Transplantation af humane pluripotente stamcelleafledte GABAergiske neuroner genereret af neuronal programmering kan være en potentiel behandlingsmetode for neuroudviklingsforstyrrelser. Denne protokol beskriver generering og transplantation af humane stamcelleafledte GABAergiske neuronale forstadier i hjernen hos neonatale mus, hvilket muliggør langsigtet undersøgelse af podede neuroner og evaluering af deres terapeutiske potentiale.
Et reduceret antal eller dysfunktion af hæmmende interneuroner er en almindelig bidragyder til neuroudviklingsforstyrrelser. Derfor er celleterapi ved hjælp af interneuroner til at erstatte eller afbøde virkningerne af ændrede neuronale kredsløb en attraktiv terapeutisk vej. Til dette formål er der behov for mere viden om, hvordan humane stamcelleafledte GABAergic interneuron-lignende celler (hdIN’er) modnes, integreres og fungerer over tid i værtskredsløbet. Af særlig betydning i neuroudviklingsforstyrrelser er en bedre forståelse af, om disse processer i transplanterede celler påvirkes af en udviklende og modnet værtshjerne. Den nuværende protokol beskriver en hurtig og yderst effektiv generering af hdIN’er fra humane embryonale stamceller baseret på transgen ekspression af transkriptionsfaktorerne Ascl1 og Dlx2. Disse neuronale forstadier transplanteres ensidigt efter 7 dage in vitro til hippocampus hos neonatale 2-dages gamle mus. De transplanterede neuroner spredes i ipsi- og kontralateral hippocampus af en musemodel af kortikal dysplasi-fokal epilepsisyndrom og overlever i op til 9 måneder efter transplantationen. Denne tilgang gør det muligt at undersøge den cellulære identitet, integration, funktionalitet og terapeutiske potentiale af transplanterede interneuroner over længere tid i udviklingen af sunde og syge hjerner.
Etablering, modning og forfining af neuronale netværk forekommer i den perinatale og tidlige postnatale periode og represe et afgørende tidsvindue for hjernens udvikling1. Fra en overflod af forbindelse efter fødslen udvikler hjernen sig til en finjustering af forbindelser, der strækker sig indtil ungdomsårene2. Derfor definerer ændringer i gener udtrykt i disse perioder såvel som eksterne faktorer eller fornærmelser en persons disposition for flere neuroudviklingsforstyrrelser. Svækkelser i kognition og motorisk funktion udfolder sig over tid, og farmakologiske behandlinger er begrænsede, de fleste er rettet mod symptomer med risiko for alvorlige bivirkninger.
Dysfunktion i gamma-aminosmørsyre (GABA) ergisk hæmning har vist sig at være en stor bidragyder til den underliggende årsag til forskellige neuroudviklingsforstyrrelser3, såsom skrøbeligt X syndrom, Angelman syndrom, epilepsi, skizofreni, og autisme. GABA er den vigtigste hæmmende transmitter i centralnervesystemet og er medvirkende til at opretholde excitatorisk / hæmmende (E / I) balance, synkronisering af neuronal fyring og beregning. GABAergiske interneuroner er en heterogen population af neuroner, med stigende funktionel forvikling i mere komplekse hjerneområder4 og med evolution 5,6. I betragtning af den begrænsede endogene regenerative kapacitet i den menneskelige hjerne og implikationen af interneuron dysfunktion i flere neurologiske lidelser, kan transplantationen af GABAergic interneuroner være en lovende terapeutisk vej at udforske. På denne linje synes humane stamcelleafledte GABAergiske interneuronlignende celler (hdIN’er) at være den mest translationelle og levedygtige kilde til dette formål sammenlignet med gnaverallogene neuronale prækursorer eller andre kilder, der anvendes andre steder7. Protokoller til generering af GABAergiske neuroner fra forskellige cellekilder er tilgængelige 8,9,10,11,12,13, men der kræves mere viden om, hvordan hdIN’er modnes, integreres og fungerer over tid i en udviklende patologisk hjerne. Flere undersøgelser har identificeret ændringer i gener, der er aktive under kortikal mønsterdannelse, etablering af neuronal forbindelse14 og tuning af fysiologisk E / I-balance15. Neonatal transplantation af hdIN’er til musemodeller med tilsvarende genetiske forstyrrelser giver os mulighed for at følge samspillet mellem vært og transplantat, hvilket er viden, der er nødvendig for at bestemme potentielle terapeutiske strategier.
Immunmodulation anvendes almindeligvis og med succes i xenografttransplantationer for at undgå at udløse et værtsimmunrespons og afvisning16. Administrationen af immunsuppressive lægemidler, såsom cyclosporin A, forårsager imidlertid nyretoksicitet efter kronisk administration, er arbejdskrævende på grund af behovet for daglige intraperitoneale injektioner for at opnå stabile systemiske koncentrationer, hvilket forårsager dyrestress17 og har off-target effekter, der kan interagere med patologi18. Derudover har kompromittering af immunsystemet vist sig at ændre adfærdsmæssige fænotyper19 med ændringer i de tilsvarende neuroanatomiske regioner20. Transplantation i den første uge af livet har vist sig at give mulighed for tilpasning til transplanterede celler 21,22, mens andre har rapporteret indledende overlevelse efterfulgt af afvisning af transplantaterne inden for den første postnatale måned 23,24.
Denne protokol beskriver procedurer fra hdIN-generation til celletransplantation hos neonatale mus, hvilket resulterer i langsigtet graftoverlevelse og giver mulighed for undersøgelse af neuronal specificitet, synaptisk integration, funktion og terapeutisk potentiale hos transplanterede humane interneuroner under fysiologisk og patologisk udvikling.
Den nuværende protokol beskriver en robust, hurtig, enkel og bredt tilgængelig metode til at generere hdIN-prækursorer in vitro og dens anvendelse som tidlig interventionel celleterapi i prækliniske modeller af neuroudviklingsforstyrrelser.
Selvom nogle af de karakteristiske fænotyper af neuroudviklingsforstyrrelser opstår i ungdomsårene eller voksenalderen, er patofysiologiske ændringer allerede til stede under tidlig udvikling. Af denne grund ville tidlig intervention være stærkt berettiget til at opnå gavnlige virkninger ved at handle i kritiske hjerneudviklingsperioder før symptomatologi eller klinisk manifestation. I fremtiden vil genetisk screening og udvikling af biomarkører give profylaktisk eller præsymptomatisk behandling, hvilket repræsenterer en game changer for disse patienter. Derfor blev hdIN-forstadier transplanteret tidligt efter fødslen i Cntnap2 KO-musemodellen, når epileptogene ændringer i neuronalnetværket kan være i gang28 og på et tidspunkt, hvor cellulære ændringer er beskrevet i denne dyremodel29. Det er imidlertid vigtigt at overveje de potentielle faldgruber ved aldersekstrapolering og timingen af visse processer i musen versus den menneskelige hjerne.
Med fokus på selve proceduren er differentieringsprotokollen, der præsenteres her, baseret på brugen af transkriptionsfaktorer, som muliggør hurtig og meget effektiv programmering af stamceller sammenlignet med andre protokoller andre steder baseret på små molekyler10,30. En potentiel ulempe ved denne tilgang kan være kravet om lentivirale vektorer, som indebærer en risiko for insertional mutagenese. To kritiske trin i protokollen er tilsætningen af antibiotika og det anti-mitotiske middel til mediet for at vælge for celler, der udtrykker transkriptionsfaktorerne og eliminere proliferative celler, idet risikoen for henholdsvis teratomdannelse undgås. Selvom kun hdIN-prækursorer blev testet i denne undersøgelse, forventes proceduren at være mulig med andre cellekilder og programmerings- / differentieringsprotokoller. Ikke desto mindre bør andre neuronale undertyper og/eller modeller valideres.
HDIN-forløberens alder for transplantation, 7 DIV, blev besluttet ud fra (i) fraværet af proliferative celler, vurderet ved immunreaktivitet mod Ki67, (ii) sammen med den tidligere rapporterede observation af fald i ekspressionen af pluripotensgener såsom POU5F1 og udseendet af neuronal markør MAP2 og interneuronmarkøren GAD1 på det tidspunkt8 . Det oprindelige arbejde, der beskriver denne protokol, udførte imidlertid transplantationer ved 14 DIV efter DOX-tilbagetrækning9. Dette rejser spørgsmål om, hvorvidt DOX i moderens drikkevand kan nå celler podet i hjernen på ammende hvalpe via mælken, eller om 7 DIV DOX-induktion er nok til at fastslå GABAergic skæbne. Selvom Yang et al. identificerede 14 dages DOX som tilstrækkelig til at generere stabile neuronale celler in vitro9, opdagede Gonzalez-Ramos et al.8 GAD1-genekspression allerede ved 7 DIV, hvilket indikerer, at downstream-aktiveringen af GAD67 af Ascl1 og Dlx2 allerede har fundet sted på dette tidspunkt. Derfor er mønsteret begyndt ved 7 DIV og kan være mindre afhængig af DOX-behandlingen. Desuden indikerer beviser hos gnavere og mennesker tilstedeværelsen af DOX i modermælk 31,32, og de resultater, der præsenteres her, viser, at podede hdIN’er var immunreaktive forAscl1 efter 2 uger og 2 måneder PT og interneuronmarkører senere ved 9 måneder PT. Inden for den podede population, udover PV- og SST-positive neuroner, blev der også fundet andre markører for subpopulationer af interneuroner i lavere mængder, såsom calretinin (CR) og calbindin (CB).
