Summary
Трансплантация человеческих плюрипотентных ГАМКергических нейронов, полученных из стволовых клеток, генерируемых нейронным программированием, может быть потенциальным подходом к лечению расстройств нервного развития. Этот протокол описывает генерацию и трансплантацию ГАМКергических нейронных предшественников, полученных из стволовых клеток человека, в мозг неонатальных мышей, что позволяет проводить долгосрочное исследование привитых нейронов и оценивать их терапевтический потенциал.
Abstract
Уменьшенное количество или дисфункция ингибирующих интернейронов является распространенным фактором нарушения нервного развития. Поэтому клеточная терапия с использованием интернейронов для замены или смягчения эффектов измененных нейронных цепей является привлекательным терапевтическим направлением. С этой целью необходимо больше знаний о том, как ГАМКергические интернейроноподобные клетки (hdIN), полученные из стволовых клеток человека, созревают, интегрируются и функционируют с течением времени в схеме хозяина. Особое значение при нарушениях нервного развития имеет лучшее понимание того, влияют ли на эти процессы в трансплантированных клетках развивающийся и созревающий мозг хозяина. Настоящий протокол описывает быструю и высокоэффективную генерацию hdIN из эмбриональных стволовых клеток человека на основе трансгенной экспрессии транскрипционных факторов Ascl1 и Dlx2. Эти предшественники нейронов пересаживаются в одностороннем порядке, через 7 дней in vitro, в гиппокамп неонатальных 2-дневных мышей. Трансплантированные нейроны рассеиваются в ипси- и контралатеральном гиппокампе мышиной модели кортикальной дисплазии-синдрома фокальной эпилепсии и выживают до 9 месяцев после трансплантации. Этот подход позволяет исследовать клеточную идентичность, интеграцию, функциональность и терапевтический потенциал трансплантированных интернейронов в течение длительного времени в развитии здорового и больного мозга.
Introduction
Установление, созревание и уточнение нейронных сетей происходит в перинатальном и раннем постнатальном периоде и является решающим временным окном для развития мозга1. От послеродового изобилия связи мозг развивается до тонкой настройки связей, которые простираются до подросткового возраста2. Следовательно, изменения в генах, экспрессируемых в эти периоды, а также внешние факторы или инсульты определяют предрасположенность человека к множественным нарушениям развития нервной системы. Нарушения в познании и двигательной функции разворачиваются с течением времени, а фармакологическое лечение ограничено, большинство из них нацелены на симптомы с риском серьезных побочных эффектов.
Было показано, что дисфункция эргического ингибирования гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) является основным фактором, способствующим основной причине различных нарушений нервного развития3, таких как синдром хрупкой Х, синдром Ангельмана, эпилепсия, шизофрения и аутизм. ГАМК является основным ингибирующим передатчиком центральной нервной системы и играет важную роль в поддержании возбуждающего/тормозного (E/I) баланса, синхронизации возбуждения нейронов и вычислений. ГАМКергические интернейроны представляют собой гетерогенную популяцию нейронов, с возрастающей функциональной сложностью в более сложных областях мозга4 и с эволюцией 5,6. Учитывая ограниченную эндогенную регенеративную способность человеческого мозга и последствия дисфункции интернейрона в нескольких неврологических расстройствах, трансплантация ГАМКергических интернейронов может быть многообещающим терапевтическим направлением для изучения. Таким образом, полученные из стволовых клеток человека ГАМКергические интернейроноподобные клетки (hdIN), по-видимому, являются наиболее трансляционным и жизнеспособным источником для этой цели по сравнению с аллогенными предшественниками нейронов грызунов или другими источниками, используемыми в других местах7. Протоколы для генерации ГАМКергических нейронов из различных клеточных источников доступны 8,9,10,11,12,13, но требуется больше знаний о том, как hdIN созревают, интегрируются и функционируют с течением времени в развивающемся патологическом мозге. В нескольких исследованиях были выявлены изменения в генах, активных во время кортикального паттерна, установления нейронной связности14 и настройки физиологического баланса E/I15. Неонатальная трансплантация hdIN в мышиные модели с соответствующими генетическими возмущениями позволяет нам следить за взаимодействием между хозяином и трансплантатом, что является знанием, необходимым для определения потенциальных терапевтических стратегий.
Иммуномодуляция обычно и успешно используется при трансплантации ксенотрансплантата, чтобы избежать запуска иммунного ответа хозяина и отторжения16. Однако введение иммуносупрессивных препаратов, таких как циклоспорин А, вызывает почечную токсичность после хронического введения, является трудоемким из-за необходимости ежедневных внутрибрюшинных инъекций для достижения стабильных системных концентраций, вызывающих стресс у животных17, и имеет нецелевые эффекты, которые могут взаимодействовать с патологией18. Кроме того, было показано, что компрометация иммунной системы изменяет поведенческие фенотипы19 с изменениями в соответствующих нейроанатомических областях20. Было показано, что трансплантация в первую неделю жизни позволяет адаптироваться к трансплантированным клеткам21,22, в то время как другие сообщили о первоначальной выживаемости с последующим отторжением трансплантатов в течение первого постнатального месяца23,24.
Этот протокол описывает процедуры от генерации hdIN до трансплантации клеток у неонатальных мышей, приводящие к долгосрочной выживаемости трансплантата и позволяющие исследовать специфичность нейронов, синаптическую интеграцию, функцию и терапевтический потенциал трансплантированных интернейронов человека во время физиологического и патологического развития.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были одобрены Советом по этике исследований животных Мальмё/Лунда, этическое разрешение No 12548-19, и проведены в соответствии с правилами Шведского агентства по защите животных и Директивой ЕС 2010/63/EU для экспериментов на животных. C57BL6/J и контактин-ассоциированные белковые 2 (Cntnap2) нокаутирующие (KO) мыши, как самцы, так и самки, использовались на послеродовой день (P) 2 для настоящего исследования. Использовались эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs). Животные и стволовые клетки были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).
1. Генерация предшественников hdIN
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе выполняются в вытяжке клеточной культуры. HESCs поддерживались в виде клеток без кормушки на покрытых пластинах с использованием культуральной среды стволовых клеток и проходили в виде колоний.
- Выполните прямое программирование hESCs на предшественники hdIN (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Подход форвардного программирования основан на процедуре, описанной в Gonzalez-Ramos et al.8 и Yang et al.9.- Трансдукция hESCs с лентивирусными векторами, содержащими систему Tet-On, в свежей среде культивирования стволовых клеток, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK (RI) (см. Таблицу материалов). Хранить при температуре 37 °C в инкубаторе.
- Измените среду на свежую среду культивирования стволовых клеток через 16 ч после трансдукции и поддерживайте трансдуцированные клетки так же, как и нетрансдуцированные гЭСК.
- При слиянии отсоединяйте гЭСК как одиночные клетки с помощью раствора для отсоединения клеток (см. Таблицу материалов) и обложите их покрытыми 6-луночными пластинами плотностью 3 х 105 клеток/лунка в культуральной среде стволовых клеток, содержащей 10 мкМ RI в день in vitro (DIV) −1.
- При 1 DIV замените среду культивирования средой N2, содержащей 2 г/л доксициклина (DOX, см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: DOX используется для индуцирования трансгенной экспрессии Ascl1 и Dlx29, от 1 DIV до 7 DIV, а затем продолжается in vivo путем его добавления в питьевую воду25. - При 2 DIV начинается период отбора устойчивости к антибиотикам, который будет длиться до 5 DIV. Добавьте пуромицин (puro) и гигромицин (hygro) в свежую среду (см. Таблицу материалов). Измените носитель на 2 DIV, 4 DIV и 5 DIV.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизировать концентрации puro и hygro перед протоколом дифференцировки с использованием трансдуцированных и нетрансдуцированных hESCs для обеспечения выживания только клеток, несущих кассеты устойчивости к антибиотикам. В этом протоколе использовалось 0,5 мкг/мл puro и 750 мкг/мл гигро. - При 5 DIV период выбора антибиотика заканчивается. Переход на среду N2, дополненную 2 г/л DOX и 4 мкМ цитозина β-D-арабинофуранозида (Ara-C, см. Таблицу материалов).
Рисунок 1: Генерация прекурсоров hdIN из hESCs путем гиперэкспрессии Ascl1 и Dlx2. (A) Схемы протокола дифференциации, используемого для генерации прекурсоров hdIN. (Б-Е) Иммуноцитохимия предшественников hdIN при 7 DIV для (B) нейронального маркера MAP2, (C) пролиферативного маркера Ki67, (D) общего ядерного окрашивания и (E) слияния предыдущих маркеров. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Подготовка одноклеточной суспензии к трансплантации
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе выполняются в вытяжке клеточной культуры. На 7 DIV предшественники hdIN диссоциируются и используются для трансплантации.
- Выполните отсоединение клеток, выполнив следующие действия.
- Удалите среду и тщательно промойте клетки DPBS без кальция и магния.
- Добавляют 400 мкл раствора клеточного отсоединения (см. Таблицу материалов) к каждой лунке 6-луночной пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте покрытие всей поверхности раствором. - Инкубировать в течение 2-3 мин при 37 °С в инкубаторе до тех пор, пока граница клеток не начнет выглядеть блестящей, что свидетельствует о ферментативной деградации белков клеточной поверхности и отслоении от поверхности лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы увеличить выживаемость клеток, не ждите слишком долго, когда все клетки полностью отделяются и плавают вокруг. - Затем добавляют 600 мкл свежей среды N2 к каждой лунке 6-луночной пластины, чтобы остановить фермент, и механически с помощью пипетки помогают отсоединить клетки для получения одноклеточной суспензии.
- Переложите клеточную суспензию в пластиковую трубку (15 мл) и центрифугу при 180 х г в течение 4 мин при комнатной температуре (RT).
- Выполните повторное суспендирование клеток.
- Откажитесь от супернатанта с помощью вакуумной системы (осторожно, не нарушая гранулу) и повторно суспендируйте гранулу в трансплантационной среде, содержащей 10 мкМ RI, 1 мкг/мл ДНКазы и 2 мкг/мкл DOX.
- Подсчитайте общее количество ячеек в суспензии с помощью счетной камеры и ручного счетчика ячеек и отрегулируйте объем до конечной концентрации 100 000 клеток/мкл.
- Держите клеточную суспензию в закрытой трубке на льду до трансплантации максимум 4 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансплантация должна быть выполнена в тот же день, что и приготовление клеточной суспензии (7 DIV).
3. Внутригиппокампальная трансплантация клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в этом разделе выполняются за пределами капюшона клеточной культуры в животном учреждении. Ранняя постнатальная трансплантация клеток в мозг проводилась на Р2, считая Р0 днем рождения.
- Подготовьтесь к эксперименту по трансплантации, выполнив следующие действия.
- Автоклавировать весь хирургический материал или, если нет возможности, стерилизовать другим утвержденным методом.
- Установите инъекционный шприц в держатель без какого-либо стеклянного капилляра. Промойте иглу водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна быть 33 г. - Изгиб на 90° кончика инсулиновой иглы весом 30 г.
- Создайте самодельную сцену, похожую на Play-Doh, для позиционирования щенка с плоской головой (рисунок 2A).
- Возьмите клетку мышей с матерью и щенками, прежде чем готовить что-либо к операции, чтобы позволить им акклиматизироваться в новой среде.
- Подготовьте лоток с мокрым льдом и пустую клетку с бумагой для изофлурана.
- Обезболить щенка мыши.
- Замочите лист бумаги изофлураном (см. Таблицу материалов) и поместите его в пустую клетку. Осторожно возьмите одного щенка и поместите его в клетку с бумагой, пропитанной изофлураном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не оставляйте с мамой менее трех детенышей. Не превышайте 20-30 с изофлурановой анестезии, иначе щенок может погибнуть. - Проверьте эффект анестезии путем прекращения движения.
- Сразу после анестезии поместите щенка на влажную ткань на поверхности влажного льда. Держите животное на льду в течение 3 минут, пока верхние конечности не станут беловатыми (рисунок 2B, синяя стрелка). Обычно это занимает 2-3 мин.
- Используйте это время для загрузки шприца клеточной суспензией. Перед этим тщательно суспендируйте клетки пипеткой.
- Поместите щенка на стереотаксическую рамку. Используйте ушные вкладыши в противоположном направлении (рисунок 2А, пурпурные стрелки).
ПРИМЕЧАНИЕ: Задняя сторона ушных решеток менее заостренная, и, поскольку у щенков P2 нет ушей, используйте более плоскую сторону, чтобы избежать причинения вреда животному. - Сбоку проверьте, прямая ли голова. Голова должна быть плоской; используйте сцену Play-Doh-like, чтобы приспособиться к этому.
ПРИМЕЧАНИЕ: Щенки в этом возрасте еще не открыли глаза, поэтому никаких дополнительных шагов в этом отношении делать не нужно. У щенков в этом возрасте нет шерсти, поэтому бритье участка не требуется. Никакого специфического лечения боли не проводится, так как это не открытый разрез на коже, и наложение швов не проводится. - Держите щенка покрытым льдом (поверх папиросной бумаги) в течение всего периода операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не размещайте лед в непосредственном контакте с кожей щенка.
- Замочите лист бумаги изофлураном (см. Таблицу материалов) и поместите его в пустую клетку. Осторожно возьмите одного щенка и поместите его в клетку с бумагой, пропитанной изофлураном.
- Выполните инъекцию.
- Очистите поверхность кожи с помощью мягких тканей, пропитанных этанолом.
- Определите лямбду и установите координаты равными нулю на консоли цифрового дисплея стереотаксического прибора (рисунок 2C, желтая пунктирная линия). Сагиттальные и лямбдовидные швы хорошо видны глазом, так как они васкуляризированы, в виде красных линий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы испытываете трудности с визуализацией лямбды, поместите небольшой кусочек льда на кожу и подождите пару минут, пока он остынет. Затем удалите кусочек льда, и тонкое отбеливание кожи позволит визуализировать. - Переместите инъекционную иглу в нужные координаты. В описанном протоколе целевой областью был гиппокамп, а координаты были следующими: передне-задний (AP) +0,85 и медио-латеральный (ML) +1,35.
- Используйте изогнутую на 90° инсулиновую иглу, чтобы проникнуть в череп и создать крошечное отверстие.
- Опустите инъекционную иглу до тех пор, пока она не пересечет череп, и обнулите координаты дорсо-вентральной (DV). Опустите иглу до нужных координат DV. В описанном протоколе координаты были DV −1.1.
- Вводят в соответствии с заданными временными интервалами.
ПРИМЕЧАНИЕ: В описанном протоколе точные сроки были следующими: (i) после спуска к координате DV подождите 3 мин, (ii) введите 1 мкл объема в течение 5 минут и (iii) после того, как весь объем был введен, подождите 3 мин. - Медленно втягивайте иглу.
- Завершите процедуру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Операция не может длиться более 15 минут, чтобы обеспечить выживание щенка и избежать любых повреждений, полученных от анестезии при гипотермии.- Разогрейте щенка руками, пока он не начнет двигаться, прежде чем отдать его обратно матери.
- Вводят ДОКС в концентрации 1 мг/мл в 0,5% растворе сахарозы в виде питьевой воды в течение не менее 2 дней до и 3 недель после трансплантации (ПТ) для продолжения дифференцировки клеток in vivo.
Рисунок 2: Стереотаксическая трансплантация у детенышей новорожденных мышей в P2. (A) Стадия, похожая на Play-Doh, для удержания тела щенка в положении и перевернутые ушные перекладины (пурпурные стрелки). (B) Белая передняя лапа (синяя стрелка), указывающая на снижение кровотока в этой области, так что щенок испытывает анестезию путем переохлаждения. (C) Обзор установки со щенком, уже покрытым льдом над мягкой папиросной бумагой. (c#) Закрытый зум головы щенка, при этом инъекционная игла уже вставлена в мозг (желтая пунктирная линия, обозначающая лямбда- и лямбдовидные швы). Эта цифра адаптирована из Gonzalez Ramos et al. 27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Representative Results
Следуя протоколу, представленному здесь и проиллюстрированному на рисунке 1A, предшественники hdIN еще не были пролиферативными при 7 DIV, как определено (i) отрицательной иммунореактивностью для маркера клеточного цикла Ki67 и (ii) экспрессирующими нейрональными маркерами, такими как микротрубочки-ассоциированный белок 2 (MAP2) (Рисунок 1B-E). Эта характеристика проводилась на оставшихся клетках, повторно покрытых в течение 24 ч после прохождения всех этапов процедуры. Кроме того, анализ экспрессии генов, опубликованный ранее, показал, что быстрый переход от плюрипотентного состояния к нейрональному фенотипу происходит около 4 DIV и 7 DIV8. В целом, эти результаты подтвердили наличие постмитотических клеток и отсутствие риска образования тератомы.
Затем выживаемость предшественников hdIN после ранней постнатальной трансплантации в гиппокамп мышей дикого типа (WT) была проверена иммуногистохимией против цитоплазматического маркера человека STEM121. Предшественники hdIN были пересажены в правый дорсальный гиппокамп наивных иммунокомпетентных мышей в P2, которые затем были принесены в жертву при P14 и 2 месяцах PT. Привитые клетки были обнаружены по всему дорсальному гиппокампу, а также рассеяны через мозолистое тело и контралатеральный гиппокамп в обеих временных точках. Более того, в обеих временных точках привитые hdIN экспрессировали Ascl1, один из индукционных факторов транскрипции (дополнительный рисунок 1), и не были пролиферативными, о чем свидетельствует отсутствие экспрессии Ki67 (дополнительный рисунок 2).
Важно отметить, что иммунная реакция или местное воспаление против трансплантированных клеток не было обнаружено ни при P14, ни через 2 месяца PT, что оценивалось по отсутствию реактивной микроглии, идентифицированной с использованием Iba1, CD68 и галектина-3 (Gal3) (Рисунок 3), степень астроглиоза, определяемая глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) и воспалительными цитокинами, такими как интерлейкин-1 (IL-1), и отсутствие цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8) (рисунок 4).
Рисунок 3: hdIN в P14 и 2 месяца PT в гиппокамп новорожденных мышей WT без запуска иммунного отторжения из ткани хозяина. Иммунофлуоресценция для маркеров Iba1, CD68 и Gal3 в ткани мозга от (A-D) близости ишемизированной области ядра в модели электрокоагуляционного инсульта мыши (положительный контроль, Ctrl +), (E-H) отрицательные контрольные животные (Ctrl-) через 2 месяца и (M-P) P14, и (I-L) животные, которые подверглись трансплантации клеток через 2 месяца и (Q-T) ) П14. Белые стрелки указывают на некоторые примеры кровеносных сосудов, видимых во всех каналах из-за автофлуоресценции. Сокращения: Ctx = кора; Бедро = гиппокамп; DG = зубчатая извилина; CA1 = cornu ammonis 1. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: hdIN через 2 месяца PT в гиппокамп новорожденных мышей WT, не вызывая иммунного отторжения из ткани хозяина. Иммунофлуоресценция для маркеров IL1, GFAP и CD8 в ткани мозга от (A-D) близости ишемизированной области ядра в модели электрокоагуляционного инсульта мыши (положительный контроль, Ctrl +), (E-H) отрицательных контрольных животных (Ctrl-) через 2 месяца и (I-L) животных, которые подверглись трансплантации клеток через 2 месяца. Сокращения: Ctx = кора; Бедро = гиппокамп; DG = зубчатая извилина. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Аналогичным образом, предшественники hdIN также были пересажены в гиппокамп мышей Cntnap2 KO, модель расстройства аутистического спектра и синдрома кортикальной дисплазии-фокальной эпилепсии. У мышей Cntnap2 KO, действительно, hdIN выжили до 9 месяцев PT и были локализованы в месте инъекции, хотя они также были рассеяны по ипсилатеральному и даже контралатеральному гиппокампу, как наблюдалось у мышей WT (рисунок 5). Кроме того, большинство привитых hdIN были иммунореактивными для маркеров интернейрона, как и ожидалось из предыдущих результатов in vitro 8,26 и у взрослых грызунов in vivo25.
Рисунок 5: Привитые hdIN в гиппокампе мышей Cntnap2 KO через 9 месяцев PT. (A) Иммунохимия против цитоплазматического человеческого маркера STEM121 у клеточных трансплантированных (слева) и фиктивных (справа) мышей. (а1 и а2) Увеличенные изображения положительных клеток STEM121. (B) Иммунофлуоресценция для STEM121 (пурпурный) и интернейронных маркеров парвальбумина (PV) и соматостатина (SST). Белые стрелки указывают на двойные положительные клетки для STEM121 и соответствующего маркера интернейрона. (C) Ортогональный вид привитого иммунореактивного hdIN для STEM121 и PV. Шкала: 200 мкм (A и B), 100 мкм (a1 и a2), 20 мкм (небольшое квадратное увеличение в a1 и a2 и C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Привитые hdIN через 2 месяца PT в гиппокамп новорожденных мышей WT, экспрессирующих Ascl1. Иммунофлуоресценция против Ascl1 и цитоплазматического человеческого маркера STEM121 в (A) CA3 и (B) DG у клеточных трансплантированных мышей WT. (a) Увеличенное изображение положительной клетки STEM121. Белые стрелки указывают на двойные положительные клетки для STEM121 и Ascl1. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Постмитотические привитые hdIN через 2 месяца PT в гиппокамп новорожденных мышей WT. Иммунофлуоресценция против пролиферативного маркера Ki67 и цитоплазматического человеческого маркера STEM121 у (А) наивных и (В) трансплантированных клеток мышей WT. (b) Увеличенное изображение положительной клетки STEM121. Желтая стрелка указывает на положительную клетку для Ki67 и отрицательную для STEM121. Белая стрелка указывает на положительные клетки для STEM121 и отрицательные для Ki67. Белая звездочка указывает на боковой желудочек. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Настоящий протокол описывает надежную, быструю, простую и широко доступную методологию генерации предшественников hdIN in vitro и ее использование в качестве ранней интервенционной клеточной терапии в доклинических моделях нарушений нервного развития.
Несмотря на то, что некоторые из характерных фенотипов нарушений нервного развития возникают в подростковом или взрослом возрасте, патофизиологические изменения уже присутствуют в раннем развитии. По этой причине раннее вмешательство было бы очень оправдано для достижения благотворного эффекта, действуя в критические периоды развития мозга до симптоматики или клинического проявления. В будущем генетический скрининг и разработка биомаркеров позволят профилактическое или предсимптоматическое лечение, что изменит правила игры для этих пациентов. Таким образом, предшественники hdIN были пересажены в начале после рождения в мышиную модель Cntnap2 KO, когда эпилептогенные изменения в нейронной сети могут продолжаться28 и в точку времени, когда клеточные изменения были описаны в этой модели29 животных. Важно, однако, учитывать потенциальные подводные камни экстраполяции возраста и времени определенных процессов в мыши по сравнению с человеческим мозгом.
Ориентируясь на саму процедуру, представленный здесь протокол дифференцировки основан на использовании факторов транскрипции, которые позволяют быстро и высокоэффективно программировать стволовые клетки по сравнению с другими протоколами в других местах на основе малых молекул10,30. Потенциальным недостатком этого подхода может быть потребность в лентивирусных векторах, что сопряжено с риском вставочного мутагенеза. Двумя критическими шагами в протоколе являются добавление антибиотиков и антимитотического агента в среду для отбора клеток, экспрессирующих факторы транскрипции, и устранения пролиферативных клеток, избегая риска образования тератомы, соответственно. Хотя в этом исследовании были протестированы только предшественники hdIN, ожидается, что процедура будет осуществима с другими источниками клеток и протоколами программирования / дифференцировки. Тем не менее, другие нейронные подтипы и/или модели должны быть проверены.
Возраст предшественника hdIN для трансплантации, 7 DIV, был определен на основе (i) отсутствия пролиферативных клеток, оцениваемых иммунореактивностью в отношении Ki67, (ii) вместе с ранее сообщенными наблюдениями снижения экспрессии генов плюрипотентности, таких как POU5F1, и появления нейронального маркера MAP2 и интернейронного маркера GAD1 в этой точкевремени 8 . Тем не менее, оригинальная работа, описывающая этот протокол, выполняла трансплантацию при 14 DIV после отмены DOX9. Это поднимает вопросы о том, может ли DOX в питьевой воде матери достичь клеток, привитых в мозг кормящих щенков через молоко, или 7 DIV индукции DOX достаточно, чтобы установить ГАМКергическую судьбу. Хотя Янг и др. определили 14 дней DOX как достаточные для генерации стабильных нейрональных клеток in vitro9, Gonzalez-Ramos et al.8 обнаружили экспрессию гена GAD1 уже при 7 DIV, что указывает на то, что последующая активация GAD67 Ascl1 и Dlx2 уже произошла в этот момент времени. Следовательно, моделирование началось с 7 DIV и может быть менее зависимым от лечения DOX. Кроме того, данные на грызунах и людях указывают на наличие DOX вгрудном молоке 31,32, а результаты, представленные здесь, показывают, что привитые hdIN были иммунореактивными для Ascl1 через 2 недели и 2 месяца PT и интернейронные маркеры позже через 9 месяцев PT. В привитой популяции, помимо PV и SST-положительных нейронов, другие маркеры субпопуляций интернейронов также были обнаружены в более низких количествах, таких как кальретинин (CR) и кальбиндин (CB).
Сложным аспектом этой процедуры является координация сроков как для дифференциации, так и для возраста щенков. Обычно беременность мыши занимает 21 день после установки брачной клетки, хотя иногда это может варьироваться. Такой сценарий не возникает при выполнении трансплантации клеток у взрослых грызунов, когда все можно тщательно спланировать и организовать. Тем не менее, это можно легко смягчить, установив две-три клетки для спаривания с интервалом в 2 дня или две-три партии дифференциации с 2-дневным интервалом друг от друга.
Хотя мыши, использованные в этом исследовании, не были ни иммунодефицитными, ни иммуносупрессированными, трансплантированные клетки выживали до 9 месяцев in vivo, а маркеры иммунной реакции против ксеногенных клеток или местного воспаления не наблюдались ни на P14, ни на 2 месяцах PT. Иммунное отторжение трансплантированных ксеногенных клеток запускается против MHC / пептидов, а ключевыми клеточными медиаторами отторжения трансплантата являются Т-лимфоциты и микроглиальные клетки33, 34. Поэтому была исследована иммунореактивность к маркерам Т-клеток, а также реактивная микроглия. Никаких признаков иммунного отторжения трансплантированных клеток в ткани хозяина не было обнаружено ни по уровням реактивной микроглии, ни по присутствию Т-лимфоцитов у мышей WT через P14 или 2 месяца. Кроме того, не наблюдалось местного воспаления на основе оцененных уровней астроглиоза и воспалительных цитокинов. Этот исход может частично зависеть от неонатальной иммунной толерантности 35,36,37, наблюдаемой другими клеточными идентичностями, местоположениями и животными моделями 35,38. Englund et al. идентифицировали региональные различия в исходе трансплантированных клеток с точки зрения миграции и созревания, включая наблюдение за привитыми клетками в соседнем белом веществе35.
Наконец, наблюдалась большая дисперсия привитых клеток в гиппокампе по сравнению с другими исследованиями, трансплантированными взрослым грызунам, где hdIN оставались в виде привитого ядра25. Эта дисперсия также отличалась от результатов, наблюдаемых ранее Янгом и др.9, что может быть объяснено в данном случае возрастом клеток на момент трансплантации.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Этот проект финансировался Шведским исследовательским советом (номер гранта: 2016-02605, M.A.), Шведским фондом мозга F02021-0369 (M.A.), Фондом Крафурда (M.A.) и Программой Европейского Союза Horizon 2020 (H2020-MSCA-ITN-2016) в рамках проекта Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network Training4CRM No. 722779 (M.K.). Мы чрезвычайно благодарны за помощь Андресу Мигесу из лаборатории Хосепа Марии Каналса (Лаборатория стволовых клеток и регенеративной медицины, Университет Барселоны) за обучение трансплантации стереотаксических клеток у новорожденных мышей P2 и Маккензи Ховард, руководителя группы в Техасском университете в Остине, за советы и предварительные координаты для трансплантации клеток в гиппокамп новорожденных мышей P2. Мы благодарим Сюзанну Герес за помощь в уходе за животными и Лин Цао за помощь в обработке тканей, а также студентов, которые так или иначе внесли свой вклад в исследование, и в частности Диану Хатамиан. Наконец, некоторые из графиков, используемых для иллюстрации этой статьи, были созданы с BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G needle | B Braun | 4656300 | |
| 33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
| Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
| Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
| Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
| Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
| Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
| Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
| Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
| Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
| Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
| Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
| Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
| Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
| Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
| Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
| B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
| Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
| Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
| C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
| Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
| Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
| Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
| Cy3 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
| DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
| Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
| DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
| DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
| Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
| FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
| H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
| HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium - Transplantation medium |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
| Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
| Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
| Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
| Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
| Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
| Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
| Microscope Software | Olympus | CellSens | |
| Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
| Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement - Stem cell culture medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Pertex | HistoLab | 811 | |
| Pipet Filler | |||
| Play-Doh | |||
| Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
| Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
| Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
| Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
| Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
| Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
| Tweezer | VWR | ||
| Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |
References
- Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
- Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
- Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
- Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382 (2018).
- Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
- Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
- Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
- Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
- Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
- Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
- Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
- Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
- Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
- Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
- Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
- Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651 (2021).
- Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
- Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243 (2021).
- Gonzalez Ramos, A. Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).
- Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970 (2021).
- Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
- Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561 (2021).
- Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
- Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
- Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
- Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136 (2018).
- Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11 (2012).
- Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).
