोनेला से संक्रमित किया गया था। इमेजिंग एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किया गया था। फिर, विभिन्न विस्तार स्तरों पर साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर व्यवहार को मापने के लिए दो छवि विश्लेषण विधियों को लागू किया गया था। पहली विधि समग्र इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल लोड और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति की सीमा को मापती है। यह तेज है और उच्च संख्या में कोशिकाओं और नमूनों के स्कोरिंग की अनुमति देता है, जिससे यह स्क्रीनिंग प्रयोगों जैसे उच्च-थ्रूपुट परख के लिए उपयुक्त हो जाता है। दूसरी विधि संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत, साल्मोनेला के औसत वैक्यूलर लोड और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति दर को निर्धारित करने के लिए एकल-कोशिका विश्लेषण करती है जो उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला व्यवहार के बारे में अधिक विवरण देती है। प्रोटोकॉल को विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए इमेजजे स्क्रिप्ट द्वारा किया जा सकता है ताकि साल्मोनेला-एंटरोसाइट इंटरैक्शन के प्रमुख चरणों के बैच विश्लेषण स्वचालित रूप से चलाए जा सकें।
साल्मोनेला यूरोपीय संघ1 में खाद्य जनित बीमारी के प्रकोप का कारण बनने वाला सबसे अधिक बार रिपोर्ट किया गया जीवाणु एजेंट है। साल्मोनेला संक्रमण की प्राथमिक रोग संबंधी अभिव्यक्ति आंत्रशोथ है, जो अंतर्ग्रहण के बाद आंत में रोगज़नक़ व्यवहार और परिणामस्वरूप स्थानीय भड़काऊ प्रतिक्रियाका परिणाम है। हालांकि, साल्मोनेला अतिरिक्त आंतों की साइटों पर भी फैल सकता है और प्रणालीगत संक्रमण का कारण बन सकता है, खासकर इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड व्यक्तियों में। साल्मोनेला और आंतों के उपकला के बीच बातचीत का प्रकार संक्रमण के परिणाम की स्थिति बनाता है। एक बार आंत लुमेन में, साल्मोनेला आंतों के उपकला कोशिकाओं के अंदर आक्रमण करता है और प्रतिकृति करता है। इंट्रासेल्युलर स्तर पर, साल्मोनेला दो अलग-अलग प्रतिकृति फेनोटाइप, साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति और साल्मोनेला युक्त रिक्तिकाओं (एससीवी) के भीतर इंट्रावाक्यूलर धीमी प्रतिकृति पेश कर सकता है। साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति आंत लुमेन 3 में भड़काऊ मेजबान कोशिका मृत्यु और साल्मोनेला एक्सट्रूज़न को प्रेरित करतीहै; वैक्यूलर प्रतिकृति एक ट्रांस-एपिथेलियम प्रवेश और प्रणालीगत प्रसारकी ओर ले जाती है। इसलिए, आक्रमण और वैक्यूलर बनाम साइटोसोलिक प्रतिकृति की सीमा संक्रमण के पाठ्यक्रम को प्रभावित करती है।
जीनस साल्मोनेला बहुत विविध है, जिसमें विभिन्न मेजबान-श्रेणियों और बीमारी पैदा करने की क्षमताओं वाले हजारों सीरोटाइप शामिल हैं। उदाहरण के लिए, एस। टाइफिमुरियम को एक सामान्यवादी सेरोवर के रूप में परिभाषित किया गया है, क्योंकि यह कई असंबंधित मेजबानों को संक्रमित करता है, और मानव साल्मोनेलोसिस के प्रमुख कारणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। अलग तरह से, एस। डर्बी को सूअर-अनुकूलित सेरोवर माना जाता है, क्योंकि यह ज्यादातर सूअर से अलग होता है, लेकिन यह मानव संक्रमणके लिए जिम्मेदार सेरोवार के शीर्ष पांच में भी बताया जाता है। हालांकि, उपकला कोशिकाओं के अंदर जीवाणु व्यवहार के बारे में ज्ञान अनिवार्य रूप से कुछ संदर्भ उपभेदों के अध्ययन तक सीमित है, जैसा कि एस। टाइफिमुरियम एसएल 1344, जो साल्मोनेला रोगजनकता की विशाल प्राकृतिक विविधता का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। उपकला कोशिकाओं के साथ साल्मोनेला के विभिन्न उपभेदों की बातचीत को चिह्नित करना उनकी विभिन्न रोगजनकता को समझने में योगदान देगा। इस कारण से, एक तेज और बड़े पैमाने पर स्वचालित तरीके से बड़ी संख्या में उपभेदों के इंट्रासेल्युलर व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी-आधारित प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, उपकला कोशिकाओं का संक्रमण 96-वेल इमेजिंग प्लेटों में किया गया था और एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि अधिग्रहण किया गया था। पीपीएआर-डुओ प्लास्मिड का उपयोग फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी5 के माध्यम से उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला के आक्रमण और प्रतिकृति फेनोटाइप का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। यह प्लास्मिड लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर एमचेरी को एन्कोडिंग करने वाले जीन को वहन करता है, जो सभी रूपांतरित जीवाणु कोशिकाओं द्वारा संवैधानिक रूप से व्यक्त किया जाता है, और जीन एन्कोडिंग ग्रीन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीएफपी, जिसकी अभिव्यक्ति विशेष रूप से यूकेरियोटिक कोशिकाओं के साइटोसोल में मौजूद ग्लूकोज -6-फॉस्फेट द्वारा सक्रिय होती है और एससीवी में अनुपस्थित होती है। इसलिए, प्लास्मिड एमचेरी और जीएफपी संवाददाताओं की अंतर अभिव्यक्ति द्वारा वैक्यूलर और साइटोसोलिक बैक्टीरिया के बीच भेदभाव की अनुमति देता है।
माइक्रोस्कोपी छवियों पर वैक्यूलर और साइटोसोलिक बैक्टीरिया को आमतौर पर मैन्युअल स्कोरिंग6 द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन यह एक समय लेने वाली विधि है जो विश्लेषण को नमूनों की एक छोटी संख्या तक सीमित करती है। इसलिए, दो पूरक और स्वचालित छवि विश्लेषण विकसित किए गए थे- क्षेत्र विश्लेषण और एकल-सेल विश्लेषण-इमेजजे7, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके। क्षेत्र विश्लेषण प्रत्येक अधिग्रहित माइक्रोस्कोपी छवि में उपकला कोशिकाओं, लाल और हरे साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्रों के डेटा का उपयोग करके समग्र इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल लोड और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति की सीमा को मापता है । इस विधि को कम आवर्धन पर प्राप्त छवियों पर लागू किया जा सकता है; इसलिए, यह कुछ छवियों के साथ उपकला कोशिकाओं की एक उच्च संख्या को स्कोर करने की अनुमति देता है, जिससे अधिग्रहण का समय कम हो जाता है। एकल-कोशिका विश्लेषण संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत, औसत वैक्यूलर लोड और एकल-कोशिका संकल्प के साथ साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति से गुजरने वाली संक्रमित कोशिकाओं के प्रतिशत को निर्धारित करने के लिए सेल विभाजन का उपयोग करता है।
इस प्रोटोकॉल में, छवि विश्लेषण के सभी चरणों को मैन्युअल रूप से किए जाने के लिए विस्तार से वर्णित किया गया है, लेकिन एक ही विश्लेषण हमारे विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए इमेजजे स्क्रिप्ट द्वारा स्वचालित किया जा सकता है। ये स्क्रिप्ट कई छवियों का स्वचालित रूप से विश्लेषण करने के लिए बैच विश्लेषण चलाने की अनुमति देती हैं और इस प्रकार विधि के निष्पादन को गति देती हैं।