Et udfordrende aspekt af denne procedure er koordineringen af timingen for både differentiering og hvalpenes alder. Normalt tager musens drægtighed 21 dage efter opsætning af parringsburet, omend dette kan variere nogle gange. Dette scenario forekommer ikke, når der udføres celletransplantationer hos voksne gnavere, når alt kan planlægges omhyggeligt og arrangeres. Ikke desto mindre kan dette let afhjælpes ved at oprette to til tre parringsbure med et 2-dages interval eller to til tre differentieringsbatcher med et 2-dages tidsforløb fra hinanden.
Selvom musene, der blev brugt i denne undersøgelse, hverken var immundefekte eller immunsupprimerede, overlevede de transplanterede celler op til 9 måneder in vivo, og markører for immunreaktion mod xenogene celler eller lokal inflammation blev ikke observeret ved hverken P14 eller 2 måneder PT. Immunafstødning af podede xenogene celler udløses mod MHC / peptider, og de vigtigste cellulære mediatorer for graftafstødning er T-lymfocytter og mikroglialceller33, 34. Derfor blev immunreaktivitet over for markører af T-celler såvel som reaktiv microglia undersøgt. Ingen tegn på immunafstødning af de podede celler i værtsvævet blev påvist hverken ved niveauer af reaktiv microglia eller ved tilstedeværelsen af T-lymfocytter i WT-mus ved P14 eller 2 måneder. Desuden blev der ikke observeret nogen lokal inflammation baseret på de vurderede niveauer af astrogliose og inflammatoriske cytokiner. Dette resultat kan delvist være afhængigt af neonatal immuntolerance 35,36,37, observeret af andre celleidentiteter, placeringer og dyremodeller35,38. Englund et al. identificerede regionale forskelle i resultatet af de podede celler med hensyn til migration og modning, herunder observation af podede celler i det tilstødende hvide stof35.
Endelig blev der observeret en større spredning af de podede celler i hippocampus sammenlignet med andre undersøgelser, der transplanterede til voksne gnavere, hvor hdIN’er forblev som en podet kerne25. Denne spredning adskiller sig også fra resultater, der tidligere er observeret af Yang et al.9, hvilket i dette tilfælde kunne forklares af cellernes alder på transplantationstidspunktet.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev finansieret af det svenske forskningsråd (bevillingsnummer: 2016-02605, MA), den svenske hjernefond F02021-0369 (MA), Crafoord Foundation (MA) og Den Europæiske Unions Horizon 2020-program (H2020-MSCA-ITN-2016) under Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network-projektet Training4CRM nr. 722779 (M.K.). Vi er meget taknemmelige for hjælpen fra Andrés Miguez, fra Josep Maria Canals ‘laboratorium (Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Barcelona), til undervisning i stereotaxisk celletransplantation i P2 nyfødte mus, og Mackenzie Howard, gruppeleder ved University of Texas i Austin, for råd og foreløbige koordinater til celletransplantation i hippocampus af P2 nyfødte mus. Vi takker Susanne Geres for at hjælpe med dyrepleje og Ling Cao for hjælpen med forarbejdning af væv, samt studerende, der på den ene eller anden måde har bidraget til undersøgelsen og specifikt Diana Hatamian. Endelig blev nogle af de grafikker, der blev brugt til at illustrere dette papir, oprettet med BioRender.com.
30 G needle | B Braun | 4656300 | |
33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
Cy3 Stretavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium – Transplantation medium |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
Microscope Software | Olympus | CellSens | |
Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement – Stem cell culture medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Pertex | HistoLab | 811 | |
Pipet Filler | |||
Play-Doh | |||
Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
Tweezer | VWR | ||
Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
Xylene | VWR | 28973.363 | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |