Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التهجين الفلوري في الموقع ووضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine للخلايا الشبيهة بالجذعية في قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum

Published: August 3, 2022 doi: 10.3791/64285
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

هنا ، نصف بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر Cladonema. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع مع علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، ويتيح وضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine تحديد الخلايا المتكاثرة. معا ، يمكن اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط.

Abstract

يظهر Cnidarians ، بما في ذلك شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية وقناديل البحر ، مورفولوجيا وأنماط حياة متنوعة تتجلى في الاورام الحميدة اللاطئة و medusae السباحة الحرة. كما يتضح من النماذج الراسخة مثل Hydra و Nematostella ، تساهم الخلايا الجذعية و / أو الخلايا التكاثرية في تطوير وتجديد الاورام الحميدة cnidarian. ومع ذلك ، فإن الآليات الخلوية الأساسية في معظم قناديل البحر ، وخاصة في مرحلة ميدوسا ، غير واضحة إلى حد كبير ، وبالتالي ، فإن تطوير طريقة قوية لتحديد أنواع معينة من الخلايا أمر بالغ الأهمية. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتصور الخلايا المتكاثرة الشبيهة بالساق في قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum. تمتلك Cladonema medusae مخالب متفرعة تنمو باستمرار وتحافظ على قدرتها على التجدد طوال مرحلة البلوغ ، مما يوفر منصة فريدة لدراسة الآليات الخلوية التي تنظمها الخلايا المتكاثرة و / أو الشبيهة بالجذعية. يسمح التهجين الفلوري الكامل في الموقع (FISH) باستخدام علامة الخلايا الجذعية باكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع ، بينما يتيح وضع العلامات النبضية باستخدام 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، وهي علامة طور S ، تحديد الخلايا المتكاثرة. من خلال الجمع بين كل من وضع العلامات FISH و EdU ، يمكننا اكتشاف الخلايا الشبيهة بالجذع المتكاثرة بنشاط على الحيوانات الثابتة ، ويمكن تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع على الحيوانات الأخرى ، بما في ذلك أنواع قناديل البحر غير النموذجية.

Introduction

تعتبر Cnidaria شعبة metazoan متفرعة بشكل أساسي تحتوي على ذات أعصاب وعضلات ، مما يضعها في وضع فريد لفهم تطور نمو الحيوان وعلم وظائف الأعضاء 1,2. يتم تصنيف Cnidarians إلى مجموعتين رئيسيتين: Anthozoa (على سبيل المثال ، شقائق النعمان البحرية والشعاب المرجانية) تمتلك فقط يرقات planula ومراحل polyp sessile ، في حين أن Medusozoa (أعضاء Hydrozoa و Staurozoaو Scyphozoa و Cubozoa) عادة ما تأخذ شكل medusae السباحة الحرة ، أو قنديل البحر ، وكذلك يرقات planula والأورام الحميدة. عادة ما يظهر Cnidarians قدرة عالية على التجدد ، وقد جذبت آلياتهم الخلوية الأساسية ، وخاصة امتلاكهم للخلايا الجذعية البالغة والخلايا التكاثرية ، الكثير من الاهتمام 3,4. تم تحديد الخلايا الجذعية الهيدروزوانية في البداية في هيدرا ، وتقع في الفراغات الخلالية بين الخلايا الظهارية الأديم الظاهر ويشار إليها عادة باسم الخلايا الخلالية أو الخلايا i3.

تشترك خلايا Hydrozoan i في خصائص مشتركة تشمل تعدد القدرات ، والتعبير عن علامات الخلايا الجذعية المحفوظة على نطاق واسع (على سبيل المثال ، Nanos ، Piwi ، Vasa) ، وإمكانية الهجرة3،5،6،7،8. كخلايا جذعية وظيفية ، تشارك الخلايا i على نطاق واسع في التطور وعلم وظائف الأعضاء والاستجابات البيئية للحيوانات الهيدروزوانية ، مما يشهد على قدرتها العالية على التجدد واللدونة3. في حين أن الخلايا الجذعية ، على غرار الخلايا i ، لم يتم تحديدها خارج الهيدروزوان ، حتى في الأنواع النموذجية الراسخة Nematostella ، لا تزال الخلايا التكاثرية تشارك في صيانة وتجديد الأنسجة الجسدية ، وكذلك الخط الجرثومي9. نظرا لأن الدراسات في التطور والتجديد cnidarian قد أجريت في الغالب على من نوع polyp مثل Hydra و Hydractinia و Nematostella ، فإن الديناميات الخلوية ووظائف الخلايا الجذعية في أنواع قناديل البحر لا تزال دون معالجة إلى حد كبير.

تم استخدام قنديل البحر الهيدروزواني Clytia hemisphaerica ، وهو نوع من قناديل البحر العالمية ذات الموائل المختلفة حول العالم ، بما في ذلك البحر الأبيض المتوسط وأمريكا الشمالية ، كحيوان نموذجي تجريبي في العديد من الدراسات التنموية والتطورية10. بفضل صغر حجمها وسهولة التعامل معها وبيضها الكبير ، فإن Clytia مناسبة لصيانة المختبر ، وكذلك لإدخال الأدوات الوراثية مثل الجينات المحورة التي تم إنشاؤها مؤخرا وطرق خروج المغلوب11 ، مما يفتح الفرصة لإجراء تحليل مفصل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء بيولوجيا قنديل البحر. في مخالب Clytia medusa ، تتمركز الخلايا i في المنطقة القريبة ، والتي تسمى البصلة ، وتهاجر الأسلاف مثل الأرومات الخيطية إلى الطرف البعيد بينما تتمايز إلى أنواع خلايا متميزة ، بما في ذلك الخلايا الخيطية12.

أثناء تجديد Clytia manubrium ، العضو الفموي لقناديل البحر ، تهاجر خلايا Nanos1 + i الموجودة في الغدد التناسلية إلى المنطقة التي يفقد فيها manubrium استجابة للضرر وتشارك في تجديد manubrium7. تدعم هذه النتائج فكرة أن الخلايا i في Clytia تتصرف أيضا كخلايا جذعية وظيفية تشارك في التشكل والتجديد. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن خصائص الخلايا i تختلف بين الحيوانات التمثيلية من نوع الاورام الحميدة مثل Hydra و Hydractinia3 ، فمن الممكن أن تتنوع خصائص ووظائف الخلايا الجذعية بين أنواع قناديل البحر. علاوة على ذلك ، باستثناء Clytia ، كانت التقنيات التجريبية محدودة لقناديل البحر الأخرى ، والديناميات التفصيلية للخلايا التكاثرية والخلايا الجذعية غير معروفة13.

قنديل البحر الهيدروزواني Cladonema pacificum هو كائن نموذجي ناشئ يمكن الاحتفاظ به في بيئة معملية بدون مضخة مياه أو نظام ترشيح. تحتوي Cladonema medusa على مخالب متفرعة ، وهي سمة مشتركة في عائلة Cladonematidae ، وعضو مستقبلات ضوئية يسمى ocellus على طبقة الأديم الظاهر بالقرب من المصباح14. تحدث عملية تفرع اللامسة في موقع تفرع جديد يظهر على طول الجانب المحوري من المجسة. بمرور الوقت ، تستمر المجسات في الاستطالة والتفرع ، مع دفع الفروع القديمة نحو الطرف15. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتجدد مخالب كلادونيما في غضون أيام قليلة عند البتر. اقترحت الدراسات الحديثة دور الخلايا المتكاثرة والخلايا الشبيهة بالجذع في تفرع اللامسة وتجديدها في Cladonema16,17. ومع ذلك ، في حين تم استخدام التهجين التقليدي في الموقع (ISH) لتصور التعبير الجيني في Cladonema ، نظرا لدقته المنخفضة ، فمن الصعب حاليا مراقبة ديناميكيات الخلايا الجذعية على المستوى الخلوي بالتفصيل.

تصف هذه الورقة طريقة لتصور الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية في Cladonema بواسطة FISH والتلوين المشترك مع EdU ، وهي علامة على تكاثر الخلايا18. نتصور نمط التعبير عن Nanos1 ، وهي علامة الخلايا الجذعية 5,17 ، بواسطة FISH ، والتي تسمح بتحديد توزيع الخلايا الشبيهة بالجذع على مستوى الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التلوين المشترك لتعبير Nanos1 مع وضع العلامات EdU يجعل من الممكن التمييز بين الخلايا الشبيهة بالجذعية المتكاثرة بنشاط. يمكن تطبيق هذه الطريقة لمراقبة كل من الخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا التكاثرية على مجموعة واسعة من مناطق التحقيق ، بما في ذلك تفرع المجسات ، وتوازن الأنسجة ، وتجديد الأعضاء في كلادونيما ، ويمكن تطبيق نهج مماثل على أنواع قناديل البحر الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. توليف التحقيق

  1. استخراج الحمض النووي الريبي
    1. ضع ثلاثة Cladonema medusae حية مستزرعة في مياه البحر الاصطناعية (ASW) في أنبوب سعة 1.5 مل باستخدام ماصة نقل سعة 3.1 مل مع قطع الطرف ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من ASW.
      ملاحظة: يتم تحضير ASW عن طريق إذابة خليط من الأملاح المعدنية في ماء الصنبور باستخدام معادل الكلور ؛ الثقل النوعي النهائي (S.G.) هو 1.018 أو الأجزاء لكل ألف (جزء في الألف) هو ~ 27.
    2. قم بتجميد الأنابيب سعة 1.5 مل في النيتروجين السائل لمنع نشاط RNase. أضف 30 ميكرولتر من محلول التحلل من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلية التي تمت فيها إضافة 2-mercaptoethanol (1 ميكرولتر / 100 ميكرولتر من محلول التحلل) وتجانس العينات في مخزن التحلل باستخدام الخالط.
      ملاحظة: لتجنب تجاوز المخزن المؤقت والعينة من الأنابيب ، يوصى بالتجانس بكمية صغيرة من محلول التحلل.
    3. أضف 570 ميكرولتر من محلول التحلل واستخرج إجمالي الحمض النووي الريبي باتباع بروتوكول مجموعة عزل الحمض النووي الريبي الكلي (الشكل 1).
    4. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. تخليق الحمض النووي المكمل (cDNA)
    1. باستخدام مجموعة ، قم بتوليف cDNA باستخدام إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من medusae كقالب (الشكل 1 والجدول 1).
    2. احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. تبرد بسرعة على الجليد.
    4. قم بإجراء تخليق cDNA مع الخليط من الخطوة 1.2.1 (الجدول 1). تخلط جيدا عن طريق السحب واحتضانها على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    5. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. تبرد بسرعة على الجليد.
    7. قم بقياس تركيز cDNA المركب باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه عند أو أقل من -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  3. توليف منتج PCR
    1. لإنشاء قالب PCR ، صمم التمهيدي المحدد باستخدام Primer-BLAST. مصدر التسلسل المرجعي من بيانات NCBI أو بيانات RNA-seq.
      ملاحظة: انظر جدول المواد لمعرفة البادئات المستخدمة في هذا البروتوكول.
    2. لتضخيم التسلسل المستهدف ، قم بإجراء استنساخ TA ، والذي لا يتطلب استخدام إنزيمات التقييد. للحصول على منتج PCR يضاف فيه الأدينين في نهاية 3 '، استخدم الإعدادات التالية: 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ 35 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 55-60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. استخدم Taq DNA polymerase للتفاعلات (الجدول 1).
      ملاحظة: لتحديد شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اتبع البروتوكول المصاحب لبوليميراز الحمض النووي المراد استخدامه ، والذي يوفر بشكل عام درجة حرارة التلدين الموصى بها ووقت التمديد.
    3. قم بتشغيل منتج PCR من خلال هلام أغاروز 1٪ وقطع النطاق محل الاهتمام. استخرج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من المواد الهلامية المقطوعة باستخدام مجموعة استخراج الجل.
  4. الربط
    1. قم بتوصيل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بالناقل مع 3 بوصات من الثايمين المتدلي عن طريق خلط الكواشف (الجدول 1) والتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الشكل 1).
      ملاحظة: يجب أن تكون النسبة الجزيئية للمتجه: PCR 1: >3. يبلغ حجم متجه pTA2 حوالي 3 كيلو بايت. إذا كان منتج PCR (إدراج) هو A (kb) و B (ng / μL) ، فيمكن حساب حجم الإدراج (X في الجدول 1) المراد أخذه بواسطة ([50 ng من المتجه × A kb من الإدراج]) / (3 kb vector × [ 1/3]) = 50 · نانوغرام من الإدراج. إذا كان تركيز الإدخال هو B ng / μL ، فإن الحجم المأخوذ هو 50 · A / B ميكرولتر من الإدراج.
  5. التحول والطلاء
    1. للتحول ، قم بإذابة الخلايا المختصة على الجليد وتوزيعها في 20 ميكرولتر لكل منها. أضف 1 ميكرولتر من البلازميدات التي تحتوي على منتج PCR (أقل من 5٪ من حجم الخلية المختصة) ودوامة لمدة 1 ثانية. احتضان على الجليد لمدة 5 دقائق ، ثم احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ودوامة لمدة 1 ثانية.
    2. أضف 180 ميكرولتر من مرق Super Optimal مع وسط قمع Catabolite (SOC) (وسط زراعة بكتيري غني بالتغذية) إلى الخلايا المختصة واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، انشر الخلايا المختصة على صفيحة أجار تحتوي على أمبيسيلين ، 5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-بيتا-د-جالاكتو-بيرانوسيد (X-gal) ، وإيزوبروبيل-β-د-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة (الشكل 1).
      ملاحظة: يتم استخدام X-gal و IPTG لاختيار المستعمرات الزرقاء والبيضاء.
  6. الثقافة السائلة
    1. اختر مستعمرة بيضاء من المستعمرات البيضاء والزرقاء على اللوحة. أضفه إلى 3-5 مل من وسط LB مع الأمبيسلين واحتضانه على شاكر لمدة 12-16 ساعة عند 37 درجة مئوية (الشكل 1).
  7. ميني بريب
    1. استخرج البلازميد من وسط LB باستخدام miniprep البلازميد (الشكل 1).
    2. تحديد تركيز البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  8. اقرأ التسلسل.
    1. لقراءة تسلسل الحمض النووي للبلازميد ، أرسل البلازميد لتسلسل سانجر ثم استخدم البرنامج لمواءمته مع تسلسل الجينوم / النسخ لتأكيد ما إذا كان التسلسل المستهدف قد تم تصنيعه بشكل صحيح وتقييم الاتجاه الذي يتم فيه إدخال التسلسل المستهدف في البلازميد (5 'إلى 3' أو 3' إلى 5').
      ملاحظة: إذا تم إدخال تسلسل الهدف في البلازميد في الاتجاه 5 'إلى 3' من موقع ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي بالقرب من نهاية 3 '، يمكن إنشاء مسبار مضاد للحساسية عن طريق النسخ في المختبر . إذا تم إدخال تسلسل الهدف في الاتجاه العكسي من 3 إلى 5 ، فيمكن إنشاء مسبار حسي (تحكم سلبي). في حالة استخدام متجهات مثل pTA2 ، يمكن استخدام موقعين لربط النسخ حسب الغرض.
  9. النسخ في المختبر
    1. قم بإعداد قالب الحمض النووي من البلازميد الذي تم إنشاؤه عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات خارج موقع ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال ، مواقع ربط T7 / T3) في البلازميد (الشكل 1).
      ملاحظة: يمكن استخدام البادئات العالمية مثل التمهيدي الأمامي M13-20 والتمهيدي العكسي M13 لإعداد قالب الحمض النووي الذي يتضمن مواقع ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي.
    2. قم بتنقية القالب بعد تضخيم PCR باستخدام مجموعة استخراج هلام / PCR.
    3. امزج الكواشف الموضحة أدناه ، وقم بإجراء تفاعل النسخ عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات (الشكل 1 والجدول 1).
    4. أضف 1.5 ميكرولتر من DNase واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. أضف 10 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase وقم بتنقية المسبار من محلول تفاعل النسخ باستخدام عمود تنظيف.
    6. تحقق من حجم الحمض النووي الريبي المركب عن طريق تحميل 1 ميكرولتر على هلام أغاروز 1٪ وتحديد التركيز باستخدام مقياس الطيف.
      ملاحظة: يجب أن يكون تركيز مجسات الحمض النووي الريبي المركب 100 نانوغرام / ميكرولتر على الأقل.
    7. أضف 30 ميكرولتر من الفورماميد للتخزين عند أو أقل من -20 درجة مئوية.

2. دمج EdU وتثبيته

  1. ضع Cladonema medusae (5-10 لكل أنبوب) في أنابيب سعة 1.5 مل باستخدام ماصة نقل 3.5 مل وأضف ASW حتى حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر. أضف 7.5 ميكرولتر من محلول مخزون EdU 10 mM واحتضان العينات لمدة 1 ساعة عند 22 درجة مئوية (الشكل 2). التركيز النهائي EdU هو 150 ميكرومتر.
    ملاحظة: استخدم medusae البالغ من العمر 5-7 أيام لمراقبة تكوين الفرع الثالث (الشكل 3 أ). يتم احتساب اليوم الذي تنفصل فيه medusae عن الورم على أنه اليوم 1 ، وفي اليوم 5 ، تبدأ medusae عادة في إظهار فرع ثالث على مخالبها الرئيسية.
  2. بعد 1 ساعة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من ASW الذي يحتوي على EdU.
  3. لتخدير medusae ، أضف 7٪ MgCl 2 في H2 O واحتضانه لمدة 5 دقائق.
  4. قم بإزالة 7٪ MgCl 2 في H 2 O وقم بإصلاح medusae طوال الليل (O.N.) عند 4 درجات مئوية مع 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في ASW (الشكل 2).
    ملاحظة: عند إجراء FISH بدون دمج EdU ، يمكن إصلاح العينات بشكل مشابه لتلك المعالجة ب EdU بعد التخدير (الخطوات 2.3-2.4).

3. التهجين الفلوري في الموقع

  1. علاج بروتيناز وما بعد التثبيت
    1. قم بإزالة PFA واغسل العينات باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.1٪ Tween-20 (PBST) لمدة 3 × 10 دقائق. استخدم 300-500 ميكرولتر من PBST لكل غسلة.
      ملاحظة: من هذه الخطوة إلى نهاية التهجين ، يجب إجراء التجربة في بيئة خالية من RNase ، مع ارتداء القفازات والقناع. يجب أن يتم عمل 1x PBS في هذه الخطوة بمياه معالجة DEPC. بعد التهجين ، يمكن استخدام 1x PBS المصنوع من الماء دون معالجة DEPC. تقوم بعض بروتوكولات ISH و FISH بتجفيف العينات باستخدام خطوات الميثانول ، مما يجعل من الممكن حفظ العينات الثابتة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. لتجنب العمل الزائد ، يتم حذف عملية الجفاف من هذا البروتوكول ، خاصة أنه يمكن الاحتفاظ بالعينات في PBST لمدة تصل إلى بضعة أيام.
    2. بعد التثبيت ، ضع العينة في أنابيب سعة 1.5 مل على شاكر ، باستثناء خطوة حضانة الأجسام المضادة ل DIG-POD O.N. (الخطوة 3.4.2). بعد الغسيل، أضف 10 ملغ/مل من محلول مخزون بروتيناز K في PBST واحتضن الميدوساي مع بروتيناز K (التركيز النهائي: 10 ميكروغرام/مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. قم بإزالة محلول Proteinase K واغسل العينات لمدة 2 × 1 دقيقة باستخدام PBST.
    4. لإصلاح medusae ، أضف 4٪ PFA في 1x PBS واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. قم بإزالة محلول PFA واغسل العينات لمدة 2 × 10 دقائق باستخدام PBST.
      ملاحظة: إذا تم التعبير عن الجين المستهدف بشكل كبير بإشارة خلفية منخفضة ، فيمكن تخطي الخطوات 3.1.2-3.1.5.
  2. التهجين
    1. قم بإزالة PBST وإضافة المخزن المؤقت للتهجين (HB Buffer ، الجدول 1). احتضان العينات في HB Buffer لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). استخدم 300-400 ميكرولتر من HB Buffer ، والذي يوفر حجما كافيا للتهجين الناجح.
      ملاحظة: يتم تحضير HB Buffer و Wash Buffer 1 و Wash Buffer 2 بمخزون SSC 20x. يتم تخزين HB Buffer عند أو أقل من -20 درجة مئوية ويجب إحضاره إلى RT قبل الاستخدام.
    2. قم بإزالة المخزن المؤقت HB وإضافة المخزن المؤقت HB جديد. التهجين المسبق عند 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل في حاضنة التهجين.
    3. قم بإزالة HB Buffer واحتضان مع HB Buffer الذي يحتوي على المجسات التي تم تخزينها في الخطوة 1.9.7 (تركيز المسبار النهائي: 0.5-1 نانوغرام / ميكرولتر في HB Buffer). تهجين عند 55 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة (الشكل 2) في حاضنة التهجين.
      ملاحظة: يمكن أن تختلف شدة إشارة FISH ونوعيتها بسبب التعبير الجيني المستهدف ، بالإضافة إلى طول المسبار ونوعيته. لزيادة الكثافة ، يمكن تعديل معلمات مثل مدة التهجين (18-72 ساعة) ودرجة الحرارة (50-65 درجة مئوية) ، ويمكن اختبار مجسات مختلفة. لتجنب الإشارات غير المحددة ، يمكن تعديل علاج Proteinase K (التركيز والمدة)19.
  3. إزالة المسبار
    1. قم بإزالة HB Buffer الذي يحتوي على مجسات ، ثم أضف Wash Buffer 1 (الجدول 1). اغسل العينات باستخدام Wash Buffer 1 لمدة 2 × 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية. استخدم 300-400 ميكرولتر من محلول الغسيل.
      ملاحظة: يمكن استخدام HB Buffer الذي يحتوي على مجسات بشكل متكرر ، حتى حوالي عشر مرات. بدلا من التخلص منها ، قم بتخزين HB Buffer المستخدم الذي يحتوي على مجسات عند أو أقل من -20 درجة مئوية. سخن المخزن المؤقت 1 للغسيل ، ومحلول الغسيل 2 ، و 2x SSC ، و PBST عند 55 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    2. قم بإزالة Wash Buffer 1 ، ثم أضف Wash Buffer 2 (الجدول 1). اغسل العينات باستخدام Wash Buffer 2 لمدة 2 × 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
    3. قم بإزالة Wash Buffer 2 ، ثم أضف 2x SSC. اغسل العينات باستخدام 2x SSC لمدة 2 × 15 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
    4. قم بإزالة 2x SSC ، ثم أضف PBST المسخن مسبقا. اغسل العينات لمدة 1 × 15 دقيقة باستخدام PBST في RT.
  4. حضانة الأجسام المضادة المضادة ل DIG
    1. إزالة PBST، ومن ثم إضافة 1٪ حظر المخزن المؤقت. احتضان العينات لمدة 1 ساعة على الأقل في RT أثناء الاهتزاز ببطء على الروك.
      ملاحظة: قم بإعداد مخزن مؤقت مانع بنسبة 1٪ حديثا عن طريق تخفيف مخزون المخزن المؤقت بنسبة 5٪ (الجدول 1). تحقق من العينات قبل تفاعل الجسم المضاد التالي لأن العينة تميل إلى الالتصاق بالجزء الخلفي من الغطاء أو الجدار نتيجة الاهتزاز.
    2. بعد الحظر ، قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر بنسبة 1٪ ، وأضف محلول مضاد ل DIG-POD (1: 500 ، في مخزن حظر 1٪) ، واحتضان العينات O.N. عند 4 درجات مئوية (الشكل 2).
      ملاحظة: احرص على الحفاظ على وقت الحضانة في غضون 12-16 ساعة لمنع اكتشاف إشارات غير محددة.
  5. الكشف عن المسبار المسمى DIG
    1. قم بإزالة محلول مكافحة DIG-POD ، ثم أضف Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT ، الجدول 1). اغسل العينات باستخدام مادة تي إن تي لمدة 3 × 10 دقائق في RT.
      ملاحظة: يوفر استخدام تقنية تضخيم إشارة التيراميد (TSA) صورة ذات استبانة أفضل ضد الكواشف الموسومة ببيروكسيديز الفجل (على سبيل المثال ، anti-DIG-POD).
    2. تمييع محلول مخزون تيراميد الصبغة المترافقة بالفلورسنت (Cy5-tyramide) (1:50) في المخزن المؤقت لتخفيف التضخيم لصنع محلول Cy5-tyramide النشط (الشكل 2).
    3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من مادة تي إن تي ، ثم أضف محلول Cy5-tyramide النشط. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في الظلام.
    4. اغسل العينات باستخدام PBST لمدة 3 × 10 دقائق في الظلام.
  6. الكشف عن EdU
    ملاحظة: تكتشف مجموعة EdU المدمجة EdU كإشارات فلورية (الشكل 2).
    1. لتحضير كوكتيل الكشف عن EdU ، امزج المكونات كما هو موضح في الجدول 1. استخدم 100 ميكرولتر من كوكتيل الكشف عن EdU لكل عينة.
      ملاحظة: قم بإعداد مادة مضافة 1x Reaction Buffer عن طريق تخفيف مادة مضافة 10x Reaction Buffer بماء فائق النقاء.
    2. قم بإزالة PBST، ثم قم بإضافة كوكتيل الكشف عن EdU. احتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    3. يغسل مع PBST لمدة 3 × 10 دقائق في الظلام.
  7. تلطيخ الحمض النووي
    1. تمييع Hoechst 33342 (1: 500) في PBST لإعداد حل Hoechst. إزالة PBST، ثم قم بإضافة حل Hoechst. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في الظلام (الشكل 2).
    2. اغسل العينات باستخدام PBST لمدة 3-4 × 10 دقائق في الظلام.
  8. تصاعد
    1. اصنع بنكا على الشريحة الزجاجية لمنع سحق العينة. ضع شريط فينيل على الشريحة الزجاجية وقم بتجويف المركز.
    2. انقل medusae إلى البنك على زجاج الشريحة باستخدام ماصة نقل 3.1 مل مع قطع الطرف.
      ملاحظة: احرص على عدم ترك المجسات تتداخل.
    3. قم بإزالة أي PBST باستخدام ماصة P200 ، ثم أضف ببطء 70٪ من الجلسرين كوسيط تركيب (الشكل 2).
      ملاحظة: بدلا من 70٪ من الجلسرين ، يمكن استخدام وسيط التثبيت المضاد للبهتان لمنع التألق من التلاشي.
    4. ضعي غطاء برفق على medusae بالملقط ، وأغلقي جانب الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
    5. احتفظ بالشرائح عند 4 درجات مئوية في الظلام إذا لم يتم إجراء المراقبة المجهرية على الفور.
  9. التصوير
    1. استخدم مجهر المسح الضوئي متحد البؤر للحصول على الصور. للحصول على دقة خلية واحدة ، استخدم عدسة زيتية 40x أو عدسة لتكبير أعلى.
    2. بعد الحصول على الصورة ، افتح الصور باستخدام برنامج ImageJ / FIJI وعد الخلايا الموجبة ل EdU + و / أو Nanos1 + بواسطة الأداة متعددة النقاط20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام مخالب Cladonema كنموذج لدراسة العمليات الخلوية للتشكل والتجديد15،16،17. يتكون هيكل اللامسة من أنبوب ظهاري حيث توجد خلايا تشبه الساق ، أو الخلايا i ، في المنطقة القريبة ، تسمى لمبة اللامسة ، وتضاف فروع جديدة بالتتابع إلى الجزء الخلفي من المنطقة البعيدة من المصباح على طول الجانب المحوري (الشكل 3 أ) 15. أشارت التقارير السابقة إلى أن تكاثر الخلايا نشط في كل من لمبة اللامسة وفي مواقع التفرع الجديدة باستخدام إما EdU أو BrdU وضع العلامات16,17. ومع ذلك ، نظرا لقرار التهجين في الموقع ، فمن غير الواضح ما إذا كانت الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية تكاثرية حقا أم لا. لتصور كل من الخلايا الشبيهة بالجذع والخلايا التكاثرية في وقت واحد على المستوى الخلوي ، قمنا بإجراء FISH لعلامات الخلايا الجذعية (Nanos1 أو Piwi) ووضع علامات EdU لخلايا المرحلة S في نفس العينات.

عند الدقة الخلوية بواسطة FISH ، تم تحديد تعبير Nanos1 في لمبة اللامسة وموقع التفرع الجديد (الشكل 3B). تم التعبير عن Piwi أيضا في لمبة اللامسة وفي موقع التفرع الجديد بنمط مشابه لنمط Nanos1 (الشكل 3C). كانت هذه النتائج متسقة مع الملاحظات من التهجين الكامل في الموقع في تقرير سابق17 ، حيث تم تصنيف الفرع الناشئ من ميدوسا البالغ من العمر 7 أيام بشكل موحد تقريبا بواسطة Nanos1 و Piwi. لتصور بداية تراكم الخلايا الشبيهة بالجذع ، قمنا بمراقبة موقع التفرع الجديد لميدوسا عمرها 5 أيام. كشف الوسم المشترك لتعبير Nanos1 والخلايا الإيجابية EdU عن النمط المكاني للخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية والخلايا التكاثرية في اللامسة (الشكل 4 أ). على الرغم من أن التوزيعات الإجمالية لخلايا EdU + و Nanos1 + كانت متسقة مع التقارير السابقة16,17 ، إلا أن خلايا EdU + كانت موزعة على نطاق أوسع في جميع أنحاء لمبة اللامسة ، على الأقل في بداية التفرع ، بينما تراكمت خلايا Nanos1 + محليا في لمبة اللامسة وموقع التفرع الجديد (الشكل 4A والشكل 4E ). تشير هذه الملاحظات إلى أنه يتم الكشف عن توزيعات متميزة للخلايا الشبيهة بالجذعية والخلايا المتكاثرة اعتمادا على توقيت النمو والمراحل المختلفة.

كشف عرض أكثر تفصيلا للمصباح وموقع التفرع الجديد أن إشارات EdU تندمج مع التلوين النووي ، في حين أن تعبير Nanos1 مقيد بالسيتوبلازم المحيط بالنواة ، بما يتفق مع تقرير سابق5 (الشكل 4B ، C). أظهر جزء (19.79٪) من الخلايا وضع علامات مشتركة على EdU و Nanos1 (EdU+ Nanos1+; الشكل 4B ، C ، رؤوس الأسهم الصفراء ، والشكل 4D) ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا هي مجموعة خلايا جذعية تتكاثر بنشاط. ومن المثير للاهتمام ، تم العثور على 14.46٪ من الخلايا لتكون EdU + Nanos1− في منتصف المصباح وفي موقع التفرع الجديد ، مما يشير إلى وجود خلايا تكاثرية غير شبيهة بالساق (الشكل 4B ، C ، الأسهم البيضاء ، والشكل 4D). في المقابل ، لوحظ أن 26.32٪ من الخلايا هي EdU− Nanos1 + في قاعدة المصباح وفي موقع التفرع الجديد ، مما يشير إلى وجود مجموعة من الخلايا الجذعية إما بطيئة الدوران أو هادئة ، ولا يتم اكتشاف أي منها عن طريق وضع علامات نبضة EdU (الشكل 4B ، C ، الأسهم الصفراء ، والشكل 4D).

Figure 1
الشكل 1: مخطط تخليق المسبار للتهجين في الموقع . استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من medusae وتخليق cDNA من إجمالي الحمض النووي الريبي. تم تصنيع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاصة ب Nanos1 من cDNA. تم ربط منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بالنواقل ، وتم جمع النواقل المضخمة من خلال زراعة الخلايا المختصة. تم تصنيع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل مع مواقع ربط بوليميراز الحمض النووي الريبي باستخدام البلازميدات كقوالب. تم تصنيع مجسات الحمض النووي الريبي المسمى DIG عن طريق النسخ في المختبر . الاختصارات: DIG = ديجوكسيجينين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مخطط EdU والتهجين الفلوري في الموقع التلوين المشترك. تم تحضين Medusae مع 150 μM EdU لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، تم تخدير medusae (لإرخاء الأنسجة) بنسبة 7٪ MgCl 2 في H2 O وثابتة بنسبة 4٪ PFA O.N. عند 4 درجات مئوية. بعد التثبيت ، تم تهجين العينات باستخدام HB Buffer مع مسبار لمدة 20-24 ساعة عند 55 درجة مئوية. بعد تفاعل التهجين ، تم غسل العينات وتحضينها بمحلول مضاد ل DIG-POD O.N. عند 4 درجات مئوية. تم تلطيخ medusae بمحلول Cy5-tyramide لمدة 10 دقائق ، يليه اكتشاف EdU لمدة 30 دقيقة وتلطيخه باستخدام Hoechst 33342 لمدة 30 دقيقة. بعد الانتهاء من جميع عمليات التلوين ، تم تثبيت medusae على الشريحة الزجاجية ، وتم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر. الاختصارات: EdU = 5-إيثينيل-2'-ديوكسييوريدين. FISH = التهجين الفلوري في الموقع ؛ PFA = بارافورمالدهيد ؛ O.N. = بين عشية وضحاها. HB = التهجين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: أنماط تعبير Nanos1 و Piwi على الجانب المحوري القريب من مخالب Cladonema medusa . (أ) رسم تخطيطي لكلادونما ميدوسا ومخالب. الجانب المحوري من المجسة: لمبة اللامسة (المنطقة الأكثر قربا) مع فروع جديدة تشكلت بالتتابع في موقع المتفرعة الجديد. يشير الجزء الداخلي (المربع المتقطع) إلى المساحة التي تم التقاطها بواسطة الصورة متحدة البؤر. (ب) صور FISH للتعبير الجيني Nanos1 من الجانب المحوري القريب من مخالب كلادونما ميدوسا البالغة من العمر 7 أيام. (ج) صور FISH للتعبير الجيني Piwi من الجانب القريب المحوري من مخالب Cladonema medusa البالغة من العمر 7 أيام. الحمض النووي: أخضر ، Nanos1: أرجواني. B'-C' لصور Nanos1 FISH فقط. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (B ، C). اختصار: FISH = التهجين الفلوري في الموقع . الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: أنماط تعبير EdU و Nanos1 على الجانب القريب المحوري من مخالب Cladonema medusa. (أ - ج) صور للجانب المحوري القريب من مخالب كلادونما ميدوسا الموسومة بالاشتراك مع تعبير Nanos1 و EdU ؛ تم استخدام medusae البالغ من العمر 5 أيام. (أ) نظرة عامة على المجسة. تشير المربعات الصفراء المتقطعة إلى مناطق B و C. (ب) تكبير لمبة المجسة. (ج) تكبير موقع تفرع جديد. تشير رؤوس الأسهم الصفراء إلى الخلايا الموجبة لكل من EdU و Nanos1. تشير الأسهم الصفراء إلى الخلايا الموجبة فقط ل Nanos1. تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا الموجبة فقط ل EdU. لوحات A-C هي صور مدمجة للحمض النووي (الأزرق) و EdU (الأخضر) و Nanos1 (أرجواني). A'-C' هي لوحات لصور EdU فقط ؛ A ''-C'' مخصصة لصور Nanos1 FISH فقط. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر (أ) ، 50 ميكرومتر (ب ، ج). (د) القياس الكمي للخلايا الإيجابية EdU و / أو Nanos1 في الجانب القاعدي من المجسة (منطقة القياس الكمي = 30.10 ميكرومتر2 مربع ، ن = 6 ، ما مجموعه 249 خلية). خلايا EdU + Nanos1− ، 14.46٪ ؛ خلايا EdU + Nanos1 + ، 19.79٪ ؛ خلايا EdU − Nanos1 + ، 26.32٪ ؛ خلايا EdU − Nanos1 − ، 39.44٪. (ه) رسم تخطيطي لمخالب كلادونما ميدوسا من الجانب المحوري. يظهر التوزيع الكلي لخلايا EdU + وخلايا Nanos1 + في E و E '، على التوالي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: تكوين تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل المختلفة والمخازن المؤقتة في هذا البروتوكول. لحساب حجم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (X μL) في تفاعل الربط ، راجع الملاحظة بعد خطوة البروتوكول 1.4. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا المتكاثرة والخلايا الجذعية هي مصادر خلوية مهمة في عمليات مختلفة مثل التشكل والنمو والتجديد21,22. تصف هذه الورقة طريقة للتلوين المشترك لعلامة الخلايا الجذعية Nanos1 بواسطة FISH و EdU وضع العلامات في Cladonema medusae. اقترح العمل السابق باستخدام وضع العلامات EdU أو BrdU أن الخلايا التكاثرية تتمركز في بصيلات اللامسة16,17 ، لكن خصائصها الجزيئية كانت غير واضحة. تظهر الدراسة الحالية التحديد المتزامن لتوزيع الخلايا التكاثرية وتوطين الخلايا الشبيهة بجذع Nanos1+ (الشكل 4). أظهرت النتائج أن بعض الخلايا التكاثرية عبرت عن Nanos1 ، لكن الخلايا الأخرى تم تمييزها فقط ب EdU ولم تعبر عن Nanos1 ، مما يشير إلى وجود عدم تجانس الخلايا الجذعية أو ، على الأرجح ، خلايا تكاثرية أخرى. سيكون من المثير للاهتمام تشريح التوزيع التفصيلي للخلايا الجذعية خلال العمليات المختلفة في كلادونيما ، بما في ذلك تفرع المجسات ، وتوازن الأنسجة ، وتجديد الأعضاء ، وصيانة الخلايا الجرثومية.

عنق الزجاجة الرئيسي لتصور الخلايا الجذعية في الحيوانات هو التحديد الأولي لعلامات الخلايا الجذعية. في cnidarians ، لم يتم تحديد علامات الخلايا الجذعية في غير الهيدروزوان3 ، وبالتالي ، في هذه المرحلة ، لا يزال التطبيق المباشر ل FISH لعلامات الخلايا الجذعية مقصورا على الهيدروزوان. ومع ذلك ، يسمح FISH بالكشف عن تعبير جيني محدد على المستوى الخلوي ، وبالتالي ، من خلال تغيير المجسات ، يمكن توسيع هذه الطريقة لمراقبة أنماط التعبير المكاني لأي جينات ذات أهمية بالتفصيل. على سبيل المثال ، باستخدام علامات الخلايا السلفية والخلايا المتمايزة ، يمكننا التحقق من توزيع أنواع معينة من الخلايا في مخالب كلادونيما. كتحذير ، قد يتعين تعديل البروتوكول الحالي اعتمادا على الجينات ذات الأهمية بسبب الاختلافات في مستويات التعبير واستقرار mRNA. على وجه الخصوص ، تعد الإشارات غير المحددة والإشارات الضعيفة من المشكلات الشائعة المرتبطة ب FISH. قد يؤدي تغيير وقت التهجين ودرجة الحرارة ، باستخدام كواشف التبييض (الفورماميد أو الميثانول) ، وضبط المعلمات الأخرى (وقت تفاعل TSA ، ومعالجة Proteinase K ، والغسيل بعد التهجين) إلى إشارات أوضح وعدد أقل من الإشارات غير المحددة23,24. من المهم أيضا اختيار بروتوكول FISH المناسب للنموذج الحيواني المستخدم ، حيث قد لا ينطبق بروتوكول FISH على الأنواع الأخرى ، حتى داخل نفس التصنيف7،25،26.

يستخدم وضع العلامات EdU بشكل عام للكشف عن الخلايا التكاثرية ولكن يمكن استخدامه لأغراض تجريبية مختلفة عن طريق تغيير التركيز ووقت الحضانة27. للكشف عن الخلايا المتكاثرة ، من الأهمية بمكان تحديد مدة وتركيز ناجحين لدمج EdU. في وضع العلامات النبضية المستخدمة في هذا العمل ، تم تمييز الخلايا التكاثرية فقط التي مرت عبر المرحلة S لفترة قصيرة من الزمن ، وتم استخدام طرق حضانة قصيرة مماثلة للكشف عن الخلايا المتكاثرة في cnidarians الأخرى6،28،29. على النقيض من ذلك ، قد يكشف الجمع بين دمج EdU لفترات طويلة و Nanos1 FISH عن وجود خلايا جذعية بطيئة الدوران أو هادئة27. من الممكن أيضا تمييز ليس فقط الخلايا التكاثرية ولكن أيضا خلايا التدوير الداخلي التي خضعت لتخليق الحمض النووي دون انقسام. علاوة على ذلك ، من خلال تتبع الخلايا الموسومة ب EdU لفترة أطول ، يمكننا تحديد السعة الخلوية للهجرة والتمايز المرتبطة بالخلايا التكاثرية ونسبها الخلوي 6,30.

في حينتم استخدام مزيج من تلطيخ FISH و EdU أو BrdU 7,31 ، يمكن بسهولة تطبيق الطريقة المحددة هنا على اللافقاريات البحرية الأخرى والحيوانات غير النموذجية ، بما في ذلك أنواع قناديل البحر المختلفة. تلطيخ EdU أبسط وأكثر حساسية من تلطيخ BrdU18 ، ومع حضانته القصيرة ، فإنه يتيح اكتشاف الخلايا المتكاثرة ، على عكس الدراسة السابقة التي استخدمت EdU لوضع العلامات على الخلايا على المدى الطويل7. في السنوات الأخيرة ، مع تقدم تقنيات التسلسل من الجيل التالي ، أصبحت معلومات الجينوم والتعبير الجيني متاحة للعديد من الأنواع. سيظل تحديد الخلايا الجذعية والخلايا التكاثرية نهجا فعالا لفهم عدم تجانس الخلايا الجذعية وتنوعها وتوفير نظرة ثاقبة للديناميات الخلوية الكامنة وراء الظواهر البيولوجية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل AMED تحت رقم المنحة JP22gm6110025 (إلى Y.N.) ومن قبل JSPS KAKENHI رقم المنحة 22H02762 (إلى Y.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 186 ، FISH ، EdU ، قنديل البحر ، ميدوسا ، كلادونيما باسيفيك ، الخلايا الجذعية ، تكاثر الخلايا
التهجين الفلوري في الموقع ووضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine للخلايا الشبيهة بالجذعية <em>في</em> قنديل البحر الهيدروزواني <em>Cladonema pacificum</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., … More

Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. i. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter