Summary
Muchos genes regulados al alza estimulan la migración y la invasión de las células tumorales, lo que lleva a un mal pronóstico. Es fundamental determinar qué genes regulan la migración y la invasión de las células tumorales. Este protocolo presenta un método para investigar los efectos del aumento de la expresión de un gen en la migración e invasión de células tumorales en tiempo real.
Abstract
Las células tumorales son altamente móviles e invasivas y muestran patrones de expresión génica alterados. El conocimiento de cómo los cambios en la expresión génica regulan la migración e invasión de células tumorales es esencial para comprender los mecanismos de infiltración de células tumorales en los tejidos sanos vecinos y la metástasis. Anteriormente, se demostró que la eliminación de genes seguida de la medición en tiempo real basada en impedancia de la migración e invasión de células tumorales permite la identificación de los genes necesarios para la migración e invasión de células tumorales. Recientemente, las vacunas de ARNm contra el SARS-CoV-2 han aumentado el interés en el uso de ARNm sintético con fines terapéuticos. Aquí, se revisó el método que utiliza ARNm sintético para estudiar el efecto de la sobreexpresión génica en la migración e invasión de células tumorales. Este estudio demuestra que la expresión génica elevada con transfección sintética de ARNm seguida de una medición en tiempo real basada en impedancia puede ayudar a identificar los genes que estimulan la migración e invasión de células tumorales. Este artículo sobre el método proporciona detalles importantes sobre los procedimientos para examinar el efecto de la expresión génica alterada en la migración e invasión de células tumorales.
Introduction
La motilidad de las células tumorales juega un papel crucial en la metástasis 1,2. La diseminación de las células tumorales a los tejidos sanos vecinos y remotos dificulta el tratamiento del cáncer y contribuye a la recurrencia 3,4. Por lo tanto, es esencial comprender los mecanismos de motilidad de las células tumorales y desarrollar estrategias terapéuticas relevantes. Dado que muchas células tumorales tienen perfiles de expresión génica alterados, es crucial comprender qué cambios en el perfil de expresión génica conducen a una motilidad alterada de las células tumorales 5,6.
Se han desarrollado varios ensayos para medir la migración celular in vitro. Algunos ensayos solo proporcionan información limitada debido a que solo permiten mediciones en puntos de tiempo específicos, mientras que otros ofrecen información completa sobre la motilidad de las células tumorales en tiempo real7. Aunque muchos de estos ensayos de motilidad celular pueden proporcionar resultados cuantitativos en un momento dado o en el punto final, no proporcionan información suficientemente detallada sobre los cambios dinámicos en la tasa de migración celular durante el período experimental. Además, puede ser difícil examinar los posibles cambios en la tasa de migración celular dependiendo del diseño experimental, los tipos de células y el número de células. Además, los efectos de los tratamientos sin complicaciones pueden investigarse mediante la cuantificación simple de los ensayos de motilidad tradicionales, pero puede ser necesaria una cuantificación más sofisticada para estudiar los efectos complejos de varios tratamientos combinados8.
Se ha desarrollado un instrumento para monitorizar la corriente eléctrica de un pozo de placa de microtitulación cubierto con microelectrodos9. La adhesión de las células a la superficie del pozo impide el flujo de electrones, y la impedancia se correlaciona con la unión cuantitativa y cualitativa de las células. La presencia de los microelectrodos en el fondo del pozo permite medir la adhesión, propagación y proliferación celular. La presencia de los microelectrodos debajo de una membrana microporosa de la cámara superior permite medir la migración celular y la invasión hacia la cámara inferior, con la cámara superior recubierta con proteínas de la matriz extracelular (MEC) para permitir la invasión10.
Anteriormente, se demostró que las mediciones en tiempo real basadas en impedancia de la migración e invasión de células tumorales proporcionan datos en tiempo real durante todo el experimento, así como comparaciones y cuantificaciones instantáneas en diversas condiciones experimentales11. En ese artículo de método, se indujo la eliminación de genes para probar el papel de las proteínas de interés en la migración e invasión de células tumorales. Dado que un efecto de eliminación de genes en toda regla en las condiciones experimentales probadas tardó 3-4 días después de la electroporación con pequeños ARN interferentes (siRNAs)8, las células se recolocaron después de la electroporación y se volvieron a cosechar 3 días después para la medición en tiempo real basada en la impedancia de la migración e invasión de las células tumorales.
CT10 regulador de la quinasa (Crk) y similar a la Crk (CrkL) son proteínas adaptadoras que median las interacciones proteína-proteína aguas abajo de varias vías de la quinasa receptora del factor de crecimiento y las vías de la tirosina quinasa no receptora12. Los niveles elevados de las proteínas Crk y CrkL contribuyen a un mal pronóstico en varios cánceres humanos, incluido el glioblastoma13. Sin embargo, no está claro cómo las proteínas Crk y CrkL elevadas conducen a un mal pronóstico. Por lo tanto, es importante definir el efecto de la sobreexpresión de Crk y CrkL sobre las funciones de las células tumorales. Anteriormente, se realizó un estudio de knockdown génico para demostrar que los niveles endógenos de las proteínas Crk y CrkL son necesarios para la migración e invasión de células de glioblastoma8. Aquí, se ha desarrollado un sistema de ensayo modificado para abordar el efecto de la sobreexpresión de Crk y CrkL en la migración e invasión de células tumorales.
Recientemente, la síntesis in vitro de ARNm y sus aplicaciones terapéuticas han vuelto a llamar la atención debido al desarrollo de las vacunas de ARNm contra el SARS-CoV-2 (revisado por Verbeke et al.14). Además, se han logrado avances notables en el uso de ARNm sintético en cáncer y otras enfermedades15,16. La electroporación de células es un método eficaz para administrar ARNm sintético e inducir modificaciones genéticas transitorias (revisado por Campillo-Davo et al.17), y el uso de ARNm sintético permite una expresión génica rápida y eficiente en fibroblastos inmortalizados18. Este artículo de método combina la sobreexpresión génica utilizando ARNm sintético con análisis celulares en tiempo real para estudiar la migración e invasión de células tumorales. Sin embargo, el esquema experimental utilizado para los siRNAs no funciona con la transfección de ARNm sintético, ya que el nivel de proteínas exógenas aumenta rápidamente y disminuye gradualmente tras la transfección de ARNm sintético18. Por lo tanto, el método se ha modificado para llevar a cabo el análisis en tiempo real de la migración e invasión celular justo después de la transfección sin cultivar adicionalmente las células.
Este artículo de método demuestra que la combinación de mediciones en tiempo real basadas en impedancia con la transfección de células tumorales con ARNm sintéticos proporciona un análisis rápido y completo de los efectos de la regulación positiva de genes en la migración e invasión de células tumorales. Este artículo describe procedimientos detallados para medir cómo la migración y la invasión de las células de glioblastoma se ven afectadas por la sobreexpresión de Crk y CrkL. Al examinar los efectos dependientes de la concentración del ARNm sintético en la migración de células tumorales, el artículo describe claramente cómo un aumento en los niveles de proteínas estimula la migración de células tumorales. Además, se presenta un enfoque de variación de la concentración del gel de MEC para evaluar los efectos de los cambios en la expresión génica sobre la invasión de células tumorales.
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Protocol
1. Síntesis de ARNm
NOTA: Para la síntesis de ARNm, todos los reactivos y equipos deben ser tratados especialmente para inactivar las ARNasas antes de su uso. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.
- Linealización del ADN
NOTA: Los ADNc de ratón de CrkI y CrkL se clonaron en el vector de expresión pFLAG-CMV-5a para añadir la etiqueta de epítopo FLAG en el extremo C-terminal y se subclonaron en el vector pcDNA3.1/myc-His para incorporar el promotor T7, como se ha descrito anteriormente18,19.- Añadir 10 μL de tampón de reacción 10x, 1,5 μL de PmeI (10.000 unidades/mL) y 10 μg de ADN plasmídico a un tubo de microcentrífuga para linealizar el ADN plasmídico con la enzima de restricción. Agregue agua sin nucleasa para llevar el volumen de reacción a 100 μL.
- Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante la noche.
- Centrifugar y añadir 5 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% y 1 μL de proteinasa K (20 mg/mL, grado ARN) a la mezcla de reacción. Mezclar golpeando, centrifugar e incubar a 50 °C durante 30 min.
- Debajo de la campana extractora, agregue 100 μL de la fase inferior de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico a la mezcla de reacción de plásmidos. Vórtice y luego centrifugar a 18.800 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Mueva la fase superior a un nuevo tubo.
- Repita el paso 1.1.4 con cloroformo:alcohol isoamílico a 24:1.
- En el nuevo tubo, lleve el volumen de reacción a 300 μL agregando 200 μL de agua libre de nucleasa, y luego agregue 30 μL de acetato de sodio 3 M y 600 μL de etanol al 100%.
- Mezclar por vórtice y luego colocar a -20 °C durante 30-60 min para la precipitación de etanol del ADN.
- Centrifugar a 18.800 × g durante 20 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y enjuagar el pellet con 1 mL de etanol al 70%. Repita la centrifugación durante 10 minutos y luego retire el sobrenadante por completo.
- Secar con el tapón abierto durante 2 min, añadir 30 μL de agua sin nucleasa y volver a suspender el gránulo de ADN.
- Determinar la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro.
- Verificar el tamaño y la cantidad del ADN linealizado mediante electroforesis en gel de agarosa.
- Síntesis de ARN utilizando la ARN polimerasa T7
- Agregue 2 μL de cada uno de 10x tampón de transcripción, ATP, GTP, UTP, CTP y T7 y 1 μg de un ADN linealizado a un tubo de microcentrífuga. Añadir agua sin nucleasa para llevar el volumen de reacción a 20 μL.
- Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 2 h para la síntesis de ARN.
- Centrifugar, añadir 1 μL de DNasa (2 U/μL) e incubar a 37 °C durante 15 min para eliminar el ADN molde.
- Precipitación de cloruro de litio del ARN
- Añadir 10 μL de cloruro de litio (7,5 M) a la mezcla de reacción. Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a -20 °C durante 30 min.
- Centrifugar a 18.800 × g durante 20 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y enjuagar el pellet con 500 μL de etanol al 70%. Repita la centrifugación durante 10 minutos y luego retire el sobrenadante por completo.
- Secar con el tapón abierto durante 2 min, añadir 30 μL de agua libre de nucleasa y volver a suspender el gránulo de ARN.
- Capsular
- Calentar la muestra de ARN a 65 °C durante 10 minutos y, a continuación, colocarla en hielo para que se enfríe.
- Agregue 5 μL de cada uno de 10x de tampón de taponamiento, 10 mM de GTP y 1 mM (10x) de S-adenosilmetionina (SAM), 2 μL de cada una mezcla de enzimas de recubrimiento y una mezcla de enzimas O-metiltransferasa, y 1,25 μL de inhibidor de RNasa. Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 1 h.
- Relaves Poly(A)
- Gire la muestra y luego agregue 6 μL de agua libre de nucleasas, 20 μL de tampón E-PAP 5x, 10 μL de 25 mM MnCl2, 10 μL de ATP 10 mM y 4 μL de enzima de relaves E-PAP poli(A). Mezclar golpeando, centrifugar e incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 2 h.
- Precipitación de cloruro de litio y cuantificación del ARNm sintético
- Añadir 50 μL de cloruro de litio (7,5 M) y realizar la precipitación de cloruro de litio como se describe en los pasos 1.3.1-1.3.3.
- Mida la concentración del ARNm con un espectrofotómetro.
- Verificar el tamaño y la cantidad de ARNm mediante electroforesis en gel de formaldehído (1%-2%) de agarosa (1%).
2. Recubrimiento en gel de matriz extracelular (MEC) de las placas de invasión y migración celular (CIM)
NOTA: Una placa de invasión y migración celular (CIM) es una placa de 16 pocillos fabricada comercialmente para el análisis celular en tiempo real basado en impedancia. Para el ensayo de invasión celular, recubra las placas CIM con gel ECM, como se describió anteriormente, pero con algunas modificaciones11.
- Retire una alícuota de caldo de gel ECM del congelador y manténgala en hielo.
- Diluir el gel de ECM (10 mg/mL) a una concentración de trabajo (100 μg/mL) mezclando 990 μL de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco (sin suero ni antibióticos) con 10 μL de gel de ECM en un tubo de microcentrífuga. Mezclar mediante un pipeteo suave.
- Añadir 60 μL de gel de ECM diluido a cada uno de los 16 pocillos de la cámara superior de la placa CIM. Aplicar el método de pipeteo inverso evitando las burbujas de aire20,21.
NOTA: Optimice la concentración del gel de ECM para cada línea celular. Para las líneas celulares de glioblastoma, se utilizó gel de ECM de 0,1 μg/μl a 1 μg/μl para la optimización. - Coloque la cámara superior de la placa CIM sin la cubierta de la placa sobre una lámina protectora de plástico dentro de una incubadora deCO2 durante aproximadamente 4 h para formar una capa de gel.
PRECAUCIÓN: Durante el recubrimiento de la placa CIM con gel ECM, los electrodos de la cámara superior de la placa CIM no deben tener contacto directo con las manos del experimentador o las superficies del equipo, incluida la cabina de bioseguridad o la incubadora de CO2 .
3. Preparación de las células tumorales
NOTA: Todos los materiales de cultivo celular deben mantenerse estériles. Recolectar y electropopar las células tumorales bajo una cabina de seguridad biológica con equipo de protección personal (EPP) adecuado, como se describió anteriormente, pero con algunas modificaciones11.
- Cultivo de las células tumorales
- Cultivo de células U-118MG en 10 mL de DMEM que contienen un 5% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de antibióticos por placa de cultivo de tejidos de poliestireno de 100 mm x 20 mm a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% (condición de cultivo).
- Depleción sérica de las células tumorales
NOTA: La exposición de las células a los quimioatrayentes presentes en el FBS debe minimizarse antes de los ensayos de migración e invasión celular mediante el uso de una alta concentración de FBS.- Retire el medio viejo y agregue 10 ml de DMEM precalentado que contenga 0.5% de FBS y 1% de antibióticos por placa (medio con bajo contenido sérico).
- Repita el paso 3.2.1.
- Incubar las células a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 durante 4 h o más.
- Recolección de las células tumorales
- Retire el medio viejo, agregue 8 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) precalentada de Dulbecco por placa, retire el DPBS, agregue tripsina-EDTA precalentada al 0,05% (2 ml/placa) para cubrir la superficie e incube en la incubadora deCO2 durante 30 s.
- Aspire la tripsina-EDTA con cuidado, agregue medio sérico bajo (7 ml/placa) y luego recoja las células en un tubo de centrífuga de 50 ml o 15 ml.
- Alícuota un pequeño volumen de células y utilice un contador de células automatizado de mano para contar las células.
- Calcule el número total de células y el volumen necesario para 10.000 células/μL.
- Centrifugar las células centrifugando a 100 × g durante 5 min a temperatura ambiente, aspirar el sobrenadante, añadir el volumen calculado de DMEM que contenga un 0,5% de FBS (sin antibióticos) y resuspender suavemente el gránulo celular.
- Transfiera 110 μL de la suspensión celular, que contiene 1,1 millones de células, a un tubo de microcentrífuga para cada tratamiento.
- Repita el paso 3.3.6 para transferir las células a cuatro tubos de microcentrífuga para cuatro tratamientos diferentes.
NOTA: Una placa CIM tiene un total de 16 pocillos. Diseñe cuatro tratamientos diferentes para la comparación, de modo que se puedan asignar cuatro pocillos de la placa CIM para cada tratamiento. Utilice las células electroporadas para los siguientes experimentos: análisis de Western blot (0,3 millones de células por placa de cultivo de tejidos de 35 mm), cuatro pocillos de ensayos de migración celular en tiempo real (0,1 millones de células/pocillo) y cuatro pocillos de ensayos de invasión celular en tiempo real (0,1 millones de células/pocillo) para cada tratamiento. Ajuste el número de celdas que deben electroporarse si cambia el diseño experimental.
4. Electroporación de las células tumorales
- Para eliminar el medio, agregue 1 ml de DPBS a la suspensión celular en cada tubo, gire la suspensión celular tres veces durante 10 s cada vez mientras gira el tubo 180° cada 10 s con una mini centrífuga y retire el sobrenadante con una micropipeta.
NOTA: Es importante formar un gránulo celular compacto pero fácilmente resuspendible. - Agregue 110 μL de tampón de resuspensión R al gránulo celular para obtener 0,1 millones de células en 10 μL.
- Añadir ARNm sintético al gránulo celular para obtener una concentración de 0,2-20 ng/μL dependiendo del nivel de expresión deseado. Mezcle y vuelva a suspender el gránulo celular suavemente mediante golpecitos o pipeteos suaves.
NOTA: Utilice diferentes concentraciones de ARNm sintético, examine la expresión de la proteína mediante el análisis de Western blot y determine la concentración de ARNm sintético que conduce al nivel de expresión deseado para investigar la correlación específica entre la expresión de la proteína y los efectos biológicos. - Electroporar 10 μL de la suspensión celular con un sistema de electroporación a 1.350 V durante 10 ms con tres pulsos cada vez.
- Transfiera las celdas electroporadas a un nuevo tubo de microcentrífuga con 1,1 mL de DMEM que contenga 0,5% de FBS.
- Repita la electroporación hasta que el resto de la suspensión celular esté electroporada. Combine las celdas electroporadas en el tubo de microcentrífuga para obtener 1,1 millones de celdas en 1,1 mL.
NOTA: Las puntas de electroporación de 100 μL y 10 μL se pueden usar para electroporear un gran volumen de células, pero las puntas de electroporación para 10 μL y 100 μL se incluyen en dos kits separados y deben comprarse por separado. El tampón de resuspensión R está incluido en ambos kits. - Una vez completadas todas las electroporaciones respectivas, vuelva a suspender suavemente las células agrupadas.
- Coloque 0,3 millones de células en una placa de cultivo de tejidos de poliestireno de 35 mm x 10 mm con 2 ml de DMEM que contenga un 5% de FBS, y cultive las células durante 1 día en condiciones de cultivo para la preparación de lisado celular total y análisis de Western blot.
- Mantenga el resto de las celdas electroporadas a temperatura ambiente hasta que el sistema de análisis de celdas en tiempo real esté listo.
5. Configuración del analizador celular en tiempo real, el programa y las placas CIM
NOTA: Prepare el analizador celular en tiempo real y dos placas CIM, como se describió anteriormente11.
- Equilibrio del analizador de células en tiempo real
- Mueva el analizador celular en tiempo real a una incubadora deCO2 varias horas antes de su uso para equilibrar el sistema en condiciones de cultivo.
- Configuración del programa de análisis
- Abra el programa de análisis haciendo doble clic en el icono del software de análisis de celdas en tiempo real en el escritorio.
- Una vez abierta la opción Configuración predeterminada del patrón de experimento , seleccione la opción para ejecutar tres experimentos por separado.
NOTA: Cada cuna tiene una ventana separada. Hay diferentes pestañas para configurar el intervalo y la duración de la medición, el análisis de datos y otras condiciones experimentales. - Abra cada base haciendo clic en la pestaña Número .
- Haga clic en la pestaña Notas del experimento, seleccione la carpeta en la que se guardarán los datos e introduzca el nombre del experimento .
- Haga clic en la pestaña Diseño , configure pocillos cuadruplicados para cada condición de tratamiento seleccionando cuatro pocillos a la vez e ingresando la información de la muestra, y luego haga clic en Aplicar.
- Haga clic en la pestaña Programación | Agregue un paso para configurar el modo de dos pasos de las mediciones de impedancia de la celda. A continuación, haz clic en Aplicar para configurar el primer paso.
- Vuelva a hacer clic en Agregar un paso, ingrese 10 minutos para el intervalo y 48 h para la duración de la migración y la invasión, y haga clic en Aplicar para configurar el segundo paso.
NOTA: El primer paso realiza una medición de referencia única (un barrido con un intervalo de 1 minuto). El segundo paso mide la impedancia celular para el experimento (por ejemplo, 289 barridos con un intervalo de 10 minutos durante 48 h) en la cuna. Ajustar el intervalo y la duración en función del diseño experimental. - Desplácese a la siguiente base y configúrela repitiendo los pasos 5.2.3-5.2.7.
- Preparación de las placas CIM
- Una hora antes de que comience la medición de la impedancia celular, llene los pocillos de la cámara inferior de la placa CIM con 160 μL de DMEM que contenga un 10% de suero u otros quimioatrayentes.
- Ensamble la cámara superior que contiene los pocillos recubiertos de gel ECM (para invasión) o pocillos no recubiertos (para migración) con la cámara inferior.
- Agregue 50 μL de medio sérico bajo a los pocillos de la cámara superior de la placa CIM para el ensayo de migración celular y coloque la placa CIM en la cuna del sistema.
- Haga clic en la pestaña Mensaje y asegúrese de que se muestre el mensaje Conexiones correctas . La placa CIM ya está lista para el experimento.
- Preincube la placa CIM ensamblada en la incubadora de CO2 durante 30-60 minutos antes del análisis celular en tiempo real para aclimatar la placa CIM a la condición de cultivo.
6. Análisis de celdas en tiempo real y exportación de datos
NOTA: Realice una lectura de línea base, siembra de celdas, medición de impedancia de celda y exportación de datos como se describió anteriormente11.
- Lectura de línea de base
NOTA: La línea de base debe leerse después de que la placa CIM esté aclimatada y antes de que las celdas se agreguen a los pocillos de la cámara superior.- Haga clic en el botón Inicio de cada base. Cuando aparezca la ventana Guardar como , guarde el archivo experimental para realizar la lectura de la línea base.
- Siembra celular
- Retire la placa CIM de la base y colóquela en el gabinete de bioseguridad en el soporte de la placa.
- Añadir 100 μL (que contiene 100.000 células) de células electroporadas a los pocillos de la cámara superior de la placa CIM según el programa de la unidad de control. Aplique el método de pipeteo inverso evitando las burbujas de aire.
- Deje la placa CIM debajo de la cabina de bioseguridad durante 30 minutos a temperatura ambiente para asegurarse de que las células se esparzan uniformemente en el fondo del pocillo.
- Medición de impedancia de celda
- Mueva la placa CIM completamente ensamblada de nuevo a la base respectiva. Haga clic en el botón Inicio de la base para comenzar la medición de la impedancia de la celda para el segundo paso.
- Haga clic en la pestaña Trazar y, a continuación, haga clic en el botón Agregar todo y seleccione las casillas Promedio y STD DEV para visualizar los datos en tiempo real.
NOTA: La opción de trazado predeterminada es Tiempo para el eje x e Índice de celda para el eje y. La sección Selección de trazado permite al usuario seleccionar opciones alternativas para el eje Y: Índice de celda normalizado o Índice de celda Delta. Una vez realizado el barrido final, se completa el experimento y los resultados se guardan automáticamente.
- Exportación de los datos para su análisis
- Haga clic en la pestaña Trazar y seleccione las casillas Promedio y STD DEV para copiar los datos de cada pozo individualmente.
- Haga clic con el botón derecho en el área de trazado y seleccione Copiar datos en formato de lista.
- Abra un archivo de hoja de cálculo vacío, pegue los datos y, a continuación, guarde el archivo.
- Vuelva al programa de análisis, haga clic en la pestaña Placa de cada base y seleccione Liberar para cerrar el experimento de la base.
- Vuelva al archivo de hoja de cálculo y ajuste la hora de los datos sin procesar para que la hora de inicio en el segundo paso se convierta en la hora de inicio real de la medición.
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Representative Results
Las proteínas Crk y CrkL desempeñan un papel importante en la motilidad de muchos tipos de células, incluidas las neuronas22, las células T23, los fibroblastos 18,19 y una variedad de células tumorales13. Dado que se ha descrito que las proteínas Crk y CrkL están elevadas en el glioblastoma24,25,26, en este trabajo se estudiaron los efectos de la sobreexpresión de CrkI, una variante de empalme de Crk, sobre la migración celular del glioblastoma. Las células U-118MG se electroporaron con diferentes concentraciones de ARNm sintético de CrkI y se analizaron los niveles de proteínas y la migración celular. La electroporación de células de glioblastoma U-118MG con concentraciones variables de ARNm sintético de CrkI dio lugar a un aumento dependiente de la concentración de la proteína CrkI marcada con FLAG 1 día después de la transfección (Figura 1A). Mientras que 0,2 ng/μL y 2 ng/μL de ARNm condujeron a una expresión indetectable o modesta de la proteína CrkI exógena, 20 ng/μL de ARNm dieron lugar a un nivel de expresión mucho más alto que la proteína CrkI endógena.
Los resultados del ensayo de migración celular utilizando el sistema de análisis celular en tiempo real indicaron que la electroporación con ARNm de CrkI de 0,2 ng/μL o 2 ng/μL no afectó en gran medida a la migración celular. Sin embargo, la electroporación con ARNm de 20 ng/μL de CrkI condujo a una clara estimulación de la migración celular, con más células migrando entre 2 h y 13 h (Figura 1B). La comparación entre el nivel de proteína CrkI y la migración celular reveló que la migración celular del glioblastoma fue estimulada por el aumento en el nivel de proteína CrkI. Parece que el nivel de proteína CrkI debería ser superior a un cierto umbral para provocar una estimulación sustancial de la migración celular. Si la migración celular se hubiera medido de diferentes maneras para contar u observar las células migradas en puntos de tiempo específicos, se habría requerido mucho más esfuerzo para identificar este tipo de cambio en la migración celular.
Para estudiar cómo la sobreexpresión de CrkL influye en la invasión de células de glioblastoma a través de capas de gel de MEC con diferentes concentraciones de proteínas de MEC, las células U-118MG se electroporaron con ARNm sintético de CrkL y se analizaron en términos de los niveles de proteínas y la invasión celular a través de una capa de gel de MEC. La electroporación de células de glioblastoma U-118MG con ARNm sintético de CrkL condujo a una expresión robusta de la proteína CrkL marcada con FLAG 1 día después de la transfección (Figura 2A). A medida que aumentaba la concentración de proteínas de la MEC, la invasión de las células de control se ralentizaba (Figura 2B). Las células que sobreexpresaban CrkL también mostraron una disminución dependiente de la concentración de gel de ECM en la invasión celular (Figura 2C). La comparación entre las células de control y las células que sobreexpresaban CrkL a diferentes concentraciones de gel de ECM indicó que la sobreexpresión de CrkL generalmente estimulaba la invasión celular a través de la capa de gel de ECM (Figura 2D-G). Sin embargo, la diferencia entre las dos poblaciones celulares se hizo evidente en diferentes momentos dependiendo de la concentración de gel de ECM.
Para el gel de ECM de 0,1 μg/μL, la estimulación de la invasión celular mediada por la sobreexpresión de CrkL fue evidente entre las 8 h y las 20 h (Figura 2D), pero la diferencia en la invasión celular fue insignificante después de 32 h. Para el gel de ECM de 0,2 μg/μL, la diferencia en la invasión celular con y sin sobreexpresión de CrkL fue mínima en todo momento (Figura 2E). Para el gel de ECM de 0,5 μg/μL, la diferencia en la invasión celular fue evidente entre las 24 h y las 36 h (Figura 2F). Para el gel de MEC de 1 μg/μL, el efecto de sobreexpresión de CrkL sobre la invasión celular se hizo ligeramente evidente a las 48 h (Figura 2G). Los resultados sugieren que la ventana para detectar la diferencia entre las células de control y las células que sobreexpresan CrkL se desplaza a momentos posteriores a medida que aumenta la concentración del gel de MEC. Los resultados también sugieren que las dos poblaciones celulares se vieron afectadas diferencialmente por el aumento de la concentración de gel de MEC en diferentes momentos. Por ejemplo, a las 12 h, las células que sobreexpresaban CrkL mostraron una invasión sustancialmente mayor solo a 0,1 μg/μL de gel de ECM (Figura 2H). Sin embargo, a las 24 h, las células que sobreexpresan CrkL mostraron una invasión un poco mayor o similar a las concentraciones de gel de ECM probadas (Figura 2I). Por lo tanto, es importante investigar las diferencias dependientes del tiempo y dependientes de la concentración de gel de ECM en la invasión celular para obtener una visión completa de las diferencias entre las dos poblaciones celulares con y sin sobreexpresión de CrkL. Estos resultados demuestran que la combinación de la sobreexpresión transitoria utilizando ARNm sintético con análisis celulares en tiempo real basados en impedancia proporciona una poderosa herramienta para analizar la correlación potencial entre la sobreexpresión génica y la migración e invasión de células tumorales. El examen de los efectos de las variaciones de concentración en el ARNm sintético y el gel de MEC proporcionaría información más precisa y detallada.
Figura 1: Efectos de la sobreexpresión de CrkI en la migración de células de glioblastoma. Las células U-118MG se electroporaron con las concentraciones indicadas (ng/μL) de ARNm de CrkI marcado con FLAG. (A) Para los análisis de Western blot, las células electroporadas se cultivaron durante 1 día antes de la preparación del lisado celular total. Se compararon los niveles de proteína tras la transfección con ARNm sintético de CrkI . Se utilizaron anticuerpos anti-Crk y anti-CrkL para detectar tanto las proteínas endógenas como las marcadas con FLAG y para comparar la relación entre las proteínas endógenas y las proteínas marcadas con FLAG. Se utilizaron vinculina y α-tubulina como controles de carga. (B) Para los análisis de migración celular, las células electroporadas se colocaron en una placa CIM sin cultivo adicional. Los valores del índice celular se obtuvieron de cuatro pocillos para cada muestra, y se muestran sus valores medios ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efectos de la sobreexpresión de CrkL en la invasión de células de glioblastoma. Las células U-118MG se electroporaron con ARNm de CrkL marcado con FLAG libre de nucleasa o H2O libre de nucleasa. (A) Para los análisis de Western blot, las células electroporadas se cultivaron durante 1 día antes de la preparación del lisado celular total. Se compararon los niveles de proteína tras la transfección con ARNm sintético de CrkL. Se utilizaron anticuerpos anti-Crk y anti-CrkL para detectar tanto las proteínas endógenas como las marcadas con FLAG y para comparar la relación entre las proteínas endógenas y las proteínas marcadas con FLAG. Se utilizaron vinculina y α-tubulina como controles de carga. (B-G) Para el análisis de invasión celular, las células electroporadas se colocaron en una placa CIM con un recubrimiento de gel ECM sin cultivo adicional. Los valores del índice celular se obtuvieron de cuatro pocillos para cada muestra, y se muestran sus valores medios ± DE. (B) Se compararon los datos de invasión celular de las células de control con diferentes concentraciones de gel de ECM. (C) Se compararon los datos de invasión celular de las células que sobreexpresan CrkL con varias concentraciones de gel de ECM. (D-G) Se compararon los datos de invasión celular entre las células de control y las células que sobreexpresaban CrkL para la concentración indicada de gel de ECM. (H) Una comparación de la invasión celular a las 12 h entre las células de control y las células que sobreexpresan CrkL. (I) Comparación de la invasión celular a las 24 h entre las células control y las células que sobreexpresan CrkL. Abreviaturas: ECM = matriz extracelular; CIM = invasión y migración celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diagramas esquemáticos de los procedimientos experimentales tras la eliminación o sobreexpresión génica. (A) El procedimiento experimental del análisis celular en tiempo real después de la transfección de siRNA. Dado que se requieren de 3 a 4 días para inducir la eliminación completa del gen después de la transfección de siRNA en las condiciones experimentales, las células se resembraron y cultivaron durante 3 días después de la electroporación antes de que estuvieran listas para los análisis celulares en tiempo real. (B) El procedimiento experimental para el análisis celular en tiempo real después de la transfección sintética de ARNm. Dado que la expresión de proteínas de la transfección sintética de ARNm es rápida, las células electroporadas se utilizaron para análisis celulares en tiempo real el mismo día. Nótese la diferencia entre los dos procedimientos experimentales; mientras que el análisis celular en tiempo real se realizó 3 días después de la electroporación para la eliminación de genes utilizando siRNA, el análisis celular en tiempo real se realizó justo después de la electroporación para la sobreexpresión génica con ARNm sintético. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La migración y la invasión son características importantes de las células tumorales. La medición de la motilidad de las células tumorales y la comprensión del mecanismo subyacente que controla la motilidad de las células tumorales proporcionan información crítica sobre las intervenciones terapéuticas 2,27. Se han desarrollado varios métodos para estudiar la migración celular7. El ensayo de cicatrización de heridas mediante arañazos o insertos de cultivo es un método sencillo y de uso frecuente que proporciona imágenes contrastantes del cierre de huecos. El ensayo de seguimiento celular individual requiere la monitorización de células individuales con imágenes de lapso de tiempo, para lo cual las células se pueden marcar con tintes fluorescentes. Tanto el ensayo de cicatrización de heridas como el ensayo de seguimiento celular individual miden el movimiento espontáneo de las células.
Con la ayuda de imágenes de lapso de tiempo y el procesamiento intensivo de datos posteriores a la solicitud, ambos ensayos pueden proporcionar comparaciones cuantitativas entre muestras28. Sin embargo, estos ensayos no son adecuados para estudiar la invasión celular a través de una capa de proteína ECM. Por el contrario, los ensayos de migración e invasión de transpocillos miden la migración celular dirigida a través de una membrana de inserto de transpocillos con o sin una capa de proteína ECM. Sin embargo, la monitorización continua no es factible con estos ensayos porque las células migradas deben recogerse en un momento dado y el transpocillo no puede volver a utilizarse. Todos estos ensayos requieren mucho tiempo y esfuerzo para el procesamiento de datos o para experimentos prácticos para recolectar y contar las células, lo que resulta en posibles variaciones relacionadas con el operador. El mayor desafío para estos ensayos es realizar comparaciones cuantitativas sofisticadas entre múltiples tratamientos combinados en varios puntos de tiempo.
El uso del sistema de análisis celular en tiempo real presentado en este trabajo permite un monitoreo cuantitativo, continuo y completo para medir la migración e invasión celular, y este sistema tiene muchas ventajas sobre otros ensayos simples de motilidad celular, que proporcionan resultados en puntos de tiempo limitados y fijos. Al igual que con otros ensayos, las condiciones experimentales de los análisis celulares en tiempo real deben optimizarse para cada línea celular, ya que la migración e invasión de diferentes líneas celulares pueden verse afectadas de manera diferencial por el número de células. Además, la tasa de invasión celular disminuye a medida que aumenta la concentración del gel de MEC (Figura 2B, C). Por lo tanto, se recomienda probar diferentes concentraciones de gel de ECM y comparar los efectos de los cambios en la expresión génica en la invasión celular bajo estas diferentes concentraciones de gel de ECM.
Con el sistema de análisis celular en tiempo real, la optimización es fácil y directa, ya que el sistema de ensayo produce datos en tiempo real sin tiempo de manipulación. El sistema de ensayo identifica qué tan pronto migran o invaden las células y cuándo alcanzan el nivel máximo de migración o invasión celular. La obtención de esta información sobre la motilidad celular permite realizar análisis comparativos detallados entre varios grupos de tratamiento, que se pueden realizar simplemente utilizando las funciones integradas del programa. Además, la sensibilidad del sistema de ensayo en tiempo real permite identificar y cuantificar cambios sutiles en la migración celular y la invasión por expresión génica dependiente de la concentración, como se demuestra en la Figura 1 y la Figura 2.
Anteriormente, se proporcionó un procedimiento detallado para medir la migración e invasión de células tumorales después de la eliminación de genes utilizando el sistema de análisis celular en tiempo real basado en impedancia. Dado que la eliminación de genes tarda de 3 a 4 días después de que las células se electroporan con siRNA, las células se reincrustaron después de la electroporación. Las células electroporadas se cultivaron durante 3 días antes de volver a cosecharlas para los análisis celulares en tiempo real, lo que hizo que todo el experimento fuera un proceso de dos pasos: electroporación el día 1 y análisis celular en tiempo real el día 4, como se muestra en la Figura 3. Por el contrario, la expresión génica tras la electroporación de células con ARNm sintético es rápida y eficiente, ya que el análisis de lapso de tiempo de fibroblastos electroporados con ARNm sintético para GFP mostró una fuerte señal de GFP 5 h después de la transfección; La intensidad de fluorescencia alcanzó un máximo alrededor de las 24 h, después de lo cual hubo una disminución gradual de la señal de fluorescencia18.
Además, en este trabajo, las células U-118MG mostraron una expresión robusta de la proteína exógena cuando se electroporaron con ARNm sintético para CrkI (Figura 1A) y para CrkL (Figura 2A), lo que concuerda con observaciones previas8. Por lo tanto, es conveniente llevar a cabo los análisis celulares en tiempo real inmediatamente después de la electroporación. Algunos de los pasos para el análisis de células en tiempo real deben realizarse antes de cosechar las células para la electroporación. Todo el experimento es un proceso de un solo paso que implica electroporación y análisis celular en tiempo real el día 1. El sistema de análisis celular en tiempo real basado en impedancia se ha utilizado ampliamente para estudiar la migración e invasión de células tumorales en varias células tumorales sólidas, incluido el cáncer de mama29, el cáncer colorrectal 30, el melanoma31, el cáncer de ovario 32, el cáncer escamoso de cabeza y cuello 33, el carcinoma de células renales34, el carcinoma de páncreas 35, el carcinoma hepatocelular 36 y las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas 10. Por lo tanto, el uso combinado de la sobreexpresión génica mediante ARNm o la eliminación génica mediante ARNip hace que la medición en tiempo real de la migración e invasión celular sea más útil y aplicable.
La limitación de este protocolo es que requiere disociar y recolectar células justo antes de la medición de la migración e invasión celular. Los tratamientos enzimáticos y mecánicos durante la disociación, la cosecha y la resuspensión pueden afectar el análisis37. Además, puede haber un retraso en la migración celular mientras las células se recuperan de los tratamientos enzimáticos y mecánicos. Este método puede no ser apropiado si las células se dañan fácilmente por tripsinización u otros tratamientos mecánicos durante la disociación y recolección de una sola célula o si requieren un tiempo de recuperación prolongado después de esas manipulaciones. Esta limitación también se aplica al ensayo de migración transpocillo, que es otro método para medir la migración celular dirigida. Además, la electroporación después de la preparación de la célula puede hacer que las células sean más vulnerables al daño38. Por lo tanto, es importante optimizar las condiciones de electroporación para cada línea celular y también electroporear las celdas de control para obtener comparaciones más precisas.
La página de inicio del fabricante para el sistema de electroporación proporciona los parámetros recomendados para la electroporación (consulte la nota al pie en la Tabla de materiales). El uso de condiciones experimentales consistentes y mínimamente dañinas durante la disociación y resuspensión celular es fundamental para obtener resultados reproducibles. Además, correlacionar la cantidad de ARNm, el nivel de proteína y la motilidad celular es crucial para distinguir entre los efectos específicos e inespecíficos de la transfección de ARNm. En este trabajo, se observó que si la concentración de ARNm superaba un cierto nivel, inhibía de forma inespecífica las funciones celulares, incluida la migración celular y la invasión (datos no mostrados). Por lo tanto, es importante valorar la concentración de ARNm. Además, es fundamental realizar el análisis celular en tiempo real cuando la expresión de la proteína está en su nivel máximo, ya que la expresión de la proteína es transitoria con la transfección del ARNm. Al igual que con otros ensayos de motilidad celular, los resultados de este análisis celular en tiempo real pueden confundirse por la proliferación de células durante la migración. Por lo tanto, se recomienda realizar adicionalmente un ensayo de proliferación celular para comprender la influencia de la proliferación celular en los resultados de migración e invasión celular.
Se sabe que los niveles de proteínas de Crk y CrkL están elevados en algunos tipos de cánceres humanos. Dado que la expresión de Crk y CrkL se correlaciona con diversas funciones de las células tumorales y su sobreexpresión contribuye a un mal pronóstico, se han propuesto Crk y CrkL como dianas terapéuticas para el tratamiento del cáncer13. Anteriormente, se indujo la eliminación génica en células de glioblastoma para demostrar que la migración e invasión de células de glioblastoma son marcadores robustos de la actividad de Crk y CrkL. El presente estudio proporciona un enfoque sistemático de expresión génica para inducir la sobreexpresión de Crk y CrkL utilizando ARNm sintético. Se obtuvo una estrecha correlación entre los niveles proteicos de Crk y CrkL y la migración e invasión celular del glioblastoma utilizando el sistema de análisis celular en tiempo real. Los resultados apoyan aún más la hipótesis de que Crk y CrkL desempeñan un papel esencial en la migración e invasión de las células del glioblastoma. Junto con el artículo de métodos anterior11, este estudio proporciona un enfoque de prueba de concepto para investigar una posible correlación entre los cambios en la expresión génica y la migración e invasión de células tumorales.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al Centro de Redacción Médica de Children's Mercy Kansas City por editar este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación A.R.T. de Natalie (a T.P.) y por una subvención de la Junta Asesora de Socios de MCA del Children's Mercy Hospital (CMH) y el Centro Oncológico de la Universidad de Kansas (KUCC) (a T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
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