Summary
Mange oppregulerte gener stimulerer tumorcellemigrasjon og invasjon, noe som fører til dårlig prognose. Å bestemme hvilke gener som regulerer tumorcellemigrasjon og invasjon er kritisk. Denne protokollen presenterer en metode for å undersøke effekten av økt ekspresjon av et gen på migrasjon og invasjon av tumorceller i sanntid.
Abstract
Tumorceller er svært bevegelige og invasive og viser endrede genuttrykksmønstre. Kunnskap om hvordan endringer i genuttrykk regulerer tumorcellemigrasjon og invasjon er avgjørende for å forstå mekanismene for tumorcelleinfiltrasjon i nærliggende friskt vev og metastase. Tidligere ble det demonstrert at genknockdown etterfulgt av impedansbasert sanntidsmåling av tumorcellemigrasjon og invasjon muliggjør identifisering av gener som kreves for tumorcellemigrasjon og invasjon. Den siste tiden har mRNA-vaksinene mot SARS-CoV-2 økt interessen for å bruke syntetisk mRNA til terapeutiske formål. Her ble metoden ved hjelp av syntetisk mRNA revidert for å studere effekten av genoverekspresjon på tumorcellemigrasjon og invasjon. Denne studien viser at forhøyet genuttrykk med syntetisk mRNA-transfeksjon etterfulgt av impedansbasert sanntidsmåling kan bidra til å identifisere gener som stimulerer tumorcellemigrasjon og invasjon. Denne metodeartikkelen gir viktige detaljer om prosedyrene for å undersøke effekten av endret genuttrykk på tumorcellemigrasjon og invasjon.
Introduction
Tumorcellemotilitet spiller en avgjørende rolle i metastase 1,2. Spredning av tumorceller til nærliggende og fjerntliggende friske vev gjør kreftbehandling vanskelig og bidrar til tilbakefall 3,4. Derfor er det viktig å forstå mekanismene for tumorcellemotilitet og utvikle relevante terapeutiske strategier. Siden mange tumorceller har endrede genuttrykksprofiler, er det avgjørende å forstå hvilke endringer i genuttrykksprofilen som fører til endret tumorcellemotilitet 5,6.
Flere analyser er utviklet for å måle cellemigrasjon in vitro. Noen analyser gir bare begrenset informasjon på grunn av bare å tillate målinger på bestemte tidspunkter, mens andre tilbyr omfattende informasjon om tumorcellemotilitet i sanntid7. Selv om mange av disse cellemotilitetsanalysene kan gi kvantitative resultater på et gitt tidspunkt eller endepunktet, klarer de ikke å gi tilstrekkelig detaljert informasjon om dynamiske endringer i hastigheten på cellemigrasjon over den eksperimentelle perioden. I tillegg kan det være vanskelig å undersøke potensielle endringer i cellemigrasjonshastigheten avhengig av eksperimentell design, celletyper og celletall. Videre kan effekten av ukompliserte behandlinger undersøkes ved enkel kvantifisering av tradisjonelle motilitetsanalyser, men mer sofistikert kvantifisering kan være nødvendig for å studere de komplekse effektene av ulike kombinerte behandlinger8.
Et instrument for å overvåke den elektriske strømmen til en mikrotiterplate som er godt dekket med mikroelektroder er utviklet9. Adhesjonen av celler til overflaten av brønnen hindrer elektronstrømmen, og impedansen korrelerer med den kvantitative og kvalitative bindingen av cellene. Tilstedeværelsen av mikroelektrodene på brønnbunnen muliggjør måling av celleadhesjon, spredning og spredning. Tilstedeværelsen av mikroelektrodene under en mikroporøs membran i det øvre kammeret muliggjør måling av cellemigrasjon og invasjon i det nedre kammeret, med det øvre kammeret belagt med ekstracellulære matriksproteiner (ECM) for å tillate invasjon10.
Tidligere ble det demonstrert at impedansbaserte sanntidsmålinger av tumorcellemigrasjon og invasjon gir sanntidsdata under hele eksperimentet, samt umiddelbare sammenligninger og kvantifiseringer under ulike eksperimentelle forhold11. I den metodeoppgaven ble genknockdown indusert for å teste rollen til proteiner av interesse for tumorcellemigrasjon og invasjon. Siden en fullblåst gen-knockdown-effekt under de testede eksperimentelle forholdene tok 3-4 dager etter elektroporering med små forstyrrende RNA (siRNAer)8, ble cellene replisert etter elektroporeringen og høstet på nytt 3 dager senere for impedansbasert sanntidsmåling av tumorcellemigrasjon og invasjon.
CT10-regulator av kinase (Crk) og Crk-lignende (CrkL) er adaptorproteiner som medierer protein-protein-interaksjoner nedstrøms for ulike vekstfaktorreseptorkinaseveier og ikke-reseptortyrosinkinaseveier12. Forhøyede nivåer av Crk- og CrkL-proteiner bidrar til dårlig prognose i flere humane kreftformer, inkludert glioblastom13. Det er imidlertid uklart hvordan forhøyede Crk- og CrkL-proteiner fører til dårlig prognose. Derfor er det viktig å definere effekten av Crk og CrkL overekspresjon på tumorcellefunksjoner. Tidligere ble det utført en gen-knockdown-studie for å demonstrere at endogene nivåer av Crk- og CrkL-proteiner er nødvendige for glioblastomcellemigrasjon og invasjon8. Her er det utviklet et modifisert analysesystem for å adressere effekten av Crk og CrkL-overekspresjon på tumorcellemigrasjon og invasjon.
Nylig har in vitro-syntesen av mRNA og dens terapeutiske anvendelser fått fornyet oppmerksomhet på grunn av utviklingen av mRNA-vaksinene mot SARS-CoV-2 (gjennomgått av Verbeke et al.14). I tillegg er det gjort bemerkelsesverdige fremskritt ved bruk av syntetisk mRNA i kreft og andre sykdommer15,16. Elektroporering av celler er en effektiv metode for å levere syntetisk mRNA og indusere forbigående genetisk modifikasjon (gjennomgått av Campillo-Davo et al.17), og bruk av syntetisk mRNA muliggjør rask og effektiv genekspresjon i udødeliggjorte fibroblaster 18. Denne metodeartikkelen kombinerer genoverekspresjon ved hjelp av syntetisk mRNA med sanntids celleanalyser for å studere tumorcellemigrasjon og invasjon. Imidlertid virker det eksperimentelle skjemaet som brukes til siRNA ikke med syntetisk mRNA-transfeksjon, da nivået av eksogene proteiner øker raskt og reduseres gradvis ved syntetisk mRNA-transfeksjon18. Derfor har metoden blitt modifisert for å utføre sanntidsanalyse av cellemigrasjon og invasjon rett etter transfeksjonen uten å dyrke cellene i tillegg.
Denne metodeartikkelen demonstrerer at kombinasjon av impedansbaserte sanntidsmålinger med transfeksjon av tumorceller med syntetiske mRNA gir en rask og omfattende analyse av effekten av genoppregulering på tumorcellemigrasjon og invasjon. Denne metodeartikkelen beskriver detaljerte prosedyrer for å måle hvordan migrasjon og invasjon av glioblastomceller påvirkes av overekspresjon av Crk og CrkL. Ved å undersøke de konsentrasjonsavhengige effektene av syntetisk mRNA på tumorcellemigrasjon, beskriver papiret tydelig hvordan en økning i proteinnivåer stimulerer tumorcellemigrasjon. I tillegg presenteres en tilnærming med varierende konsentrasjon av ECM-gelen for å vurdere effekten av endringer i genuttrykk på tumorcelleinvasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese av mRNA
MERK: For mRNA-syntesen må alle reagensene og utstyret behandles spesielt for å inaktivere RNasene før bruk. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, instrumenter og reagenser som brukes i denne protokollen.
- Linearisering av DNA
MERK: Mus-cDNA fra CrkI og CrkL ble klonet inn i pFLAG-CMV-5a-ekspresjonsvektoren for å legge til FLAG-epitopkoden ved C-terminalen og subklonet inn i pcDNA3.1/myc-He-vektoren for å innlemme T7-promotoren, som tidligere beskrevet18,19.- Legg til 10 μL 10x reaksjonsbuffer, 1,5 μL PmeI (10 000 enheter / ml) og 10 μg av et plasmid-DNA til et mikrosentrifugerør for å linearisere plasmid-DNA med restriksjonsenzymet. Tilsett nukleasefritt vann for å bringe reaksjonsvolumet til 100 μL.
- Bland ved å banke, spinne ned og inkubere reaksjonsblandingen ved 37 °C over natten.
- Spinn ned og tilsett 5 μL 10% natriumdodecylsulfat (SDS) og 1 μL proteinase K (20 mg / ml, RNA-grad) til reaksjonsblandingen. Bland ved å banke, spinne ned og ruge ved 50 °C i 30 minutter.
- Under avtrekkshetten, tilsett 100 μL av bunnfasen av fenol:kloroform:isoamylalkohol til plasmidreaksjonsblandingen for ekstraksjon. Vortex, og deretter sentrifuge ved 18 800 × g i 5 min ved romtemperatur. Flytt den øvre fasen til et nytt rør.
- Gjenta trinn 1.1.4 med kloroform: isoamylalkohol ved 24: 1.
- I det nye røret, bring reaksjonsvolumet til 300 μL ved å tilsette 200 μL nukleasefritt vann, og tilsett deretter 30 μL 3 M natriumacetat og 600 μL 100% etanol.
- Bland med vortexing, og legg deretter ved -20 ° C i 30-60 min for etanolutfelling av DNA.
- Sentrifuge ved 18 800 × g i 20 minutter ved 4 °C, kast supernatanten og skyll pelleten med 1 ml 70 % etanol. Gjenta sentrifugeringen i 10 minutter, og fjern deretter supernatanten helt.
- Tørk med hetten åpen i 2 minutter, tilsett 30 μL nukleasefritt vann og resuspender DNA-pelleten.
- Bestem DNA-konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer.
- Bekreft størrelsen og mengden av det lineariserte DNA ved hjelp av agarosegelelektroforese.
- RNA-syntese ved bruk av T7 RNA-polymerase
- Legg til 2 μL hver av 10x transkripsjonsbuffer, ATP, GTP, UTP, CTP og T7 og 1 μg av et linearisert DNA til et mikrosentrifugerør. Tilsett nukleasefritt vann for å bringe reaksjonsvolumet til 20 μL.
- Bland ved å banke, spinne ned og inkubere reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 2 timer for RNA-syntese.
- Spinn ned, tilsett 1 μL DNase (2 U/μL), og inkuber ved 37 °C i 15 minutter for å fjerne malens DNA.
- Litiumkloridutfelling av RNA
- Tilsett 10 μL litiumklorid (7,5 M) til reaksjonsblandingen. Bland ved å banke, spinne ned og inkubere reaksjonsblandingen ved -20 °C i 30 minutter.
- Sentrifuge ved 18 800 × g i 20 minutter ved 4 °C, kast supernatanten og skyll pelleten med 500 μL 70 % etanol. Gjenta sentrifugeringen i 10 minutter, og fjern deretter supernatanten helt.
- Tørk med hetten åpen i 2 minutter, tilsett 30 μL nukleasefritt vann og resuspender RNA-pelleten.
- Capping
- Varm opp RNA-prøven ved 65 °C i 10 minutter, og legg den deretter på is for avkjøling.
- Tilsett 5 μL hver av 10x capping buffer, 10 mM GTP og 1 mM (10x) S-adenosylmethionine (SAM), 2 μL hver av en capping enzymblanding og O-metyltransferase enzymblanding, og 1,25 μL RNase-hemmer. Bland ved å banke, spinne ned og inkuber reaksjonsblandingen ved 37 °C i 1 time.
- Poly(A) avgangsmasser
- Spinn ned prøven, og tilsett deretter 6 μL nukleasefritt vann, 20 μL 5x E-PAP-buffer, 10 μL 25 mMMnCl2, 10 μL 10 mM ATP og 4 μL E-PAP poly (A) tailing enzym. Bland ved å banke, sentrifugere og inkubere reaksjonsblandingen ved 37 °C i 2 timer.
- Utfelling av litiumklorid og kvantifisering av syntetisk mRNA
- Tilsett 50 μl litiumklorid (7,5 M), og utfør litiumkloridutfelling som beskrevet i trinn 1.3.1-1.3.3.
- Mål konsentrasjonen av mRNA ved hjelp av et spektrofotometer.
- Bekreft størrelsen og mengden mRNA ved hjelp av formaldehyd (1% -2%) agarose (1%) gelelektroforese.
2. Ekstracellulær matriks (ECM) gelbelegg av celleinvasjon og migrasjon (CIM) plater
MERK: En celleinvasjon og migrasjon (CIM) plate er en kommersielt produsert 16-brønns plate for impedansbasert sanntids celleanalyse. For celleinvasjonsanalysen, belegg CIM-plater med ECM-gel, som tidligere beskrevet, men med noen modifikasjoner11.
- Fjern en alikot av ECM-gelkraft fra fryseren og oppbevar den på is.
- Fortynn ECM-gelen (10 mg/ml) til en arbeidskonsentrasjon (100 μg/ml) ved å blande 990 μl Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) (uten serum eller antibiotika) med 10 μl ECM-gel i et mikrosentrifugerør. Bland med forsiktig pipettering.
- Tilsett 60 μL fortynnet ECM-gel til hver av de 16 brønnene i CIM platens øvre kammer. Bruk omvendt pipetteringsmetode samtidig som du unngår luftbobler20,21.
MERK: Optimaliser konsentrasjonen av ECM-gelen for hver cellelinje. For glioblastomcellelinjer ble 0,1 μg / μL til 1 μg / μL ECM gel brukt til optimalisering. - Plasser det øvre kammeret på CIM-platen med platedekselet av på et beskyttende plastark inne i en CO2 -inkubator i ca. 4 timer for å danne et gellag.
FORSIKTIG: Under belegget av CIM-platen med ECM-gel, bør elektrodene i CIM platens øvre kammer ikke ha direkte kontakt med eksperimentørens hender eller overflatene på utstyret, inkludert biosikkerhetsskapet eller CO2 -inkubatoren.
3. Fremstilling av tumorcellene
MERK: Alle cellekulturmaterialer må holdes sterile. Høst og elektroporer tumorcellene under et biologisk sikkerhetsskap med passende personlig verneutstyr (PPE), som tidligere beskrevet, men med noen modifikasjoner11.
- Kultur av tumorcellene
- Kultur U-118MG celler i 10 ml DMEM inneholdende 5% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotika per 100 mm x 20 mm polystyren vevskulturskål ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (kultur tilstand).
- Serumuttømming av tumorcellene
MERK: Eksponeringen av cellene til kjemoattraktantene som er tilstede i FBS, må minimeres før cellemigrasjons- og invasjonsanalysene ved å bruke en høy konsentrasjon av FBS.- Fjern det gamle mediet, og tilsett 10 ml forvarmet DMEM som inneholder 0,5% FBS og 1% antibiotika per tallerken (lavserummedium).
- Gjenta trinn 3.2.1.
- Inkuber cellene ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator i 4 timer eller lenger.
- Høsting av tumorcellene
- Fjern det gamle mediet, tilsett 8 ml forvarmet Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) per tallerken, fjern DPBS, tilsett forvarmet 0,05% trypsin-EDTA (2 ml / tallerken) for å dekke overflaten, og inkuber i CO2 -inkubatoren i 30 s.
- Aspirer trypsin-EDTA nøye, tilsett lavserummedium (7 ml / tallerken), og samle deretter celler i et 50 ml eller 15 ml sentrifugerør.
- Aliquot et lite volum av celler, og bruk en håndholdt automatisert celleteller for å telle cellene.
- Beregn totalt antall celler og ønsket volum for 10.000 celler / μL.
- Spinn ned cellene ved å sentrifugere dem ved 100 × g i 5 minutter ved romtemperatur, aspirer supernatanten, tilsett det beregnede volumet av DMEM som inneholder 0,5% FBS (uten antibiotika), og resuspender cellepelleten forsiktig.
- Overfør 110 μl av cellesuspensjonen, som inneholder 1,1 millioner celler, til et mikrosentrifugerør for hver behandling.
- Gjenta trinn 3.3.6 for å overføre cellene til fire mikrosentrifugerør for fire forskjellige behandlinger.
MERK: En CIM-plate har totalt 16 brønner. Design fire forskjellige behandlinger for sammenligning slik at fire brønner på CIM-platen kan tildeles for hver behandling. Bruk de elektroporerte cellene til følgende eksperimenter: Western blot-analyser (0,3 millioner celler per 35 mm vevskulturskål), fire brønner med sanntids cellemigrasjonsanalyser (0,1 millioner celler/brønn) og fire brønner med sanntids celleinvasjonsanalyser (0,1 millioner celler/brønn) for hver behandling. Juster antall celler som må elektroporeres hvis eksperimentell design endres.
4. Elektroporering av tumorcellene
- For å fjerne mediet, tilsett 1 ml DPBS til cellesuspensjonen i hvert rør, spinn ned cellesuspensjonen tre ganger i 10 s hver gang mens du roterer røret 180 ° hver 10. s ved hjelp av en minisentrifuge, og fjern supernatanten ved hjelp av en mikropipette.
MERK: Det er viktig å danne en kompakt, men lett resuspenderbar cellepellet. - Tilsett 110 μL resuspensjonsbuffer R til cellepelleten for å oppnå 0,1 millioner celler i 10 μL.
- Tilsett syntetisk mRNA til cellepelleten for å oppnå en konsentrasjon på 0,2-20 ng / μL avhengig av ønsket uttrykksnivå. Bland og resuspender cellepelleten forsiktig ved å banke eller forsiktig pipettere.
MERK: Bruk forskjellige konsentrasjoner av syntetisk mRNA, undersøk proteinuttrykket ved hjelp av western blot-analyse, og bestem konsentrasjonen av syntetisk mRNA som fører til ønsket ekspresjonsnivå for å undersøke den spesifikke korrelasjonen mellom proteinuttrykket og biologiske effekter. - Elektroporer 10 μL av cellesuspensjonen med et elektroporeringssystem ved 1,350 V i 10 ms med tre pulser hver gang.
- Overfør de elektroporerte cellene til et nytt mikrosentrifugerør med 1,1 ml DMEM inneholdende 0,5% FBS.
- Gjenta elektroporeringen til resten av cellesuspensjonen er elektroporert. Kombiner de elektroporerte cellene i mikrosentrifugerøret for å oppnå 1,1 millioner celler i 1,1 ml.
MERK: Både 100 μL og 10 μL elektroporasjonsspisser kan brukes til å elektroporere et stort volum celler, men elektroporasjonsspissene for 10 μL og 100 μL er inkludert i to separate sett og må kjøpes separat. Opphengsbuffer R er inkludert i begge settene. - Når du har fullført alle de respektive elektroporasjonene, resuspenderes de samlede cellene forsiktig.
- Plate 0,3 millioner celler i en 35 mm x 10 mm polystyren vevskulturskål med 2 ml DMEM inneholdende 5% FBS, og dyrk cellene i 1 dag under kulturbetingelsen for total cellelysatpreparasjon og western blot-analyser.
- Hold resten av de elektroporerte cellene i romtemperatur til sanntids celleanalysesystemet er klart.
5. Sette opp sanntids celleanalysator, programmet og CIM-platene
MERK: Klargjør sanntids celleanalysator og to CIM-plater, som tidligere beskrevet11.
- Likevekt av sanntids celleanalysator
- Flytt sanntids celleanalysator inn i en CO2 -inkubator flere timer før bruk for å balansere systemet under kulturtilstanden.
- Sette opp analyseprogrammet
- Åpne analyseprogrammet ved å dobbeltklikke på sanntids celleanalyseprogramvareikonet på skrivebordet.
- Når alternativet Standard oppsett av eksperimentmønster er åpent, velger du alternativet for å kjøre tre eksperimenter separat.
MERK: Hver holder har et eget vindu. Det finnes forskjellige kategorier for å sette opp måleintervall og varighet, dataanalyse og andre eksperimentelle forhold. - Åpne hver holder ved å klikke kategorien Nummer .
- Klikk kategorien Eksperimentnotater , velg mappen der dataene skal lagres, og skriv inn navnet på eksperimentet.
- Klikk på Layout-fanen , sett opp firedoble brønner for hver behandlingstilstand ved å velge fire brønner om gangen og legge inn eksempelinformasjonen, og klikk deretter på Bruk.
- Klikk på kategorien Tidsplan | Legg til et trinn for å konfigurere totrinnsmodus for celleimpedansmålingene. Klikk deretter på Bruk for å sette opp det første trinnet.
- Klikk på Legg til et trinn igjen, skriv inn 10 min for intervallet og 48 t for varigheten for migrasjon og invasjon, og klikk på Bruk for å sette opp det andre trinnet.
MERK: Det første trinnet tar en engangsmåling av grunnlinjen (ett sveip med et intervall på 1 minutter). Det andre trinnet måler celleimpedansen for eksperimentet (for eksempel 289 feier med 10 minutters intervall i 48 timer) ved holderen. Juster intervallet og varigheten avhengig av eksperimentell design. - Gå til neste stativ, og konfigurer den ved å gjenta trinn 5.2.3–5.2.7.
- Klargjøring av CIM-platene
- En time før celleimpedansmålingen starter, fyll brønnene i det nedre kammeret på CIM-platen med 160 μL DMEM inneholdende 10% serum eller andre kjemoattraktanter.
- Monter det øvre kammeret som inneholder ECM-gelbelagte brønner (for invasjon) eller ubelagte brønner (for migrasjon) med det nedre kammeret.
- Tilsett 50 μL lavserummedium til brønnene i det øvre kammeret på CIM-platen for cellemigrasjonsanalysen, og plasser CIM-platen i systemets vugge.
- Klikk på kategorien Melding , og kontroller at meldingen Tilkoblinger ok vises. CIM-platen er nå klar for eksperimentet.
- Preinkuber den monterte CIM-platen i CO2 -inkubatoren i 30-60 minutter før sanntids celleanalyse for å akklimatisere CIM-platen til kulturtilstanden.
6. Sanntids celleanalyse og dataeksport
MERK: Utfør en grunnlinjeavlesning, cellesåing, måling av celleimpedans og dataeksport som tidligere beskrevet11.
- Grunnlinjeavlesning
MERK: Grunnlinjen bør leses etter at CIM-platen er akklimatisert og før cellene legges til brønnene i det øvre kammeret.- Klikk på Start-knappen for hver holder. Når vinduet Lagre som vises, lagrer du eksperimentfilen for å utføre grunnlinjeavlesningen.
- Celle såing
- Fjern CIM-platen fra holderen, og plasser den i biosikkerhetsskapet på plateholderen.
- Tilsett 100 μL (inneholdende 100 000 celler) elektroporerte celler til brønnene i CIM platens øvre kammer i henhold til programmet i kontrollenheten. Bruk omvendt pipetteringsmetode samtidig som du unngår luftbobler.
- La CIM-platen ligge under biosikkerhetsskapet i 30 minutter ved romtemperatur for å sikre at cellene sprer seg jevnt på brønnbunnen.
- Måling av celleimpedans
- Flytt den ferdigmonterte CIM-platen tilbake til den respektive holderen. Klikk på holderens Start-knapp for å starte celleimpedansmålingen for det andre trinnet.
- Klikk på Plot-fanen , klikk deretter på Legg til alt-knappen , og velg boksene Average og STD DEV for å visualisere dataene i sanntid.
Standard tegnealternativ er Tid for x-aksen og Celleindeks for y-aksen. Delen Plottvalg lar brukeren velge alternative alternativer for y-aksen: Normalisert celleindeks eller Deltacelleindeks. Når den endelige oppryddingen er gjort, fullføres eksperimentet, og resultatene lagres automatisk.
- Eksport av dataene for analyse
- Klikk på Plot-fanen og velg boksene Average og STD DEV for å kopiere dataene for hver brønn individuelt.
- Høyreklikk på tegneområdet, og velg Kopier data i listeformat.
- Åpne en tom regnearkfil, lim inn dataene, og lagre deretter filen.
- Gå tilbake til analyseprogrammet, klikk på Plate-fanen for hver holder, og velg Frigi for å lukke eksperimentet for holderen.
- Gå tilbake til regnearkfilen, og juster klokkeslettet for rådataene slik at starttidspunktet i det andre trinnet blir det faktiske starttidspunktet for målingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Crk og CrkL proteiner spiller viktige roller i motiliteten til mange celletyper, inkludert nevroner22, T-celler23, fibroblaster 18,19 og en rekke tumorceller13. Siden Crk- og CrkL-proteiner har blitt rapportert å være forhøyet i glioblastom24,25,26, ble effekten av overekspresjon av CrkI, en spleisevariant av Crk, på glioblastomcellemigrasjon studert i dette arbeidet. U-118MG celler ble elektroporert med forskjellige konsentrasjoner av syntetisk CrkI mRNA og analysert for proteinnivåer og cellemigrasjon. Elektroporering av U-118MG glioblastomceller med varierende konsentrasjoner av syntetisk CrkI mRNA resulterte i en konsentrasjonsavhengig økning i FLAG-merket CrkI-protein 1 dag etter transfeksjon (figur 1A). Mens 0,2 ng/μL og 2 ng/μL mRNA førte til et udetekterbart eller beskjedent uttrykk av det eksogene CrkI-proteinet, resulterte 20 ng/μL mRNA i et mye høyere ekspresjonsnivå enn det endogene CrkI-proteinet.
Resultatene fra cellemigrasjonsanalysen ved bruk av sanntids celleanalysesystem indikerte at elektroporeringen med 0,2 ng / μL eller 2 ng / μL CrkI mRNA ikke påvirket cellemigrasjonen i stor grad. Elektroporering med 20 ng/μL CrkI mRNA førte imidlertid til en klar stimulering av cellemigrasjon, med flere celler som migrerte mellom 2 timer og 13 timer (figur 1B). Sammenligningen mellom CrkI-proteinnivået og cellemigrasjonen viste at glioblastomcellemigrasjon ble stimulert av økningen i CrkI-proteinnivået. Det ser ut til at CrkI-proteinnivået bør være høyere enn en viss terskel for å forårsake en betydelig stimulering av cellemigrasjon. Hvis cellemigrasjonen hadde blitt målt på forskjellige måter for å telle eller observere de migrerte cellene på bestemte tidspunkter, kunne det ha vært nødvendig med mye mer innsats for å identifisere denne typen endring i cellemigrasjon.
For å studere hvordan CrkL-overekspresjon påvirker glioblastomcelleinvasjon gjennom ECM-gellag med forskjellige konsentrasjoner av ECM-proteiner, ble U-118MG-celler elektroporert med syntetisk CrkL mRNA og analysert med hensyn til proteinnivåene og celleinvasjonen gjennom et ECM-gellag. Elektroporeringen av U-118MG glioblastomceller med syntetisk CrkL mRNA førte til et robust uttrykk av FLAG-merket CrkL-protein 1 dag etter transfeksjon (figur 2A). Etter hvert som konsentrasjonen av ECM-proteiner økte, avtok invasjonen av kontrollcellene (figur 2B). CrkL-overuttrykkende celler viste også en ECM-gelkonsentrasjonsavhengig reduksjon i celleinvasjon (figur 2C). Sammenligningen mellom kontroll- og CrkL-overuttrykkende celler ved forskjellige ECM-gelkonsentrasjoner indikerte at CrkL-overekspresjon generelt stimulerte celleinvasjon gjennom ECM-gellaget (figur 2D-G). Forskjellen mellom de to cellepopulasjonene ble imidlertid åpenbar på forskjellige tidspunkter, avhengig av ECM-gelkonsentrasjonen.
For 0,1 μg/μL ECM-gel var CrkL-overekspresjonsmediert stimulering av celleinvasjon tydelig mellom 8 timer og 20 timer (figur 2D), men forskjellen i celleinvasjon var ubetydelig etter 32 timer. For 0,2 μg/μL ECM-gel var forskjellen i celleinvasjon med og uten CrkL-overekspresjon minimal til enhver tid (figur 2E). For 0,5 μg/μL ECM-gel var forskjellen i celleinvasjon tydelig mellom 24 timer og 36 timer (figur 2F). For 1 μg/μL ECM-gel ble CrkL-overekspresjonseffekten på celleinvasjon litt tydelig ved 48 timer (figur 2G). Resultatene tyder på at vinduet for å oppdage forskjellen mellom kontroll- og CrkL-overuttrykkende celler skifter til senere tider når konsentrasjonen av ECM-gelen øker. Resultatene tyder også på at de to cellepopulasjonene ble differensielt påvirket av økningen i ECM-gelkonsentrasjonen på forskjellige tidspunkter. For eksempel, ved 12 timer, viste CrkL-overuttrykkende celler betydelig høyere invasjon bare ved 0,1 μg / μL ECM-gel (figur 2H). Ved 24 timer viste imidlertid CrkL-overuttrykkende celler litt høyere eller lignende invasjon ved de testede ECM-gelkonsentrasjonene (figur 2I). Derfor er det viktig å undersøke både tidsavhengige og ECM-gelkonsentrasjonsavhengige forskjeller i celleinvasjon for å få en helhetlig oversikt over forskjellene mellom de to cellepopulasjonene med og uten CrkL-overuttrykk. Disse resultatene viser at kombinasjon av forbigående overekspresjon ved bruk av syntetisk mRNA med impedansbaserte sanntidscelleanalyser gir et kraftig verktøy for å analysere den potensielle korrelasjonen mellom genoverekspresjon og tumorcellemigrasjon og invasjon. Undersøkelse av effekten av konsentrasjonsvariasjoner i syntetisk mRNA og ECM-gel vil gi mer nøyaktig og detaljert informasjon.
Figur 1: Effektene av CrkI overekspresjon på glioblastomcellemigrasjon. U-118MG celler ble elektroporert med de angitte konsentrasjonene (ng / μL) av FLAG-merket CrkI mRNA. (A) For western blot-analysene ble de elektroporerte cellene dyrket i 1 dag før det totale cellelysatpreparatet. Proteinnivåene ved transfeksjon med syntetisk CrkI mRNA ble sammenlignet. Anti-Crk og anti-CrkL antistoffer ble brukt til å oppdage både de endogene og de FLAG-merkede proteinene og for å sammenligne forholdet mellom de endogene proteinene og FLAG-merkede proteiner. Vinculin og α-tubulin ble brukt som lastekontroller. (B) For cellemigrasjonsanalysene ble de elektroporerte cellene belagt på en CIM-plate uten videre dyrkning. Det ble innhentet celleindeksverdier fra fire brønner for hver prøve, og deres gjennomsnittlige ± SD-verdier er vist. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekter av CrkL-overekspresjon på glioblastomcelleinvasjon. U-118MG celler ble elektroporert med nukleasefri H2O eller 20 ng / μL FLAG-merket CrkL mRNA. (A) For western blot-analysene ble de elektroporerte cellene dyrket i 1 dag før det totale cellelysatpreparatet. Proteinnivåene ved transfeksjon med syntetisk CrkL mRNA ble sammenlignet. Anti-Crk og anti-CrkL antistoffer ble brukt til å oppdage både de endogene og de FLAG-merkede proteinene og for å sammenligne forholdet mellom de endogene proteinene og FLAG-merkede proteiner. Vinculin og α-tubulin ble brukt som lastekontroller. (VG Nett) For celleinvasjonsanalysen ble de elektroporerte cellene belagt på en CIM-plate med et ECM-gelbelegg uten videre dyrkning. Celleindeksverdiene ble hentet fra fire brønner for hver prøve, og deres gjennomsnittlige ± SD-verdier er vist. (B) Celleinvasjonsdataene fra kontrollcellene med forskjellige ECM-gelkonsentrasjoner ble sammenlignet. (C) Celleinvasjonsdataene fra CrkL-overuttrykkende celler med forskjellige ECM-gelkonsentrasjoner ble sammenlignet. (VG Nett) Celleinvasjonsdataene mellom kontroll- og CrkL-overuttrykkscellene ble sammenlignet for den angitte ECM-gelkonsentrasjonen. (H) En sammenligning av celleinvasjonen ved 12 timer mellom kontroll- og CrkL-overuttrykkende celler. (I) En sammenligning av celleinvasjonen ved 24 timer mellom kontroll- og CrkL-overuttrykkende celler. Forkortelser: ECM = ekstracellulær matrise; CIM = celleinvasjon og migrasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjematiske diagrammer over eksperimentelle prosedyrer etter genknockdown eller genoveruttrykk . (A) Den eksperimentelle prosedyren for sanntids celleanalyse etter siRNA-transfeksjonen. Siden det kreves 3-4 dager for å indusere fullstendig genknockdown etter siRNA-transfeksjon under eksperimentelle forhold, ble cellene replisert og dyrket i 3 dager etter elektroporeringen før de var klare for sanntids celleanalyser. (B) Den eksperimentelle prosedyren for sanntidscelleanalyse etter syntetisk mRNA-transfeksjon. Siden proteinuttrykket fra syntetisk mRNA-transfeksjon er raskt, ble de elektroporerte cellene brukt til sanntids celleanalyser samme dag. Legg merke til forskjellen mellom de to eksperimentelle prosedyrene; mens sanntids celleanalyse ble utført 3 dager etter elektroporering for genknockdown ved hjelp av siRNA, ble sanntids celleanalyse utført rett etter elektroporering for genoveruttrykk med syntetisk mRNA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migrasjon og invasjon er viktige trekk ved tumorceller. Måling av motiliteten til tumorceller og forståelse av den underliggende mekanismen som styrer tumorcellemotilitet gir kritisk innsikt i terapeutiske inngrep 2,27. Det er utviklet flere metoder for å studere cellemigrasjon7. Sårhelingsanalysen ved hjelp av riper eller kulturinnlegg er en enkel og ofte brukt metode som gir kontrasterende bilder av hulllukking. Den individuelle cellesporingsanalysen krever overvåking av individuelle celler med time-lapse-avbildning, for hvilken cellene kan merkes med fluorescerende fargestoffer. Både sårhelingsanalysen og den individuelle cellesporingsanalysen måler spontan bevegelse av celler.
Ved hjelp av time-lapse-avbildning og intensiv databehandling etter rekvisisjon kan begge analysene gi kvantitative sammenligninger mellom prøver28. Imidlertid er disse analysene ikke egnet for å studere celleinvasjon gjennom et ECM-proteinlag. I motsetning til dette måler transwellmigrasjons- og invasjonsanalysene rettet cellemigrasjon gjennom en transbrønninnsatsmembran med eller uten et ECM-proteinlag. Imidlertid er kontinuerlig overvåking ikke mulig med disse analysene fordi de migrerte cellene må samles på et gitt tidspunkt, og transbrønnen ikke kan brukes igjen. Alle disse analysene krever betydelig tid og krefter for databehandling eller for praktiske eksperimenter for å samle inn og telle cellene, noe som resulterer i potensielle operatørrelaterte variasjoner. Den største utfordringen for disse analysene er å gjøre sofistikerte kvantitative sammenligninger mellom flere, kombinerte behandlinger på ulike tidspunkter.
Bruken av sanntids celleanalysesystem presentert i dette arbeidet muliggjør kvantitativ, kontinuerlig og omfattende overvåking for å måle cellemigrasjon og invasjon, og dette systemet har mange fordeler i forhold til andre enkle cellemotilitetsanalyser, som gir resultater på begrensede, faste tidspunkter. Som med andre analyser, må de eksperimentelle forholdene for sanntids celleanalyser optimaliseres for hver cellelinje, da migrasjon og invasjon av forskjellige cellelinjer kan påvirkes differensielt av cellenummeret. Videre reduseres frekvensen av celleinvasjon når konsentrasjonen av ECM-gelen øker (figur 2B,C). Derfor anbefales det å teste forskjellige ECM-gelkonsentrasjoner og sammenligne effekten av genuttrykksendringer på celleinvasjon under disse forskjellige ECM-gelkonsentrasjonene.
Med sanntids celleanalysesystem er optimalisering enkelt og greit, da analysesystemet produserer data i sanntid uten praktisk tid. Analysesystemet identifiserer hvor snart cellene migrerer eller invaderer og når de når det maksimale cellemigrasjons- eller invasjonsnivået. Innhenting av denne informasjonen om cellemotilitet muliggjør detaljerte komparative analyser mellom ulike behandlingsgrupper, som kan gjøres ganske enkelt ved hjelp av programmets innebygde funksjoner. Videre tillater sensitiviteten til sanntidsanalysesystemet identifisering og kvantifisering av subtile endringer i cellemigrasjon og invasjon ved konsentrasjonsavhengig genuttrykk, som vist i figur 1 og figur 2.
Tidligere ble det gitt en detaljert prosedyre for å måle tumorcellemigrasjon og invasjon etter genknockdown ved hjelp av impedansbasert sanntidscelleanalysesystem. Siden gen-knockdown tar 3-4 dager etter at cellene er elektroporert med siRNA, ble cellene belagt på nytt etter elektroporering. De elektroporerte cellene ble dyrket i 3 dager før de ble høstet på nytt for sanntids celleanalyser, noe som gjorde hele eksperimentet til en to-trinns prosess: elektroporering på dag 1 og sanntids celleanalyse på dag 4, som vist i figur 3. I motsetning til dette er genuttrykk ved elektroporering av celler med syntetisk mRNA rask og effektiv, da time-lapse-analysen av fibroblaster elektroporert med syntetisk mRNA for GFP viste et sterkt GFP-signal 5 timer etter transfeksjon; Fluorescensintensiteten nådde maksimalt rundt 24 timer, hvoretter det var en gradvis nedgang i fluorescenssignalet18.
I tillegg viste U-118MG-cellene i dette arbeidet robust uttrykk av det eksogene proteinet når de ble elektroporert med syntetisk mRNA for CrkI (figur 1A) og for CrkL (figur 2A), i samsvar med tidligere observasjoner8. Det er derfor hensiktsmessig å utføre celleanalysene i sanntid rett etter elektroporering. Noen av trinnene for sanntids celleanalyse bør utføres før høsting av cellene for elektroporering. Hele eksperimentet er en ett-trinns prosess som involverer elektroporering og sanntids celleanalyse på dag 1. Det impedansbaserte sanntids celleanalysesystemet har blitt brukt mye for å studere tumorcellemigrasjon og invasjon i forskjellige solide tumorceller, inkludert brystkreft29, kolorektal kreft 30, melanom 31, eggstokkreft 32, hode og nakke plateepitelkreft 33, nyrecellekarsinom 34, bukspyttkjertelkarsinom 35, hepatocellulært karsinom 36 og ikke-småcellet lungekreftceller 10. Derfor gjør den kombinerte bruken av genoverekspresjon ved hjelp av mRNA eller genknockdown ved hjelp av siRNA sanntidsmåling av cellemigrasjon og invasjon mer nyttig og anvendelig.
Begrensningen av denne protokollen er at denne metoden krever dissosiering og høsting av celler rett før måling av cellemigrasjon og invasjon. De enzymatiske og mekaniske behandlingene under dissosiasjon, høsting og resuspensjon kan påvirke analysen37. I tillegg kan det være en forsinkelse i cellemigrasjon mens cellene gjenoppretter fra de enzymatiske og mekaniske behandlingene. Denne metoden kan ikke være hensiktsmessig hvis cellene lett blir skadet av trypsinisering eller andre mekaniske behandlinger under enkeltcelledissosiasjon og innsamling eller krever lang gjenopprettingstid etter disse manipulasjonene. Denne begrensningen gjelder også transwell migrasjonsanalysen, som er en annen metode for å måle rettet cellemigrasjon. I tillegg kan elektroporeringen etter cellepreparasjon gjøre cellene mer utsatt for skade38. Derfor er det viktig å optimalisere betingelsene for elektroporering for hver cellelinje og også å elektroporere kontrollcellene for mer nøyaktige sammenligninger.
Produsentens hjemmeside for elektroporeringssystemet gir de anbefalte parametrene for elektroporering (se fotnoten i materialfortegnelsen). Bruk av konsistente og minimalt skadelige eksperimentelle forhold under celledissosiasjon og resuspensjon er avgjørende for å oppnå reproduserbare resultater. Videre er korrelering av mengden mRNA, proteinnivået og cellemotiliteten avgjørende for å skille mellom de spesifikke og ikke-spesifikke effektene av mRNA-transfeksjon. I dette arbeidet ble det observert at hvis mRNA-konsentrasjonen oversteg et visst nivå, hemmet det ikke-spesifikt cellulære funksjoner, inkludert cellemigrasjon og invasjon (data ikke vist). Derfor er det viktig å titrere konsentrasjonen av mRNA. I tillegg er det kritisk å utføre sanntids celleanalyse når proteinuttrykket er på toppnivå, siden proteinuttrykk er forbigående med mRNA-transfeksjon. Som med andre cellemotilitetsanalyser, kan resultatene av denne sanntids celleanalysen bli forvirret av spredning av celler under migrasjon. Derfor anbefales det i tillegg å utføre en celleproliferasjonsanalyse for å forstå påvirkningen av celleproliferasjon på cellemigrasjon og invasjonsresultater.
Proteinnivåene av Crk og CrkL er kjent for å være forhøyet i noen typer humane kreftformer. Siden uttrykket av Crk og CrkL korrelerer med ulike tumorcellefunksjoner og deres overekspresjon bidrar til dårlig prognose, har Crk og CrkL blitt foreslått som terapeutiske mål for kreftbehandling13. Tidligere ble genknockdown indusert i glioblastomceller for å demonstrere at glioblastomcellemigrasjon og invasjon er robuste markører for Crk- og CrkL-aktivitet. Den nåværende studien gir en systematisk genuttrykkstilnærming for å indusere overekspresjon av Crk og CrkL ved bruk av syntetisk mRNA. En nær korrelasjon ble oppnådd mellom proteinnivåene av Crk og CrkL og glioblastomcellemigrasjon og invasjon ved hjelp av sanntids celleanalysesystem. Resultatene støtter videre hypotesen om at Crk og CrkL spiller viktige roller i glioblastomcellemigrasjon og invasjon. Sammen med den tidligere metodeoppgaven11 gir denne studien en proof-of-concept-tilnærming for å undersøke en potensiell sammenheng mellom endringer i genuttrykk og tumorcellemigrasjon og invasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takker Medical Writing Center ved Children's Mercy Kansas City for å redigere dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Natalie's ART Foundation (til TP) og av en MCA Partners Advisory Board tilskudd fra Children's Mercy Hospital (CMH) og University of Kansas Cancer Center (KUCC) (til TP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
References
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
