Summary
상향 조절된 많은 유전자는 종양 세포의 이동과 침입을 자극하여 예후를 악화시킵니다. 어떤 유전자가 종양 세포의 이동과 침입을 조절하는지 알아내는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 종양 세포의 이동 및 침입에 대한 유전자 발현 증가의 효과를 실시간으로 조사하는 방법을 제시합니다.
Abstract
종양 세포는 운동성이 높고 침습적이며 변형된 유전자 발현 패턴을 나타냅니다. 유전자 발현의 변화가 종양 세포의 이동과 침입을 어떻게 조절하는지에 대한 지식은 종양 세포가 인접한 건강한 조직으로 침투하여 전이되는 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 이전에는 유전자 녹다운(knockdown)에 이은 임피던스 기반 종양 세포 이동 및 침습 실시간 측정을 통해 종양 세포 이동 및 침습에 필요한 유전자를 식별할 수 있음을 입증했습니다. 최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신은 치료 목적으로 합성 mRNA를 사용하는 것에 대한 관심이 높아졌습니다. 여기서는 유전자 과발현이 종양 세포 이동 및 침습에 미치는 영향을 연구하기 위해 합성 mRNA를 이용한 방법을 수정하였다. 이 연구는 합성 mRNA transfection을 통한 유전자 발현 증가 후 임피던스 기반 실시간 측정이 종양 세포 이동 및 침입을 자극하는 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법 논문은 종양 세포 이동 및 침습에 대한 변경된 유전자 발현의 영향을 조사하는 절차에 대한 중요한 세부 정보를 제공합니다.
Introduction
종양 세포 운동성은 전이 1,2에 중요한 역할을 합니다. 종양 세포가 인접 및 원격 건강 조직으로 퍼지면 암 치료가 어려워지고 재발에 기여합니다 3,4. 따라서 종양 세포 운동성의 메커니즘을 이해하고 관련 치료 전략을 개발하는 것이 필수적입니다. 많은 종양 세포가 유전자 발현 프로파일을 변경했기 때문에 유전자 발현 프로파일의 어떤 변화가 종양 세포 운동성의 변화로 이어지는지 이해하는 것이 중요합니다 5,6.
in vitro에서 세포 이동을 측정하기 위해 여러 분석법이 개발되었습니다. 일부 분석법은 특정 시점에서만 측정이 가능하기 때문에 제한된 정보만 제공하는 반면, 다른 분석법은 종양 세포 운동성에 대한 포괄적인 정보를 실시간으로 제공한다7. 이러한 세포 운동성 분석의 대부분은 주어진 시간 또는 종말점에서 정량적 결과를 제공할 수 있지만 실험 기간 동안 세포 이동 속도의 동적 변화에 대한 충분히 자세한 정보를 제공하지 못합니다. 또한 실험 설계, 세포 유형 및 세포 수에 따라 세포 이동 속도의 잠재적 변화를 조사하기 어려울 수 있습니다. 또한, 복잡하지 않은 치료의 효과는 전통적인 운동성 분석의 간단한 정량화로 조사할 수 있지만, 다양한 복합 치료의 복잡한 효과를 연구하기 위해서는 보다 정교한 정량화가 필요할 수 있다8.
미세전극으로 덮인 마이크로타이터 플레이트 웰 바닥의 전류를 모니터링하는 기기가 개발되었다9. 우물 표면에 대한 세포의 접착은 전자 흐름을 방해하고 임피던스는 세포의 양적 및 질적 결합과 관련이 있습니다. 웰 바닥에 미세 전극이 있으면 세포 접착, 확산 및 증식을 측정할 수 있습니다. 상부 챔버의 미세 다공성 막 아래에 미세 전극이 존재하면 하부 챔버로의 세포 이동 및 침범을 측정할 수 있으며, 상부 챔버는 침범을 허용하기 위해 세포외 기질(ECM) 단백질로 코팅되어 있다10.
이전에는 종양 세포 이동 및 침습에 대한 임피던스 기반 실시간 측정이 전체 실험 동안 실시간 데이터를 제공할 뿐만 아니라 다양한 실험 조건 하에서 즉각적인 비교 및 정량화를 제공한다는 것이 입증되었습니다11. 이 방법 논문에서는 종양 세포 이동 및 침입에서 관심 단백질의 역할을 테스트하기 위해 유전자 녹다운을 유도했습니다. 테스트된 실험 조건에서 완전한 유전자 녹다운 효과는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용한 전기천공법 후 3-4일이 걸렸기 때문에8, 전기천공법 후 세포를 다시 도금하고 3일 후에 종양 세포 이동 및 침습의 임피던스 기반 실시간 측정을 위해 재수확했습니다.
키나아제(Crk) 및 Crk-유사(CrkL)의 CT10 조절자는 다양한 성장 인자 수용체 키나아제 경로 및 비수용체 티로신 키나아제 경로의 다운스트림에서 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 어댑터 단백질이다12. Crk 및 CrkL 단백질의 수치가 높아지면 교모세포종을 포함한 여러 인간 암의 예후가 좋지 않습니다13. 그러나 Crk 및 CrkL 단백질의 증가가 어떻게 나쁜 예후로 이어지는지는 불분명합니다. 따라서 Crk 및 CrkL 과발현이 종양 세포 기능에 미치는 영향을 정의하는 것이 중요합니다. 이전에는 Crk 및 CrkL 단백질의 내인성 수준이 교모세포종 세포 이동 및 침습에 필요하다는 것을 입증하기 위해 유전자 knockdown 연구가 수행되었습니다8. 여기에서 종양 세포 이동 및 침습에 대한 Crk 및 CrkL 과발현의 영향을 해결하기 위해 수정된 분석 시스템이 개발되었습니다.
최근 SARS-CoV-2에 대한 mRNA 백신의 개발로 인해 mRNA의 체외 합성 및 치료 응용 분야가 다시 주목을 받고 있습니다(Verbeke et al.14 검토). 또한 암 및 기타 질병에서 합성 mRNA를 사용하는 데 있어 놀라운 발전이 이루어졌습니다15,16. 세포의 전기천공법은 합성 mRNA를 전달하고 일시적인 유전자 변형을 유도하는 효과적인 방법이며(Campillo-Davo et al.17에 의해 검토됨), 합성 mRNA의 사용은 불멸화된 섬유아세포에서 빠르고 효율적인 유전자 발현을 가능하게 한다 18. 이 방법 논문은 합성 mRNA를 사용한 유전자 과발현과 실시간 세포 분석을 결합하여 종양 세포 이동 및 침입을 연구합니다. 그러나, siRNA에 사용되는 실험 방식은 합성 mRNA 형질주입 시 외인성 단백질의 수준이 급격히 증가하고 점차적으로 감소하기 때문에 합성 mRNA 형질주입에는 효과가 없다18. 따라서, 세포를 추가로 배양하지 않고 형질주입 직후 세포 이동 및 침습에 대한 실시간 분석을 수행할 수 있도록 방법을 수정하였다.
이 분석법 논문은 임피던스 기반 실시간 측정과 종양 세포의 합성 mRNA의 transfection을 결합하면 종양 세포 이동 및 침습에 대한 유전자 상향 조절의 효과에 대한 빠르고 포괄적인 분석을 제공한다는 것을 보여줍니다. 이 분석법 논문은 교모세포종 세포의 이동 및 침습이 Crk 및 CrkL의 과발현에 의해 어떻게 영향을 받는지 측정하기 위한 자세한 절차를 설명합니다. 이 논문은 종양 세포 이동에 대한 합성 mRNA의 농도 의존적 효과를 조사함으로써 단백질 수준의 증가가 종양 세포 이동을 어떻게 자극하는지 명확하게 설명합니다. 또한, 종양 세포 침범에 대한 유전자 발현 변화의 영향을 평가하기 위해 ECM 겔의 농도를 변화시키는 접근법을 제시합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mRNA의 합성
참고: mRNA 합성을 위해 모든 시약과 장비는 사용하기 전에 RNase를 비활성화하도록 특수 처리해야 합니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
- DNA의 선형화
참고: CrkI 및 CrkL의 마우스 cDNA를 pFLAG-CMV-5a 발현 벡터로 클로닝하여 C-말단에 FLAG 에피토프 태그를 추가하고, 이전에 기술된 바와 같이, T7 프로모터를 통합하기 위해 pcDNA3.1/myc-His 벡터로 서브클로닝하였다(18,19).- 10 μL의 10x 반응 완충액, 1.5 μL의 PmeI(10,000 units/mL) 및 10 μg의 플라스미드 DNA를 마이크로 원심분리 튜브에 추가하여 플라스미드 DNA를 제한 효소로 선형화합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 100μL로 만듭니다.
- 두드려서 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 밤새 배양합니다.
- 스핀 다운하고 반응 혼합물에 5μL의 10% 도데실 황산나트륨(SDS)과 1μL의 proteinase K(20mg/mL, RNA 등급)를 추가합니다. 두드려서 혼합하고 탈수한 후 50°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 흄 후드 아래에서 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올의 바닥상 100μL를 추출을 위해 플라스미드 반응 혼합물에 첨가합니다. 와류를 가열한 다음 실온에서 18,800× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상부 위상을 새 튜브로 이동합니다.
- 클로로포름:이소아밀 알코올로 1.1.4:24 단계를 반복합니다.
- 새 튜브에 200μL의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 300μL로 만든 다음 3M 아세트산나트륨 30μL와 100% 에탄올 600μL를 추가합니다.
- 와류에 의해 혼합하고, DNA의 에탄올 침전을 위해 30-60 분 동안 -20 °C에 두십시오.
- 4°C에서 20분 동안 18,800× g 으로 원심분리하고 상층액을 버리고 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 헹굽니다. 10분 동안 원심분리를 반복한 다음 상층액을 완전히 제거합니다.
- 뚜껑을 열고 2분 동안 건조시킨 후 30μL의 뉴클레아제가 없는 물을 넣고 DNA 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다.
- 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 선형화된 DNA의 크기와 양을 확인합니다.
- T7 RNA 중합효소를 이용한 RNA 합성
- 10x 전사 완충액, ATP, GTP, UTP, CTP 및 T7 각각 2μL와 선형화된 DNA 1μg을 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 반응 부피를 20μL로 만듭니다.
- 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, RNA 합성을 위해 반응 혼합물을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 스핀 다운하고 1μL의 DNase(2U/μL)를 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 템플릿 DNA를 제거합니다.
- RNA의 염화 리튬 침전
- 반응 혼합물에 10μL의 염화 리튬(7.5M)을 추가합니다. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 -20°C에서 30분 동안 배양합니다.
- 4°C에서 20분 동안 18,800× g 의 원심분리기를 하고 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 70% 에탄올로 헹굽니다. 10분 동안 원심분리를 반복한 다음 상층액을 완전히 제거합니다.
- 뚜껑을 열고 2분 동안 건조시키고, 뉴클레아제가 없는 물 30μL를 첨가하고, RNA 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 상한
- RNA 샘플을 65°C에서 10분 동안 가열한 다음 얼음 위에 올려 냉각합니다.
- 10x 캡핑 완충액 각각 5μL, 10mM GTP 및 1mM(10x) S-아데노실메티오닌(SAM), 캡핑 효소 믹스 및 O-메틸전이효소 믹스 각각 2μL, RNase 억제제 1.25μL를 추가합니다. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
- 폴리(A) 테일링
- 샘플을 스핀다운한 다음 6μL의 뉴클레아제가 없는 물, 20μL의 5x E-PAP 완충액, 10μL의 25mMMnCl2, 10μL의 10mM ATP 및 4μL의 E-PAP 폴리(A) 테일링 효소를 추가합니다. 탭핑하여 혼합하고, 스핀 다운하고, 반응 혼합물을 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 합성 mRNA의 염화 리튬 침전 및 정량
- 50μL의 염화 리튬(7.5M)을 추가하고 1.3.1-1.3.3단계에 설명된 대로 염화 리튬 침전을 수행합니다.
- 분광광도계를 사용하여 mRNA의 농도를 측정합니다.
- 포름알데히드(1%-2%) 아가로스(1%) 겔 전기영동을 사용하여 mRNA의 크기와 양을 확인합니다.
2. 세포 침습 및 이동(CIM) 플레이트의 세포외 기질(ECM) 겔 코팅
참고: CIM(Cell Invasion and Migration) 플레이트는 임피던스 기반 실시간 세포 분석을 위해 상업적으로 제조된 16웰 플레이트입니다. 세포 침습 분석의 경우, 앞서 설명한 대로 CIM 플레이트를 ECM 겔로 코팅하되 일부 수정을 가한다11.
- 냉동실에서 ECM 겔 스톡의 부분 표본을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오.
- 마이크로 원심분리 튜브에 990μL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(혈청 또는 항생제 없음)과 10μL의 ECM 겔을 혼합하여 ECM 겔(10mg/mL)을 작동 농도(100μg/mL)로 희석합니다. 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.
- 희석된 ECM 겔 60μL를 CIM 플레이트 상부 챔버의 16개 웰 각각에 추가합니다. 기포를 피하면서 역 피펫팅 방법을 적용하십시오20,21.
참고: 각 세포주에 대한 ECM 겔의 농도를 최적화합니다. 교모세포종 세포주의 경우 최적화를 위해 0.1μg/μL - 1μg/μL ECM 겔을 사용했습니다. - 플레이트 덮개가 벗겨진 CIM 플레이트의 상부 챔버를 CO2 인큐베이터 내부의 보호 플라스틱 시트에 약 4시간 동안 놓아 겔 층을 형성합니다.
주의 : CIM 플레이트를 ECM 겔로 코팅하는 동안 CIM 플레이트 상부 챔버의 전극은 실험자의 손이나 생물 안전 캐비닛 또는CO2 인큐베이터를 포함한 장비 표면과 직접 접촉하지 않아야 합니다.
3. 종양세포의 준비
알림: 모든 세포 배양 물질은 멸균 상태로 유지해야 합니다. 앞서 설명한 바와 같이 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하여 생물 안전 캐비닛 아래에서 종양 세포를 채취하고 전기포가하지만 일부 수정을 가합니다11.
- 종양 세포의 배양
- 5%CO2 인큐베이터(배양 조건)에서 37°C에서 100mm x 20mm 폴리스티렌 조직 배양 접시당 5% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 항생제를 포함하는 10mL의 DMEM에 U-118MG 세포를 배양합니다(배양 조건).
- 종양 세포의 혈청 고갈
참고: FBS에 존재하는 화학 유인제에 대한 세포의 노출은 고농도의 FBS를 사용하여 세포 이동 및 침입 분석 전에 최소화해야 합니다.- 기존 배지를 제거하고 접시당 0.5% FBS 및 1% 항생제가 포함된 예열된 DMEM 10mL를 추가합니다(저혈청 배지).
- 3.2.1단계를 반복합니다.
- 세포를 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 이상 배양합니다.
- 종양 세포 채취
- 기존 배지를 제거하고, 접시당 예열된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 8mL를 추가하고, DPBS를 제거하고, 예열된 0.05% 트립신-EDTA(2mL/접시)를 추가하여 표면을 덮고, CO2 인큐베이터에서 30초 동안 배양합니다.
- 트립신-EDTA를 조심스럽게 흡입하고 저혈청 배지(접시당 7mL)를 추가한 다음 세포를 50mL 또는 15mL 원심분리 튜브에 수집합니다.
- 소량의 세포를 분취하고 휴대용 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.
- 총 세포 수와 10,000 cells/μL에 필요한 부피를 계산합니다.
- 실온에서 100× g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 회전시키고, 상층액을 흡인하고, 0.5% FBS(항생제 없음)를 포함하는 DMEM의 계산된 부피를 추가하고, 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다.
- 110만 개의 세포가 들어 있는 세포 현탁액 110μL를 각 처리를 위해 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 3.3.6단계를 반복하여 4가지 다른 처리를 위해 세포를 4개의 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
참고: CIM 플레이트에는 총 16개의 웰이 있습니다. 각 처리에 대해 CIM 플레이트의 웰 4개를 할당할 수 있도록 비교를 위해 4개의 서로 다른 처리를 설계합니다. 각 처리에 대해 웨스턴 블롯 분석(35mm 조직 배양 접시당 30만 개의 세포), 4개의 실시간 세포 이동 분석 웰(10만 개 세포/웰) 및 4개의 실시간 세포 침습 분석 웰(10만 세포/웰)과 같은 실험에 전기 천공 셀을 사용합니다. 실험 설계가 변경되는 경우 전기천공해야 하는 셀의 수를 조정합니다.
4. 종양 세포의 전기천공법
- 배지를 제거하려면 각 튜브의 세포 현탁액에 1mL의 DPBS를 추가하고, 미니 원심분리기를 사용하여 10초마다 튜브를 180° 회전시키면서 세포 현탁액을 매번 10초 동안 3회 회전시킨 다음, 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
알림: 작지만 쉽게 재현탁할 수 있는 셀 펠릿을 형성하는 것이 중요합니다. - 110μL의 재현탁 완충액 R을 세포 펠릿에 첨가하여 10μL에서 10만 개의 세포를 얻습니다.
- 세포 펠릿에 합성 mRNA를 첨가하여 원하는 발현 수준에 따라 0.2-20ng/μL의 농도를 얻습니다. 세포 펠릿을 가볍게 혼합하고 두드리거나 부드러운 피펫팅으로 재현탁합니다.
참고: 단백질 발현과 생물학적 효과 사이의 특정 상관 관계를 조사하기 위해 다양한 농도의 합성 mRNA를 사용하고, 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단백질 발현을 검사하고, 원하는 발현 수준으로 이어지는 합성 mRNA의 농도를 결정합니다. - 1,350V에서 전기천공법 시스템을 사용하여 10μL의 셀 현탁액을 매번 3개의 펄스로 10ms 동안 전기포레이션합니다.
- 전기천공된 세포를 0.5% FBS가 포함된 1.1mL의 DMEM이 있는 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 나머지 셀 현탁액이 전기천공될 때까지 전기천공법을 반복합니다. 마이크로 원심분리 튜브에 전기 천공된 세포를 결합하여 1.1mL에서 110만 개의 세포를 얻습니다.
참고: 100 μL 및 10 μL 전기천공법 팁은 모두 많은 양의 셀을 전기포레이션하는 데 사용할 수 있지만 10 μL 및 100 μL용 전기천공법 팁은 두 개의 별도 키트에 포함되어 있으며 별도로 구매해야 합니다. 재현탁 버퍼 R은 두 키트 모두에 포함되어 있습니다. - 각각의 전기천공법이 모두 완료되면 풀링된 셀을 부드럽게 재현탁합니다.
- 5% FBS가 함유된 2mL의 DMEM이 포함된 35mm x 10mm 폴리스티렌 조직 배양 접시에 30만 개의 세포를 플레이트하고 전체 세포 용해물 준비 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 배양 조건에서 1일 동안 세포를 배양합니다.
- 나머지 전기천공 셀은 실시간 셀 분석 시스템이 준비될 때까지 실온에 보관합니다.
5. 실시간 셀 분석기, 프로그램 및 CIM 플레이트 설정
참고: 앞에서 설명한 대로 Real-Time Cell 분석기와 두 개의 CIM 플레이트를 준비합니다11.
- Real-Time Cell 분석기의 평형
- 사용하기 몇 시간 전에 Real-Time 세포 분석기를CO2 인큐베이터로 이동하여 배양 조건에서 시스템을 평형화합니다.
- 분석 프로그램 설정
- 바탕 화면에서 실시간 세포 분석 소프트웨어 아이콘을 두 번 클릭하여 분석 프로그램을 엽니다.
- 기본 실험 패턴 설정 옵션이 열리면 세 가지 실험을 별도로 실행하는 옵션을 선택합니다.
알림: 각 크래들에는 별도의 창이 있습니다. 측정 간격 및 기간, 데이터 분석 및 기타 실험 조건을 설정하는 다양한 탭이 있습니다. - 번호 탭을 클릭하여 각 크래들을 엽니다.
- 실험 노트 탭을 클릭하고, 데이터를 저장할 폴더를 선택하고, 실험의 이름을 입력합니다.
- 레이아웃(Layout) 탭을 클릭하고 한 번에 4개의 웰을 선택하고 샘플 정보를 입력하여 각 처리 조건에 대해 4개의 웰을 설정한 다음 적용(Apply)을 클릭합니다.
- Schedule(일정) 탭 | 셀 임피던스 측정의 2단계 모드를 설정하는 단계를 추가합니다. 그런 다음 적용을 클릭하여 첫 번째 단계를 설정합니다.
- 단계 추가를 다시 클릭하고, 간격에 10분, 이동 및 침입 기간에 48시간을 입력한 다음, 적용을 클릭하여 두 번째 단계를 설정합니다.
알림: 첫 번째 단계는 일회성 기준선 측정(1분 간격으로 한 번의 스윕)을 수행합니다. 두 번째 단계는 크래들에서 실험에 대한 셀 임피던스를 측정합니다(예: 48시간 동안 10분 간격으로 289회 스윕). 실험 설계에 따라 간격과 기간을 조정합니다. - 다음 크래들로 이동하고 5.2.3-5.2.7단계를 반복하여 설정합니다.
- CIM 플레이트 준비
- 세포 임피던스 측정이 시작되기 1시간 전에 CIM 플레이트의 하부 챔버 웰을 10% 혈청 또는 기타 화학 유인제가 포함된 160μL의 DMEM으로 채웁니다.
- ECM 겔 코팅된 웰(침습용) 또는 코팅되지 않은 웰(이동용)이 포함된 상부 챔버를 하부 챔버와 함께 조립합니다.
- 세포 이동 분석을 위해 CIM 플레이트의 상부 챔버 웰에 50μL의 저혈청 배지를 추가하고 CIM 플레이트를 시스템의 크래들에 놓습니다.
- 메시지 탭을 클릭하고 연결 확인 메시지가 표시되는지 확인합니다. 이제 CIM 플레이트를 실험할 준비가 되었습니다.
- CIM 플레이트를 배양 조건에 적응시키기 위해 실시간 세포 분석 전에CO2 인큐베이터에서 30-60분 동안 조립된 CIM 플레이트를 사전 배양합니다.
6. 실시간 세포 분석 및 데이터 내보내기
알림: 앞서 설명한 대로 기준선 판독, 셀 시드, 셀 임피던스 측정 및 데이터 내보내기를 수행합니다11.
- 기준선 판독값
알림: 기준선은 CIM 플레이트가 적응된 후 셀이 상부 챔버의 웰에 추가되기 전에 판독해야 합니다.- 각 크래들의 시작 버튼을 클릭합니다. 다른 이름으로 저장 창이 나타나면 실험 파일을 저장하여 기준선 읽기를 수행합니다.
- 세포 시딩(Cell seeding)
- 크래들에서 CIM 플레이트를 제거하고 플레이트 홀더의 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.
- 제어 장치의 프로그램에 따라 100μL(100,000개 세포 포함)의 전기 천공된 셀을 CIM 플레이트의 상부 챔버 웰에 추가합니다. 기포를 피하면서 역 피펫팅 방법을 적용하십시오.
- CIM 플레이트를 생물 안전 캐비닛 아래에 실온에서 30분 동안 그대로 두어 세포가 웰 바닥에 고르게 퍼지도록 합니다.
- 셀 임피던스 측정
- 완전히 조립된 CIM 플레이트를 해당 크래들로 다시 이동합니다. 크래들 시작 버튼을 클릭하여 두 번째 단계의 셀 임피던스 측정을 시작합니다.
- 플롯 탭을 클릭한 다음 모두 추가 버튼을 클릭하고 평균 및 STD DEV 상자를 선택하여 데이터를 실시간으로 시각화합니다.
참고: 기본 플로팅 옵션은 x축의 경우 시간 이고 y축의 경우 셀 색인 입니다. 플롯 선택 섹션에서는 사용자가 y축에 대한 대체 옵션( 정규화된 셀 인덱스 또는 델타 셀 인덱스)을 선택할 수 있습니다. 최종 스윕이 완료되면 실험이 완료되고 결과가 자동으로 저장됩니다.
- 분석을 위한 데이터 내보내기
- 플롯 탭을 클릭하고 평균 및 STD DEV 상자를 선택하여 각 웰에 대한 데이터를 개별적으로 복사합니다.
- 플롯 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 목록 형식으로 데이터 복사를 선택합니다.
- 빈 스프레드시트 파일을 열고 데이터를 붙여 넣은 다음 파일을 저장합니다.
- 분석 프로그램으로 돌아가서 각 크래들에 대한 플레이트 탭을 클릭하고 해제 를 선택하여 크래들에 대한 실험을 닫습니다.
- 스프레드시트 파일로 돌아가서 두 번째 단계의 시작 시간이 실제 측정 시작 시간이 되도록 원시 데이터의 시간을 조정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Crk 및 CrkL 단백질은 뉴런22, T 세포23, 섬유아세포 18,19 및 다양한 종양 세포13를 포함한 많은 세포 유형의 운동성에 중요한 역할을 한다. Crk 및 CrkL 단백질이 교모세포종24,25,26에서 상승하는 것으로 보고되었기 때문에 Crk의 접합 변이체인 CrkI의 과발현이 교모세포종 세포 이동에 미치는 영향을 이 연구에서 연구했습니다. U-118MG 세포를 다양한 농도의 합성 CrkI mRNA로 전기천공하고 단백질 수준 및 세포 이동을 분석했습니다. 다양한 농도의 합성 CrkI mRNA를 사용한 U-118MG 교모세포종 세포의 전기천공법은 형질주입 1일 후 FLAG-태그된 CrkI 단백질의 농도 의존적 증가를 초래했습니다(그림 1A). 0.2ng/μL 및 2ng/μL mRNA는 외인성 CrkI 단백질의 검출 불가능하거나 중간 정도의 발현을 유도한 반면, 20ng/μL mRNA는 내인성 CrkI 단백질보다 훨씬 더 높은 발현 수준을 보였습니다.
실시간 세포 분석 시스템을 사용한 세포 이동 분석 결과는 0.2ng/μL 또는 2ng/μL CrkI mRNA를 사용한 전기천공법이 세포 이동에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나 20ng/μL CrkI mRNA를 사용한 전기천공법은 2시간에서 13시간 사이에 더 많은 세포가 이동하면서 세포 이동을 명확하게 자극했습니다(그림 1B). CrkI 단백질 수준과 세포 이동을 비교한 결과, 교모세포종 세포 이동은 CrkI 단백질 수준의 증가에 의해 자극되는 것으로 나타났습니다. CrkI 단백질 수준은 세포 이동의 상당한 자극을 유발하기 위해 특정 임계값보다 높아야 하는 것으로 보입니다. 특정 시점에서 이동된 세포를 계수하거나 관찰하기 위해 세포 이동을 다른 방식으로 측정했다면 세포 이동에서 이러한 종류의 변화를 식별하기 위해 훨씬 더 많은 노력이 필요했을 것입니다.
CrkL 과발현이 ECM 단백질의 농도가 다른 ECM 겔층을 통해 교모세포종 세포 침습에 어떻게 영향을 미치는지 연구하기 위해 U-118MG 세포를 합성 CrkL mRNA로 전기천공하고 ECM 겔 층을 통해 단백질 수준 및 세포 침습 측면에서 분석했습니다. 합성 CrkL mRNA를 사용한 U-118MG 교모세포종 세포의 전기천공법은 transfection 1일 후에 FLAG-tagged CrkL 단백질의 강력한 발현을 유도했습니다(그림 2A). ECM 단백질의 농도가 증가함에 따라 대조 세포의 침입이 느려졌습니다(그림 2B). CrkL 과발현 세포는 또한 세포 침습에서 ECM 겔 농도에 따른 감소를 보여주었습니다(그림 2C). 서로 다른 ECM 겔 농도에서 대조군과 CrkL 과발현 세포를 비교한 결과, CrkL 과발현이 일반적으로 ECM 겔 층을 통한 세포 침입을 자극하는 것으로 나타났습니다(그림 2D-G). 그러나, 두 세포 집단 사이의 차이는 ECM 겔 농도에 따라 다른 시점에서 명백해졌다.
0.1μg/μL ECM 겔의 경우, 세포 침습에 대한 CrkL 과발현 매개 자극은 8시간에서 20시간 사이에 분명했지만(그림 2D), 세포 침습의 차이는 32시간 후에 무시할 수 있는 수준이었습니다. 0.2μg/μL ECM 겔의 경우, CrkL 과발현이 있을 때와 없을 때의 세포 침습 차이는 항상 미미했습니다(그림 2E). 0.5μg/μL ECM 겔의 경우 24시간과 36시간 사이에 세포 침습의 차이가 분명했습니다(그림 2F). 1μg/μL ECM 겔의 경우, 세포 침습에 대한 CrkL 과발현 효과는 48시간에 약간 분명해졌습니다(그림 2G). 결과는 ECM 겔의 농도가 증가함에 따라 대조군과 CrkL 과발현 세포 간의 차이를 감지하는 창이 나중으로 이동한다는 것을 시사합니다. 결과는 또한 두 세포 집단이 서로 다른 시점에서 ECM 겔 농도의 증가에 의해 차별적으로 영향을 받았음을 시사합니다. 예를 들어, 12시간에서 CrkL 과발현 세포는 0.1μg/μL ECM 겔에서만 실질적으로 더 높은 침습을 보여주었습니다(그림 2H). 그러나 24시간에서 CrkL 과발현 세포는 테스트된 ECM 겔 농도에서 약간 더 높거나 유사한 침습을 보였습니다(그림 2I). 따라서 세포 침습에서 시간 의존적 및 ECM 겔 농도 의존적 차이를 모두 조사하여 CrkL 과발현이 있는 경우와 없는 경우 두 세포 집단 간의 차이에 대한 포괄적인 관점을 얻는 것이 중요합니다. 이러한 결과는 합성 mRNA를 사용한 일시적 과발현과 임피던스 기반 실시간 세포 분석을 결합하면 유전자 과발현과 종양 세포 이동 및 침습 사이의 잠재적 상관관계를 분석할 수 있는 강력한 도구를 제공한다는 것을 보여줍니다. 합성 mRNA와 ECM 겔의 농도 변화 효과를 조사하면 보다 정확하고 상세한 정보를 얻을 수 있습니다.
그림 1: CrkI 과발현이 교모세포종 세포 이동에 미치는 영향. U-118MG 세포는 FLAG-표지된 CrkI mRNA의 지시된 농도(ng/μL)로 전기천공하였다. (A) 웨스턴 블롯 분석의 경우, 전천공된 세포를 전체 세포 용해물 제조 전 1일 동안 배양하였다. 합성 CrkI mRNA로 transfection할 때의 단백질 수준을 비교하였다. 항-Crk 및 항-CrkL 항체를 사용하여 내인성 및 FLAG-표지 단백질을 모두 검출하고 내인성 단백질과 FLAG-표지 단백질 간의 비율을 비교하였다. Vinculin과 α-tubulin은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. (B) 세포 이동 분석을 위해, 전기천공된 세포를 추가 배양 없이 CIM 플레이트에 도말하였다. 세포 지수 값은 각 샘플에 대해 4개의 웰에서 얻었으며 평균 ± SD 값이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 교모세포종 세포 침습에 대한 CrkL 과발현의 효과. U-118MG 세포를 뉴클레아제가 없는 H 2O 또는20ng/μL FLAG-태그된 CrkL mRNA로 전기천공하였다. (A) 웨스턴 블롯 분석의 경우, 전천공된 세포를 전체 세포 용해물 제조 전 1일 동안 배양하였다. 합성 CrkL mRNA로 transfection할 때의 단백질 수준을 비교하였다. 항-Crk 및 항-CrkL 항체를 사용하여 내인성 및 FLAG-표지 단백질을 모두 검출하고 내인성 단백질과 FLAG-표지 단백질 간의 비율을 비교하였다. Vinculin과 α-tubulin은 로딩 컨트롤로 사용되었습니다. (비지) 세포 침습 분석을 위해 전기천공된 세포를 추가 배양 없이 ECM 겔 코팅이 적용된 CIM 플레이트에 도금했습니다. 세포 지수 값은 각 샘플에 대해 4개의 웰에서 얻었으며 평균 ± SD 값이 표시됩니다. (B) ECM 겔 농도가 다른 대조 세포의 세포 침습 데이터를 비교했습니다. (C) 다양한 ECM 겔 농도를 갖는 CrkL-과발현 세포로부터의 세포 침습 데이터를 비교하였다. (디지) 대조군과 CrkL-과발현 세포 사이의 세포 침습 데이터를 표시된 ECM 겔 농도에 대해 비교했습니다. (H) 대조군과 CrkL 과발현 세포 사이의 12시간 세포 침습 비교. (I) 대조군과 CrkL 과발현 세포 사이의 24시간 세포 침입 비교. 약어: ECM = 세포외 기질; CIM = 세포 침입 및 이동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유전자 knockdown 또는 유전자 과발현 에 따른 실험 절차의 개략도. (A) siRNA transfection에 따른 실시간 세포 분석의 실험 절차. 실험 조건 하에서 siRNA transfection 후 완전한 유전자 knockdown을 유도하는 데 3-4일이 필요하기 때문에, 세포는 전기천공법 후 3일 동안 재도금되고 배양된 후 Real-Time 세포 분석을 위한 준비가 되었습니다. (B) 합성 mRNA transfection에 따른 실시간 세포 분석을 위한 실험 절차. 합성 mRNA transfection의 단백질 발현이 빠르기 때문에 전기천공된 세포는 같은 날 실시간 세포 분석에 사용되었습니다. 두 실험 절차의 차이점에 유의하십시오. siRNA를 이용한 유전자 knockdown을 위한 electroporation 3일 후에 real-time cell 분석을 수행한 반면, 합성 mRNA를 이용한 유전자 과발현에 대한 electroporation 직후에 real-time cell 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이동과 침입은 종양 세포의 중요한 특징입니다. 종양 세포의 운동성을 측정하고 종양 세포 운동성을 조절하는 근본적인 메커니즘을 이해하면 치료 개입에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다 2,27. 세포 이동을 연구하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었다7. 스크래치 또는 배양 삽입물을 사용하는 상처 치유 분석은 간극 봉합의 대조 이미지를 제공하는 간단하고 자주 사용되는 방법입니다. 개별 세포 추적 분석은 세포에 형광 염료를 태깅할 수 있는 타임 랩스 이미징으로 개별 세포를 모니터링해야 합니다. 상처 치유 분석과 개별 세포 추적 분석은 모두 세포의 자발적인 움직임을 측정합니다.
타임랩스 이미징 및 집중적인 요청 후 데이터 처리의 도움으로, 두 분석 모두 샘플 간의 정량적 비교를 제공할 수 있다28. 그러나 이러한 분석법은 ECM 단백질 층을 통한 세포 침입을 연구하는 데 적합하지 않습니다. 대조적으로, 트랜스웰 이동 및 침습 분석은 ECM 단백질 층이 있거나 없는 트랜스웰 삽입 멤브레인을 통한 유도된 세포 이동을 측정합니다. 그러나 마이그레이션된 세포를 주어진 시점에 수집해야 하고 트랜스웰을 다시 사용할 수 없기 때문에 이러한 분석으로는 지속적인 모니터링이 불가능합니다. 이러한 모든 분석은 데이터 처리 또는 세포를 수집하고 계수하기 위한 실습 실험에 상당한 시간과 노력이 필요하며, 이로 인해 잠재적인 작업자 관련 변동이 발생할 수 있습니다. 이러한 분석의 가장 큰 과제는 다양한 시점에서 여러 복합 치료법을 정교하게 정량적으로 비교하는 것입니다.
이 연구에서 제시된 실시간 세포 분석 시스템을 사용하면 세포 이동 및 침입을 측정하기 위한 정량적, 지속적, 포괄적 모니터링이 가능하며, 이 시스템은 제한적이고 고정된 시점에서 결과를 제공하는 다른 단순 세포 운동성 분석에 비해 많은 장점이 있습니다. 다른 분석법과 마찬가지로 실시간 세포 분석의 실험 조건은 각 세포주에 맞게 최적화되어야 하는데, 이는 서로 다른 세포주의 이동 및 침입이 세포 수에 의해 차별적으로 영향을 받을 수 있기 때문입니다. 또한 ECM 겔의 농도가 증가함에 따라 세포 침습률이 감소합니다(그림 2B,C). 따라서 서로 다른 ECM 겔 농도를 테스트하고 이러한 다양한 ECM 겔 농도에서 세포 침입에 대한 유전자 발현 변화의 효과를 비교하는 것이 좋습니다.
실시간 세포 분석 시스템을 사용하면 분석 시스템이 수작업 시간 없이 실시간으로 데이터를 생성하므로 최적화가 쉽고 간단합니다. 분석 시스템은 세포가 얼마나 빨리 이동 또는 침입하는지, 그리고 언제 최대 세포 이동 또는 침습 수준에 도달하는지 식별합니다. 세포 운동성에 대한 이 정보를 얻으면 다양한 치료 그룹 간의 상세한 비교 분석이 가능하며, 이는 프로그램의 내장 기능을 사용하여 간단히 수행할 수 있습니다. 또한 실시간 분석 시스템의 감도를 통해 그림 1 및 그림 2에서 볼 수 있듯이 농도 의존적 유전자 발현에 의한 세포 이동 및 침입의 미묘한 변화를 식별하고 정량화할 수 있습니다.
기존에는 임피던스 기반 실시간 세포 분석 시스템을 이용하여 유전자 knockdown에 따른 종양 세포 이동 및 침습을 측정하는 상세한 절차가 제공되었습니다. 유전자 knockdown은 세포가 siRNA로 전기천공된 후 3-4일이 걸리기 때문에 전기천공법 후 세포를 다시 도금했습니다. 전기천공된 세포는 실시간 세포 분석을 위해 재수확하기 전에 3일 동안 배양되었으며, 그림 3과 같이 전체 실험을 1일차의 전기천공법과 4일차의 실시간 세포 분석의 2단계 프로세스로 만들었습니다. 대조적으로, 합성 mRNA를 가진 세포의 electroporation에 유전자 발현은 GFP를 위한 합성 mRNA로 electroporated 섬유아세포의 타임 랩스 분석이 transfection 후에 강한 GFP 신호 5 h를 보여주기 때문에, 급속하고 능률적입니다; 형광 강도는 약 24시간 동안 최대치에 도달하였고, 그 후 형광 신호(18)는 점진적으로 감소하였다.
또한, 이 연구에서 U-118MG 세포는 CrkI(그림 1A) 및 CrkL(그림 2A)에 대해 합성 mRNA로 전기천공했을 때 이전 관찰8과 일치하는 외인성 단백질의 강력한 발현을 보여주었습니다. 따라서 전기천공법 직후에 실시간 세포 분석을 수행하는 것이 적절합니다. 실시간 세포 분석을 위한 일부 단계는 전기천공법을 위해 세포를 수확하기 전에 수행해야 합니다. 전체 실험은 1일차에 전기천공법과 실시간 세포 분석을 포함하는 원스텝 프로세스입니다. 임피던스 기반 실시간 세포 분석 시스템은 유방암(29), 대장암(30), 흑색종(31), 난소암(32), 두경부암(33), 신세포암(34), 췌장암(35), 간세포암(36), 비소세포폐암(10) 등 다양한 고형종양세포의 종양세포 이동 및 침습을 연구하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 따라서 mRNA를 사용한 유전자 과발현 또는 siRNA를 사용한 유전자 knockdown을 함께 사용하면 세포 이동 및 침입을 실시간으로 측정할 수 있습니다.
이 프로토콜의 한계는 이 방법이 세포 이동 및 침입을 측정하기 직전에 세포를 해리하고 수확해야 한다는 것입니다. 해리, 수확 및 재현탁 동안의 효소 및 기계적 처리는 분석에 영향을 미칠 수 있다37. 또한 세포가 효소 및 기계적 처리에서 회복되는 동안 세포 이동이 지연될 수 있습니다. 이 방법은 세포가 단일 세포 해리 및 수집 중에 트립신화 또는 기타 기계적 처리에 의해 쉽게 손상되거나 이러한 조작 후 긴 회복 시간이 필요한 경우 적합하지 않을 수 있습니다. 이러한 제한은 트랜스웰 이동 분석에도 적용되는데, 이는 유도된 세포 이동을 측정하기 위한 또 다른 방법입니다. 또한, 세포 제조에 따른 전기천공법은 세포를 손상에 더 취약하게 만들 수있다 38. 따라서 각 세포주에 대한 전기천공법 조건을 최적화하고 보다 정확한 비교를 위해 대조군 세포를 전기포하는 것이 중요합니다.
electroporation 시스템에 대한 제조업체의 홈페이지는 electroporation에 대한 권장 매개 변수를 제공합니다 ( 재료 표의 각주 참조). 세포 해리 및 재현탁 중에 일관되고 손상을 최소화하는 실험 조건을 사용하는 것은 재현 가능한 결과를 얻는 데 매우 중요합니다. 또한 mRNA의 양, 단백질 수준 및 세포 운동성의 상관 관계는 mRNA transfection의 특이적 효과와 비특이적 효과를 구별하는 데 매우 중요합니다. 이 연구에서는 mRNA 농도가 일정 수준을 초과하면 세포 이동 및 침입을 포함한 세포 기능을 비특이적으로 억제하는 것이 관찰되었습니다(데이터 미표시). 따라서 mRNA의 농도를 적정하는 것이 중요합니다. 또한 단백질 발현은 mRNA transfection에서 일시적이기 때문에 단백질 발현이 피크 수준에 있을 때 실시간 세포 분석을 수행하는 것이 중요합니다. 다른 세포 운동성 분석과 마찬가지로 이 실시간 세포 분석의 결과는 이동 중 세포의 증식으로 인해 혼동될 수 있습니다. 따라서 세포 증식이 세포 이동 및 침습 결과에 미치는 영향을 이해하기 위해 세포 증식 분석을 추가로 수행하는 것이 좋습니다.
Crk 및 CrkL의 단백질 수준은 일부 유형의 인간 암에서 상승하는 것으로 알려져 있습니다. Crk 및 CrkL의 발현은 다양한 종양 세포 기능과 상관관계가 있고 이들의 과발현은 예후를 악화시키는 데 기여하기 때문에 Crk 및 CrkL은 암 치료의 치료 표적으로 제안되었다13. 이전에는 교모세포종 세포에서 유전자 녹다운을 유도하여 교모세포종 세포의 이동 및 침습이 Crk 및 CrkL 활성의 강력한 마커임을 입증했습니다. 본 연구는 합성 mRNA를 이용하여 Crk 및 CrkL의 과발현을 유도하기 위한 체계적인 유전자 발현 접근법을 제공한다. 실시간 세포 분석 시스템을 사용하여 Crk 및 CrkL의 단백질 수준과 교모세포종 세포 이동 및 침습 사이에 밀접한 상관 관계를 얻었습니다. 이 결과는 Crk와 CrkL이 교모세포종 세포 이동 및 침습에 필수적인 역할을 한다는 가설을 뒷받침합니다. 이전 방법 논문11과 함께 이 연구는 유전자 발현의 변화와 종양 세포 이동 및 침입 사이의 잠재적 상관 관계를 조사하기 위한 개념 증명 접근 방식을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 이 원고를 편집해 준 Children's Mercy Kansas City의 Medical Writing Center에 감사를 표합니다. 이 작업은 Natalie's A.R.T. Foundation(T.P.)과 Children's Mercy Hospital(CMH) 및 University of Kansas Cancer Center(KUCC)의 MCA Partners Advisory Board 보조금(T.P.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
References
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