जिस तरह से साल्मोनेला आंतों के उपकला कोशिकाओं को उपनिवेशित करता है, संक्रमण के परिणाम को प्रभावित करता है। आक्रमण पर, साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति आंत3 की सूजन को प्रेरित करती है, जबकि वैक्यूलर प्रतिकृति प्रणालीगत प्रसार 4 का कारण बन सकतीहै। साल्मोनेला उपभेद आंतों के उपकला कोशिकाओं के अंदर आक्रमण करने और दोहराने की उनकी क्षमता में भिन्न होसकते हैं। दरअसल, साल्मोनेला एक अत्यंत विविध जीनस है जिसमें 2,500 सेरोवार शामिल हैं, जिनमें बीमारी पैदा करने की अलग-अलग क्षमताएं हैं। इसके अलावा, साल्मोनेला यूरोपीय संघ में खाद्य जनित प्रकोपों का सबसे अधिक बार रिपोर्ट किया जाने वाला कारण है, जो मानव आबादी में एक बड़े प्रसार का संकेत देताहै। इसलिए, साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप्स की मात्रा का परिमाणीकरण के लिए विश्वसनीय, उच्च-थ्रूपुट विधियों की उपलब्धता बड़ी संख्या में साल्मोनेला उपभेदों के बीच विषाणु में अंतर का मूल्यांकन करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है और अंततः इस रोगज़नक़ के सटीक और तनाव-विशिष्ट जोखिम मूल्यांकन की अनुमति देती है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक तेज और स्वचालित तरीके से उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला के व्यवहार को मापता है। उपकला कोशिकाओं का संक्रमण 96-वेल इमेजिंग माइक्रोप्लेट में किया जाता है और छवि अधिग्रहण के लिए एक स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है, जिससे प्रोटोकॉल उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हो जाता है। यह प्रोटोकॉल पीपीएआर-डुओ प्लास्मिड का लाभ उठाता है, जो दो फ्लोरोसेंटरिपोर्टरों 5 की अंतर अभिव्यक्ति के माध्यम से साइटोसोलिक साल्मोनेला से वैक्यूलर को अलग करने की अनुमति देता है। साल्मोनेला के इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप्स का विश्लेषण अक्सर मैनुअल स्कोरिंग द्वारा किया जाता है, एक समय लेने वाली प्रक्रिया जो प्रति तनाव बड़ी संख्या में उपभेदों और सेल संस्कृतियों के विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त है और ऑपरेटर की त्रुटियों और अंतर-ऑपरेटर भिन्नता से ग्रस्त है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, दो पूरक और स्वचालित छवि विश्लेषण विकसित किए गए थे, क्षेत्र विश्लेषण और एकल-सेल विश्लेषण। इमेजजे, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर, का उपयोग दो विश्लेषणों को विकसित करने के लिए किया गया था। प्रोटोकॉल निष्पादन में तेजी लाने के लिए, बिना किसी ऑपरेटर हस्तक्षेप के कई अधिग्रहण फ़ाइलों के बैच विश्लेषण के लिए इमेजजे स्क्रिप्ट पूरक फ़ाइलों के रूप में प्रदान की जाती हैं।
क्षेत्र विश्लेषण को कुछ चरणों में, उपकला कोशिकाओं (संक्रमण अनुपात) और हाइपर-प्रतिकृति स्तर (हाइपर-प्रतिकृति अनुपात) के समग्र उपनिवेशीकरण को विशेष रूप से उपकला कोशिकाओं के नाभिक द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्रों के माप के माध्यम से और साल्मोनेला द्वारा जीएफपी के साथ मिलकर एमचेरी या एमचेरी को व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। क्षेत्र विश्लेषण कम आवर्धन पर प्राप्त छवियों पर लागू होता है, जहां वैक्यूलर और हाइपर-रेप्लिक्टिंग साल्मोनेला दोनों एक ही जेड-प्लेन में फोकस में होते हैं, और बड़ी संख्या में उपकला कोशिकाओं को प्रति सूक्ष्म क्षेत्र में प्रदर्शित किया जाता है, जिससे अधिग्रहण फ़ाइलों का आकार और संख्या कम हो जाती है। क्षेत्र विश्लेषण बड़ी संख्या में नमूनों के स्वचालित, तेज और कम्प्यूटेशनल रूप से हल्के विश्लेषण की अनुमति देता है, जिससे यह स्क्रीनिंग प्रयोगों जैसे उच्च-थ्रूपुट परख के लिए उपयुक्त हो जाता है।
एकल-कोशिका विश्लेषण को एकल-कोशिका संकल्प के साथ उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला फेनोटाइप्स को निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जो सेल विभाजन और सेलुलर क्षेत्र के माप और वैक्यूलर और साइटोसोलिक हाइपर-प्रतिकृति साल्मोनेला द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र के प्रतिशत के माध्यम से प्राप्त किया गया था। क्षेत्र विश्लेषण के माध्यम से विशेषता वाले उपकला कोशिकाओं के समग्र उपनिवेशीकरण को यहां तीन मात्रात्मक मापदंडों में विभाजित किया गया है, संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत, औसत वैक्यूलर लोड, और हाइपर-प्रतिकृति दर, जिससे समग्र उपनिवेशीकरण के लिए प्रत्येक फेनोटाइप के योगदान का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति मिलती है, इसलिए, क्षेत्र विश्लेषण के परिणामों का पूरक है। एकल-सेल विश्लेषण द्वारा पेश किए गए अधिक विवरण धीमी छवि अधिग्रहण और विश्लेषण की कीमत पर आते हैं। वास्तव में, एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए, छवि अधिग्रहण उच्च आवर्धन पर किया जाता है। इसका तात्पर्य यह है कि फोकस में वैक्यूलर और साइटोसोलिक साल्मोनेला दोनों का निरीक्षण करने के लिए कई जेड-प्लेन की आवश्यकता होती है और यह कि उपकला कोशिकाओं की उच्च संख्या को स्कोर करने के लिए प्रति नमूना बड़ी संख्या में क्षेत्रों के अधिग्रहण की आवश्यकता होती है, इस प्रकार क्षेत्र विश्लेषण की तुलना में अधिग्रहण समय का विस्तार होता है। इसके अलावा, कई बड़ी अधिग्रहण फ़ाइलों का विश्लेषण कम्प्यूटेशनल रूप से मांग कर रहा है, इस प्रकार एक उपयुक्त वर्कस्टेशन की आवश्यकता होती है (एक 6-कोर, 32 जीबी रैम वर्कस्टेशन का उपयोग किया गया था)। इसलिए, एकल-कोशिका विश्लेषण का उपयोग सीमित थ्रूपुट स्थितियों में स्टैंड-अलोन के रूप में या उपकला कोशिकाओं के अंदर साल्मोनेला फेनोटाइप की गहरी समझ हासिल करने के लिए क्षेत्र विश्लेषण के साथ युग्मित दूसरे स्तर की विधि के रूप में किया जा सकता है।
दो पूरक विश्लेषणों को एस का उपयोग करके मान्य किया गया था। टीएम, एस। डर्बी डब्ल्यूटी, और एस। डर्बी सिपा, क्योंकि उपकला कोशिकाओं के अंदरउनका व्यवहार पहले से ही आक्रमण या प्रतिकृति 9,10 के संदर्भ में भिन्न होने के लिए जाना जाता था। क्षेत्र और एकल-कोशिका विश्लेषण के परिणाम बताते हैं कि प्रोटोकॉल ने परीक्षण किए गए उपभेदों की विशेषताओं के अनुसार इंट्रासेल्युलर साल्मोनेला फेनोटाइप्स में अंतर को मात्रात्मक रूप से अलग करने की अनुमति दी। इसके अलावा, इन परिणामों से पता चलता है कि एकल-कोशिका विश्लेषण क्षेत्र विश्लेषण का उपयोग करके स्कोर किए गए समग्र उपनिवेशीकरण के लिए प्रत्येक इंट्रासेल्युलर फेनोटाइप (आक्रमण, वैक्यूलर लोड और साइटोसोलिक प्रतिकृति) के योगदान का परिमाणीकरण करने की अनुमति देता है।
यह प्रोटोकॉल साल्मोनेला के विभिन्न उपभेदों के इन विट्रो रोगजनकता का अध्ययन करने के लिए यहां लागू किया गया था, लेकिन इसमें अन्य अनुप्रयोग हो सकते हैं जैसे कि उपकला कोशिकाओं के अंदर आक्रमण और / या प्रतिकृति में शामिल जीन की पहचान करने के लिए यादृच्छिक उत्परिवर्ती का अध्ययन। इसके अलावा, प्रोटोकॉल को आईएनटी 407 कोशिकाओं की तुलना में अन्य सेल लाइनों के अंदर साल्मोनेला के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसका उपयोग अन्य इंट्रासेल्युलर सूक्ष्मजीवों के सेल-रोगज़नक़ इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए समान तरीकों को विकसित करने के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में भी किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
ओलिविया स्टील-मोर्टिमर को पीपीएआर-डुओ प्लास्मिड साझा करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था, पीआरसी 2019014 और पीआरसी 2021004 अनुदान।
96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |