Nöronal programlama ile üretilen insan pluripotent kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronların transplantasyonu, nörogelişimsel bozukluklar için potansiyel bir tedavi yaklaşımı olabilir. Bu protokol, insan kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronal öncüllerin yenidoğan farelerin beyinlerine üretilmesini ve transplantasyonunu tanımlar, aşılanmış nöronların uzun süreli araştırılmasına ve terapötik potansiyellerinin değerlendirilmesine olanak tanır.
İnhibitör internöronların sayısının azalması veya işlev bozukluğu, nörogelişimsel bozukluklara yaygın bir katkıda bulunur. Bu nedenle, değiştirilmiş nöronal devrelerin etkilerini değiştirmek veya hafifletmek için internöronları kullanan hücre terapisi çekici bir terapötik yoldur. Bu amaçla, insan kök hücre kaynaklı GABAerjik internöron benzeri hücrelerin (hdIN’ler) konakçı devresinde zaman içinde nasıl olgunlaştığı, entegre olduğu ve çalıştığı hakkında daha fazla bilgiye ihtiyaç vardır. Nörogelişimsel bozukluklarda özellikle önemli olan, nakledilen hücrelerdeki bu süreçlerin evrimleşen ve olgunlaşan bir konakçı beyinden etkilenip etkilenmediğinin daha iyi anlaşılmasıdır. Mevcut protokol, transkripsiyon faktörleri Ascl1 ve Dlx2’nin transgenik ekspresyonuna dayanan insan embriyonik kök hücrelerinden hızlı ve yüksek verimli bir hdIN üretimini tanımlamaktadır. Bu nöronal öncüller, in vitro 7 gün sonra, yenidoğan 2 günlük farelerin hipokampüsüne tek taraflı olarak nakledilir. Nakledilen nöronlar, kortikal displazi fokal epilepsi sendromunun bir fare modelinin ipsi ve kontralateral hipokampüsünde dağılır ve transplantasyondan sonra 9 aya kadar hayatta kalır. Bu yaklaşım, nakledilen internöronların hücresel kimliğini, entegrasyonunu, işlevselliğini ve terapötik potansiyelini, sağlıklı ve hastalıklı beyinlerin geliştirilmesinde uzun bir süre boyunca araştırmaya izin verir.
Nöronal ağların kurulması, olgunlaşması ve iyileştirilmesi perinatal ve erken postnatal dönemde gerçekleşir ve beyin gelişimi için çok önemli bir zaman penceresini temsil eder1. Doğum sonrası bağlantının coşkunluğundan, beyin ergenliğe kadar uzanan bağlantıların ince ayarına dönüşür2. Sonuç olarak, bu dönemlerde ifade edilen genlerdeki değişikliklerin yanı sıra dış faktörler veya hakaretler, bireyin çoklu nörogelişimsel bozukluklara yatkınlığını tanımlar. Biliş ve motor fonksiyondaki bozukluklar zamanla ortaya çıkar ve farmakolojik tedaviler sınırlıdır, çoğunluğu ciddi yan etki riski olan semptomları hedef alır.
Gama-aminobütirik asit (GABA) erjik inhibisyonundaki disfonksiyonun, kırılgan X sendromu, Angelman sendromu, epilepsi, şizofreni ve otizm gibi çeşitli nörogelişimsel bozuklukların3 altında yatan nedene önemli bir katkıda bulunduğu gösterilmiştir. GABA, merkezi sinir sisteminin ana inhibitör vericisidir ve uyarıcı / inhibitör (E / I) dengesini korumak, nöronal ateşlemenin senkronizasyonu ve hesaplama için etkilidir. GABAerjik internöronlar, daha karmaşık beyin bölgelerinde4 ve evrim 5,6’da fonksiyonel karmaşıklığın arttığı heterojen bir nöron popülasyonudur. İnsan beyninin sınırlı endojen rejeneratif kapasitesi ve çeşitli nörolojik bozukluklarda internöron disfonksiyonunun etkisi göz önüne alındığında, GABAerjik internöronların transplantasyonu araştırılması için umut verici bir terapötik yol olabilir. Bu doğrultuda, insan kök hücre kaynaklı GABAerjik internöron benzeri hücreler (hdIN’ler), kemirgen allojenik nöronal öncüllere veya başka yerlerde kullanılan diğer kaynaklara kıyasla bu amaç için en translasyonel ve uygulanabilir kaynak gibi görünmektedir7. Farklı hücre kaynaklarından GABAerjik nöronlar üretmek için protokoller mevcuttur 8,9,10,11,12,13, ancak hdIN’lerin gelişmekte olan patolojik bir beyinde zaman içinde nasıl olgunlaştığı, bütünleştiği ve işlev gördüğü hakkında daha fazla bilgi gereklidir. Birçok çalışma, kortikal modelleme sırasında aktif olan genlerdeki değişiklikleri, nöronal bağlantı14’ü kurmayı ve fizyolojik E / I dengesini15’i ayarlamayı tanımlamıştır. HdIN’lerin karşılık gelen genetik pertürbasyonlarla fare modellerine yenidoğan transplantasyonu, potansiyel terapötik stratejileri belirlemek için gerekli olan konakçı ve greft arasındaki etkileşimi takip etmemizi sağlar.
İmmünomodülasyon, konakçı immün yanıtını tetiklemeyi ve reddetmeyi önlemek için ksenogreft transplantasyonlarında yaygın ve başarılı bir şekilde kullanılmaktadır16. Bununla birlikte, siklosporin A gibi immünosüpresif ilaçların uygulanması, kronik uygulamadan sonra renal toksisiteye neden olur, stabil sistemik konsantrasyonlara ulaşmak için günlük intraperitoneal enjeksiyonlara duyulan ihtiyaç nedeniyle emek yoğundur, hayvan stresine neden olur17 ve patoloji ile etkileşime girebilecek hedef dışı etkilere sahiptir18. Ek olarak, bağışıklık sisteminden ödün vermenin davranışsal fenotipleri değiştirdiği gösterilmiştir19, karşılık gelen nöroanatomik bölgelerdeki değişiklikler20. Yaşamın ilk haftasında transplantasyonun nakledilen hücrelere adaptasyona izin verdiği gösterilmiştir 21,22, diğerleri ise ilk sağkalımı ve ardından doğum sonrası ilk ay içinde greftlerin reddedildiğini bildirmiştir 23,24.
Bu protokol, yenidoğan farelerde hdIN üretiminden hücre transplantasyonuna kadar olan prosedürleri tanımlar ve uzun süreli greft sağkalımı ile sonuçlanır ve fizyolojik ve patolojik gelişim sırasında nakledilen insan internöronlarının nöronal özgüllüğünün, sinaptik entegrasyonunun, fonksiyonunun ve terapötik potansiyelinin araştırılmasına izin verir.
Bu protokol, in vitro hdIN öncülleri üretmek için sağlam, hızlı, basit ve yaygın olarak erişilebilir bir metodolojiyi ve nörogelişimsel bozuklukların klinik öncesi modellerinde erken girişimsel hücre tedavisi olarak kullanımını açıklamaktadır.
Nörogelişimsel bozuklukların karakteristik fenotiplerinden bazıları ergenlik veya yetişkinlik döneminde ortaya çıksa da, erken gelişim sırasında patofizyolojik değişiklikler zaten mevcuttur. Bu nedenle, erken müdahale, semptomatoloji veya klinik tezahürden önce kritik beyin gelişim dönemlerinde hareket ederek yararlı etkiler elde etmek için oldukça garanti edilecektir. Gelecekte, genetik tarama ve biyobelirteçlerin geliştirilmesi, bu hastalar için bir oyun değiştiriciyi temsil eden profilaktik veya semptomatik öncesi tedaviyi sağlayacaktır. Bu nedenle, hdIN öncülleri, Cntnap2 KO fare modelinde doğumdan sonra erken saatlerde, nöronal ağdaki epileptojenik değişikliklerin devam edebileceği28 ve bu hayvan modelinde hücresel değişikliklerin tanımlandığı bir zaman noktasında nakledilmiştir29. Bununla birlikte, yaş ekstrapolasyonunun potansiyel tuzaklarını ve faredeki belirli işlemlerin insan beynine karşı zamanlamasını göz önünde bulundurmak önemlidir.
Prosedürün kendisine odaklanan burada sunulan farklılaşma protokolü, kök hücrelerin küçük moleküllere dayanan diğer protokollerle karşılaştırıldığında hızlı ve yüksek verimli bir şekilde programlanmasını sağlayan transkripsiyon faktörlerinin kullanımına dayanmaktadır10,30. Bu yaklaşımın potansiyel bir dezavantajı, ekleme mutagenezi riski taşıyan lentiviral vektörlerin gerekliliği olabilir. Protokoldeki iki kritik adım, transkripsiyon faktörlerini eksprese eden hücreler için seçilecek ortama antibiyotiklerin ve anti-mitotik ajanın eklenmesi ve sırasıyla teratom oluşumu riskinden kaçınılarak proliferatif hücrelerin ortadan kaldırılmasıdır. Bu çalışmada sadece hdIN öncülleri test edilmiş olmasına rağmen, prosedürün diğer hücre kaynakları ve programlama / farklılaşma protokolleri ile uygulanabilir olması beklenmektedir. Bununla birlikte, diğer nöronal alt tipler ve / veya modeller doğrulanmalıdır.
hdIN öncülünün nakil yaşı olan 7 DIV’e, (i) Ki67’ye karşı immünoreaktivite ile değerlendirilen proliferatif hücrelerin yokluğuna, (ii) POU5F1 gibi pluripotens genlerinin ekspresyonundaki azalmaların daha önce bildirilen gözlemine ve nöronal belirteç MAP2 ve internöron belirteci GAD1’in bu zaman noktasında ortaya çıkmasına dayanarak karar verildi8 . Bununla birlikte, bu protokolü tanımlayan orijinal çalışma, DOX geri çekilmesinden sonra 14 DIV’de transplantasyongerçekleştirdi 9. Bu, annenin içme suyundaki DOX’un süt yoluyla emziren yavruların beyinlerine aşılanmış hücrelere ulaşıp ulaşamayacağı veya GABAerjik kaderi belirlemek için 7 DIV DOX indüksiyonunun yeterli olup olmadığı hakkında sorular ortaya çıkarmaktadır. Her ne kadar Yang ve ark. 14 günlük DOX’u in vitro9’da stabil nöronal hücreler üretmek için yeterli olarak tanımlamış olsalar da, Gonzalez-Ramos ve ark.8, GAD1 gen ekspresyonunu zaten 7 DIV’de tespit ettiler ve bu da GAD67’nin Ascl1 ve Dlx2 tarafından aşağı akış aktivasyonunun bu zaman noktasında zaten gerçekleştiğini gösteriyor. Bu nedenle, modelleme 7 DIV’de başlamıştır ve DOX tedavisine daha az bağımlı olabilir. Ayrıca, kemirgenlerde ve insanlarda elde edilen kanıtlar anne sütünde DOX varlığını göstermektedir 31,32 ve burada sunulan sonuçlar, aşılanmış hdIN’lerin 2 hafta ve 2 ay PT’deAscl1 için immünoreaktif olduğunu ve daha sonra 9 aylık PT’de internöron belirteçleri olduğunu göstermektedir. Aşılanmış popülasyonda, PV ve SST pozitif nöronların yanı sıra, internöronların alt popülasyonları için diğer belirteçler de kalretinin (CR) ve kalbindin (CB) gibi daha düşük miktarlarda bulunmuştur.
Bu prosedürün zorlu bir yönü, hem farklılaşma hem de yavruların yaşı için zamanlamaların koordinasyonudur. Genellikle, fare gebeliği çiftleşme kafesini kurduktan sonra 21 gün sürer, ancak bu bazen değişebilir. Bu senaryo, yetişkin kemirgenlerde hücre nakli yapılırken, her şey dikkatlice planlanıp düzenlenebildiğinde ortaya çıkmaz. Bununla birlikte, bu, 2 günlük aralıklarla iki ila üç çiftleşme kafesi veya birbirinden 2 günlük bir zaman atlamalı iki ila üç farklılaşma partisi kurarak kolayca hafifletilebilir.
Bu çalışmada kullanılan fareler ne immün yetmezlikli ne de immünsüprese olmasalar da, nakledilen hücreler in vivo olarak 9 aya kadar hayatta kaldılar ve ksenojenik hücrelere veya lokal inflamasyona karşı bağışıklık reaksiyonunun belirteçleri P14 veya 2 ay PT’de gözlenmedi. Aşılanmış ksenojenik hücrelerin immün reddi MHC / peptitlere karşı tetiklenir ve greft reddinin anahtar hücresel aracıları T lenfositler ve mikroglial hücrelerdir33, 34. Bu nedenle, T hücrelerinin belirteçlerine ve reaktif mikrogliaya immünoreaktivite araştırılmıştır. Konakçı dokudaki aşılanmış hücrelerin immün rejeksiyon belirtileri ya reaktif mikroglia seviyeleri ile ya da P14 veya 2 ayda WT farelerde T lenfositlerin varlığı ile tespit edilmedi. Ayrıca, değerlendirilen astroglioz ve inflamatuar sitokin seviyelerine dayanarak lokal inflamasyon gözlenmedi. Bu sonuç kısmen yenidoğan immün toleransına bağlı olabilir 35,36,37, diğer hücre kimlikleri, lokalizasyonları ve hayvan modelleri tarafından gözlenen35,38. Englund ve ark., bitişik beyaz cevher35’teki aşılanmış hücrelerin gözlemlenmesi de dahil olmak üzere, göç ve olgunlaşma açısından aşılanmış hücrelerin sonuçlarında bölgesel farklılıklar tespit etmişlerdir.
Son olarak, hipokampus içindeki aşılanmış hücrelerin daha fazla dağılması, hdIN’lerin aşılanmış bir çekirdek25 olarak kaldığı yetişkin kemirgenlere nakledilen diğer çalışmalara kıyasla gözlenmiştir. Bu dağılım aynı zamanda daha önce Yang ve ark.9 tarafından gözlemlenen sonuçlardan da farklıydı; bu durumda nakil sırasında hücrelerin yaşı ile açıklanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu proje İsveç Araştırma Konseyi (Hibe Numarası: 2016-02605, MA), İsveç Beyin Vakfı F02021-0369 (MA), Crafoord Vakfı (MA) ve Avrupa Birliği Horizon 2020 Programı (H2020-MSCA-ITN-2016) tarafından Marie Skłodowska-Curie Yenilikçi Eğitim Ağı projesi Training4CRM No. 722779 (M.K.) kapsamında finanse edilmiştir. Andrés Miguez’in, Josep Maria Canals’ın laboratuvarından (Barselona Üniversitesi Kök Hücreler ve Rejeneratif Tıp Laboratuvarı), P2 yenidoğan farelerde stereotaksik hücre naklini öğretmek için ve Austin’deki Teksas Üniversitesi’nde grup lideri Mackenzie Howard’ın P2 yenidoğan farelerin hipokampüsüne hücre nakli için tavsiye ve ön koordinatlar için son derece minnettarız. Susanne Geres’e hayvan bakımına yardımcı olduğu için ve Ling Cao’ya doku işlemeye yardımcı olduğu için ve ayrıca çalışmaya bir şekilde katkıda bulunan öğrencilere ve özellikle Diana Hatamian’a teşekkür ederiz. Son olarak, bu makaleyi göstermek için kullanılan grafiklerin bazıları BioRender.com oluşturulmuştur.
30 G needle | B Braun | 4656300 | |
33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
Cy3 Stretavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium – Transplantation medium |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
Microscope Software | Olympus | CellSens | |
Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement – Stem cell culture medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Pertex | HistoLab | 811 | |
Pipet Filler | |||
Play-Doh | |||
Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
Tweezer | VWR | ||
Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
Xylene | VWR | 28973.363 | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |