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Developmental Biology

Hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum

Published: August 3, 2022 doi: 10.3791/64285
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

Aquí, describimos un protocolo para visualizar células proliferantes similares a tallos en la medusa Cladonema. La hibridación in situ fluorescente de montaje completo con un marcador de células madre permite la detección de células madre, y el etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina permite la identificación de células en proliferación. Juntas, se pueden detectar células similares a la proliferación activa.

Abstract

Los cnidarios, incluidas las anémonas de mar, los corales y las medusas, exhiben una morfología y estilos de vida diversos que se manifiestan en pólipos sésiles y medusas que nadan libremente. Como se ejemplifica en modelos establecidos como Hydra y Nematostella, las células madre y / o células proliferativas contribuyen al desarrollo y regeneración de pólipos cnidarios. Sin embargo, los mecanismos celulares subyacentes en la mayoría de las medusas, particularmente en la etapa de medusa, son en gran medida poco claros y, por lo tanto, es fundamental desarrollar un método sólido para identificar tipos de células específicas. Este artículo describe un protocolo para visualizar células proliferantes similares a tallos en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum. Cladonema medusae posee tentáculos ramificados que crecen continuamente y mantienen la capacidad regenerativa a lo largo de su etapa adulta, proporcionando una plataforma única con la que estudiar los mecanismos celulares orquestados por la proliferación y / o células madre. La hibridación in situ fluorescente de montaje completo (FISH) utilizando un marcador de células madre permite la detección de células madre, mientras que el marcado de pulsos con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), un marcador de fase S, permite la identificación de células en proliferación. Combinando el etiquetado de FISH y EdU, podemos detectar células madre que proliferan activamente en animales fijos, y esta técnica se puede aplicar ampliamente a otros animales, incluidas las especies de medusas no modelo.

Introduction

Cnidaria es considerado un filo metazoario de ramificación basal que contiene animales con nervios y músculos, colocándolos en una posición única para comprender la evolución del desarrollo y la fisiología animal 1,2. Los cnidarios se clasifican en dos grupos principales: los antholozoos (por ejemplo, las anémonas de mar y los corales) poseen solo larvas de planula y etapas de pólipos sésiles, mientras que los medusozoos (miembros de hidrozoos, estaurozoos, esciphozoa y cubozoa) generalmente toman la forma de medusas o medusas que nadan libremente, así como larvas y pólipos de plánula. Los cnidarios comúnmente exhiben una alta capacidad regenerativa, y sus mecanismos celulares subyacentes, particularmente su posesión de células madre adultas y células proliferativas, han atraído mucha atención 3,4. Inicialmente identificadas en Hydra, las células madre hidrozoarias se encuentran en los espacios intersticiales entre las células epiteliales ectodérmicas y se conocen comúnmente como células intersticiales o células i3.

Las células i hidrozoarias comparten características comunes que incluyen multipotencia, la expresión de marcadores de células madre ampliamente conservados (por ejemplo, Nanos, Piwi, Vasa) y potencial de migración 3,5,6,7,8. Como células madre funcionales, las células i están ampliamente involucradas en el desarrollo, fisiología y respuestas ambientales de los animales hidrozoarios, lo que atestigua su alta capacidad regenerativa y plasticidad3. Si bien las células madre, similares a las células i, no se han identificado fuera de los hidrozoos, incluso en la especie modelo establecida Nematostella, las células proliferativas todavía están involucradas en el mantenimiento y la regeneración del tejido somático, así como en la línea germinal9. Como los estudios sobre el desarrollo y la regeneración del cnidario se han realizado predominantemente en animales de tipo pólipo como Hydra, Hydractinia y Nematostella, la dinámica celular y las funciones de las células madre en especies de medusas siguen sin abordarse en gran medida.

La medusa hidrozoaria Clytia hemisphaerica , una especie de medusa cosmopolita con diferentes hábitats en todo el mundo, incluyendo el Mar Mediterráneo y América del Norte, ha sido utilizada como animal modelo experimental en varios estudios de desarrollo y evolución10. Con su pequeño tamaño, fácil manejo y huevos grandes, Clytia es adecuado para el mantenimiento en laboratorio, así como para la introducción de herramientas genéticas como los métodos de transgénesis y knockout recientemente establecidos11, abriendo la oportunidad para un análisis detallado de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la biología de las medusas. En el tentáculo de Clytia medusa, las células I se localizan en la región proximal, llamada bulbo, y los progenitores como los nematoblastos migran a la punta distal mientras se diferencian en distintos tipos de células, incluidos los nematocitos12.

Durante la regeneración del Clytia manubrium, el órgano oral de las medusas, las células Nanos1+ i que están presentes en las gónadas migran a la región donde se pierde el manubrio en respuesta al daño y participan en la regeneración del manubrio7. Estos hallazgos apoyan la idea de que las células I en Clytia también se comportan como células madre funcionales que están involucradas en la morfogénesis y la regeneración. Sin embargo, dado que las propiedades de las células i difieren entre animales representativos de tipo pólipo como Hydra e Hydractinia3, es posible que las características y funciones de las células madre se diversifiquen entre las especies de medusas. Además, con la excepción de Clytia, las técnicas experimentales han sido limitadas para otras medusas, y la dinámica detallada de las células proliferativas y las células madre son desconocidas13.

La medusa hidrozoaria Cladonema pacificum es un organismo modelo emergente que se puede mantener en un entorno de laboratorio sin una bomba de agua o sistema de filtración. El Cladonema medusa tiene tentáculos ramificados, una característica común en la familia Cladonematidae, y un órgano fotorreceptor llamado ocelo en la capa ectodérmica cerca del bulbo14. El proceso de ramificación del tentáculo ocurre en un nuevo sitio de ramificación que aparece a lo largo del lado adaxial del tentáculo. Con el tiempo, los tentáculos continúan alargando y ramificándose, con las ramas más viejas empujadas hacia la punta15. Además, los tentáculos de Cladonema pueden regenerarse en unos pocos días después de la amputación. Estudios recientes han sugerido el papel de las células proliferantes y las células madre en la ramificación y regeneración de tentáculos en Cladonema16,17. Sin embargo, mientras que la hibridación in situ convencional (ISH) se ha utilizado para visualizar la expresión génica en Cladonema, debido a su baja resolución, actualmente es difícil observar la dinámica de las células madre a nivel celular en detalle.

Este artículo describe un método para visualizar células madre en Cladonema por FISH y co-tinción con EdU, un marcador de proliferación celular18. Visualizamos el patrón de expresión de Nanos1, un marcador de células madre 5,17, por FISH, que permite la identificación de la distribución de células madre a nivel de una sola célula. Además, la co-tinción de la expresión de Nanos1 con el etiquetado de EdU permite distinguir células similares a las células madre que proliferan activamente. Este método para monitorear tanto las células madre como las células proliferativas se puede aplicar a una amplia gama de áreas de investigación, incluida la ramificación de tentáculos, la homeostasis tisular y la regeneración de órganos en Cladonema, y se puede aplicar un enfoque similar a otras especies de medusas.

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Protocol

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.

1. Síntesis de la sonda

  1. Extracción de ARN
    1. Coloque tres Cladonema medusae vivas que se cultivan en agua de mar artificial (ASW) en un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta de transferencia de 3,1 ml con la punta cortada, y retire la mayor cantidad de ASW posible.
      NOTA: ASW se prepara disolviendo una mezcla de sales minerales en agua del grifo con neutralizador de cloro; la gravedad específica final (S.G.) es 1.018 o las partes por mil (ppt) es ~27.
    2. Congele los tubos de 1,5 ml en nitrógeno líquido para inhibir la actividad de la RNasa. Añadir 30 μL de tampón de lisis del kit de aislamiento de ARN total en el que se ha añadido 2-mercaptoetanol (1 μL/100 μL de tampón de lisis) y homogeneizar las muestras en el tampón de lisis utilizando un homogeneizador.
      NOTA: Para evitar el desbordamiento del tampón y la muestra de los tubos, se recomienda la homogeneización con una pequeña cantidad de tampón de lisis.
    3. Añadir 570 μL de tampón de lisis y extraer el ARN total siguiendo el protocolo del kit de aislamiento de ARN total (Figura 1).
    4. Mida la concentración del ARN extraído utilizando un espectrofotómetro y guárdelo a −80 °C hasta su uso.
  2. Síntesis de ADNc
    1. Usando un kit, sintetice ADNc usando el ARN total extraído de las medusas como plantilla (Figura 1 y Tabla 1).
    2. Incubar a 65 °C durante 5 min.
    3. Enfriar rápidamente sobre hielo.
    4. Realizar la síntesis de ADNc con la mezcla del paso 1.2.1 (Tabla 1). Mezclar bien pipeteando e incubar a 42 °C durante 60 min.
    5. Incubar a 95 °C durante 5 min.
    6. Enfriar rápidamente sobre hielo.
    7. Mida la concentración del ADNc sintetizado utilizando un espectrofotómetro y almacene a -20 °C o menos hasta su uso.
  3. Síntesis de productos de PCR
    1. Para crear una plantilla de PCR, diseñe el cebador específico utilizando Primer-BLAST. Obtener la secuencia de referencia a partir de datos NCBI o datos RNA-seq.
      NOTA: Consulte la Tabla de materiales para ver los cebadores utilizados en este protocolo.
    2. Para amplificar la secuencia objetivo, realice la clonación de TA, que no requiere el uso de enzimas de restricción. Para obtener un producto de PCR en el que se añade una adenina en el extremo 3', utilice los siguientes ajustes: 98 °C durante 2 min; 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 55-60 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 min. Utilice Taq DNA polimerasa para las reacciones (Tabla 1).
      NOTA: Para determinar las condiciones de PCR, siga el protocolo que acompaña a la ADN polimerasa a utilizar, que generalmente proporciona una temperatura de recocido recomendada y un tiempo de extensión.
    3. Pase el producto de PCR a través de un gel de agarosa al 1% y corte la banda de interés. Extraiga los productos de PCR de los geles cortados utilizando un kit de extracción en gel.
  4. Ligadura
    1. Ligate el producto de PCR al vector con voladizos de timina 3' mezclando los reactivos (Tabla 1) e incubando a 37 °C durante 30 min (Figura 1).
      NOTA: La relación molecular del vector:PCR debe ser de 1:>3. El tamaño del vector pTA2 es de aproximadamente 3 kb. Si el producto de PCR (inserto) es A (kb) y B (ng/μL), el volumen del inserto (X en la Tabla 1) a tomar puede calcularse por ([50 ng de vector × A kb de inserto])/(3 kb vector × [ 1/3]) = 50· Un ng de inserto. Si la concentración del inserto es B ng/μL, entonces el volumen tomado es 50· A/B μL del inserto.
  5. Transformación y chapado
    1. Para la transformación, descongelar las células competentes en hielo y dispensarlas en alícuotas de 20 μL cada una. Añadir 1 μL de los plásmidos que contienen el producto de PCR (menos del 5% del volumen celular competente) y vórtice durante 1 s. Incubar en hielo durante 5 min, y luego incubar a 42 °C durante 45 s, y vórtice durante 1 s.
    2. Añadir 180 μL de caldo Super Optimal con medio de represión catabolítica (SOC) (un medio de cultivo bacteriano nutricionalmente rico) a las células competentes e incubar a 37 °C durante 30 min. Después de 30 min, esparcir las células competentes sobre una placa de agar que contenga ampicilina, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galacto-piranosido (X-gal) e isopropil-β-d-1-tiogalactopiranosida (IPTG), e incubar a 37 °C durante 12-16 h (Figura 1).
      NOTA: X-gal e IPTG se utilizan para seleccionar colonias azules y blancas.
  6. Cultivo líquido
    1. Elija una colonia blanca de las colonias blancas y azules en el plato. Añádalo a 3-5 mL de medio LB con ampicilina e incubar en un agitador durante 12-16 h a 37 °C (Figura 1).
  7. Minipreparación
    1. Extraiga el plásmido del medio LB usando una minipreparación de plásmido (Figura 1).
    2. Cuantificar la concentración de plásmidos utilizando un espectrofotómetro.
  8. Lea la secuencia.
    1. Para leer la secuencia de ADN del plásmido, envíe el plásmido para la secuenciación de Sanger y luego use un software para alinearlo con la secuencia genoma/transcriptoma para confirmar si la secuencia objetivo se sintetiza correctamente y evaluar en qué dirección se inserta la secuencia objetivo en el plásmido (5' a 3' o 3' a 5').
      NOTA: Si la secuencia diana se inserta en el plásmido en la dirección 5' a 3' desde el sitio de unión de la ARN polimerasa cerca del extremo 3', se puede generar una sonda antisentido mediante transcripción in vitro . Si la secuencia objetivo se inserta en la dirección inversa de 3' a 5', se puede generar una sonda de detección (control negativo). Si se utilizan vectores como pTA2, se pueden usar dos sitios de unión de transcripción dependiendo del propósito.
  9. Transcripción in vitro
    1. Prepare la plantilla de ADN del plásmido creado realizando PCR utilizando cebadores fuera del sitio de unión de la ARN polimerasa (por ejemplo, sitios de unión T7/T3) en el plásmido (Figura 1).
      NOTA: Los cebadores universales como el cebador directo M13-20 y el cebador inverso M13 se pueden usar para preparar una plantilla de ADN que incluya sitios de unión a la ARN polimerasa.
    2. Purificar la plantilla después de la amplificación por PCR utilizando un kit de extracción de gel/PCR.
    3. Mezclar los reactivos que se muestran a continuación y realizar la reacción de transcripción a 37 °C durante 3 h (Figura 1 y Tabla 1).
    4. Añadir 1,5 μL de DNasa e incubar a 37 °C durante 30 min.
    5. Añadir 10 μL de agua libre de RNasa y purificar la sonda de la solución de reacción de transcripción utilizando una columna de limpieza.
    6. Compruebe el tamaño del ARN sintetizado cargando 1 μL en un gel de agarosa al 1% y determine la concentración utilizando un espectrofotómetro.
      NOTA: Las sondas de ARN sintetizadas deben tener una concentración de al menos 100 ng/μL.
    7. Añadir 30 μL de formamida para su almacenamiento a −20 °C o menos.

2. Incorporación y fijación de EdU

  1. Introducir Cladonema medusae (5-10 animales por tubo) en tubos de 1,5 ml utilizando una pipeta de transferencia de 3,5 ml y añadir ASW hasta un volumen total de 500 μL. Añadir 7,5 μL de solución madre de EdU de 10 mM e incubar las muestras durante 1 h a 22 °C (figura 2). La concentración final de EdU es de 150 μM.
    NOTA: Use medusas de 5 a 7 días de edad para monitorear la formación de la tercera rama (Figura 3A). El día en que las medusas se desprenden del pólipo se cuenta como el día 1, y el día 5, las medusas generalmente comienzan a exhibir una tercera rama en sus tentáculos principales.
  2. Después de 1 h, retire la mayor cantidad posible de ASW que contenga EdU.
  3. Para anestesiar las medusas, añadir MgCl2 al 7% enH2Oe incubar durante 5 min.
  4. Eliminar el MgCl 2 al 7% en H2Oy fijar las medusas durante la noche (O.N.) a 4 °C con paraformaldehído al 4% (PFA) en ASW (Figura 2).
    NOTA: Cuando se realiza FISH sin incorporación de EdU, las muestras se pueden fijar de manera similar a las tratadas con EdU después de la anestesia (pasos 2.3-2.4).

3. Hibridación fluorescente in situ

  1. Tratamiento con proteinasa y post fijación
    1. Retire el PFA y lave las muestras con PBS que contenga 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 3 x 10 min. Use 300-500 μL de PBST por lavado.
      NOTA: Desde este paso hasta el final de la hibridación, el experimento debe realizarse en un entorno libre de RNasa, usando guantes y una máscara. El 1x PBS en este paso debe hacerse con agua tratada con DEPC. Después de la hibridación, se puede usar 1x PBS hecho con agua sin tratamiento DEPC. Algunos protocolos ISH y FISH deshidratan las muestras utilizando pasos de metanol, lo que permite guardar las muestras fijas a -20 °C hasta su uso. Para evitar trabajos superfluos, el proceso de deshidratación se omite de este protocolo, particularmente porque las muestras se pueden mantener en PBST hasta por unos pocos días.
    2. Después de la fijación, colocar la muestra en tubos de 1,5 ml en un agitador, excepto para la etapa de incubación del anticuerpo anti-DIG-POD O.N. (paso 3.4.2). Después del lavado, añadir 10 mg/ml de solución madre de proteinasa K en PBST e incubar las medusas con proteinasa K (concentración final: 10 μg/ml) a 37 °C durante 10 min.
    3. Retire la solución de proteinasa K y lave las muestras durante 2 x 1 min con PBST.
    4. Para postfijar las medusas, añadir 4% de PFA en 1x PBS e incubar a 37 °C durante 15 min.
    5. Retire la solución de PFA y lave las muestras durante 2 x 10 min con PBST.
      NOTA: Si el gen diana está altamente expresado con una señal de fondo baja, se pueden omitir los pasos 3.1.2-3.1.5.
  2. Hibridación
    1. Elimine el PBST y agregue el búfer de hibridación (búfer HB, tabla 1). Incubar las muestras en HB Buffer durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Utilice 300-400 μL de HB Buffer, que proporciona suficiente volumen para una hibridación exitosa.
      NOTA: HB Buffer, Wash Buffer 1 y Wash Buffer 2 se preparan con 20x SSC stock. HB Buffer se almacena a −20 °C o menos y debe introducirse en RT antes de su uso.
    2. Elimine el búfer HB y agregue un nuevo búfer HB. Prehibridar a 55 °C durante al menos 2 h en una incubadora de hibridación.
    3. Extraiga el tampón HB e incube con el tampón HB que contenga las sondas almacenadas en el paso 1.9.7 (concentración final de la sonda: 0,5-1 ng/μL en el tampón HB). Hibridar a 55 °C durante 18-24 h (Figura 2) en una incubadora de hibridación.
      NOTA: La intensidad y especificidad de la señal FISH puede variar debido a la expresión génica objetivo, así como a la longitud y especificidad de la sonda. Para aumentar la intensidad, se pueden ajustar parámetros como la duración de la hibridación (18-72 h) y la temperatura (50-65 °C), y se pueden probar diferentes sondas. Para evitar señales inespecíficas, el tratamiento con proteinasa K (concentración y duración) puede ser modificado19.
  3. Extracción de la sonda
    1. Quite el búfer HB que contiene sondas y, a continuación, agregue el búfer de lavado 1 (tabla 1). Lavar las muestras con Wash Buffer 1 durante 2 x 15 min a 55 °C. Use 300-400 μL de tampón de lavado.
      NOTA: Las sondas que contienen HB Buffer se pueden utilizar repetidamente, hasta unas diez veces. En lugar de desechar, almacene el HB Buffer utilizado que contiene sondas a -20 °C o menos. Precaliente el tampón de lavado 1, el tampón de lavado 2, 2x SSC y PBST a 55 °C antes de usar.
    2. Quite el tampón de lavado 1 y, a continuación, agregue el tampón de lavado 2 (tabla 1). Lavar las muestras con Wash Buffer 2 durante 2 x 15 min a 55 °C.
    3. Quite el búfer de lavado 2 y, a continuación, agregue 2x SSC. Lavar las muestras con 2x SSC durante 2 x 15 min a 55 °C.
    4. Quite 2x SSC y, a continuación, agregue PBST precalentado. Lave las muestras durante 1 x 15 min con PBST en RT.
  4. Incubación de anticuerpos anti-DIG
    1. Elimine PBST y, a continuación, agregue un búfer de bloqueo del 1%. Incubar las muestras durante al menos 1 h en RT mientras agita lentamente sobre un balancín.
      NOTA: Prepare el colchón de bloqueo al 1% diluyendo el stock regulador de bloqueo del 5% (Tabla 1). Revise las muestras antes de la siguiente reacción de anticuerpos porque la muestra tiende a adherirse a la parte posterior de la tapa o la pared como resultado de la sacudida.
    2. Después del bloqueo, retire el tampón de bloqueo al 1%, agregue la solución anti-DIG-POD (1:500, en tampón de bloqueo al 1%) e incube las muestras O.N. a 4 °C (Figura 2).
      NOTA: Tenga cuidado de mantener el tiempo de incubación dentro de 12-16 h para evitar la detección de señales no específicas.
  5. Detección de sonda marcada con DIG
    1. Retire la solución anti-DIG-POD y, a continuación, agregue el tampón Tris-NaCl-Tween (TNT, tabla 1). Lave las muestras con TNT durante 3 x 10 min en RT.
      NOTA: El uso de la técnica de amplificación de señal de tiramida (TSA) proporciona una imagen de mejor resolución contra los reactivos marcados con peroxidasa de rábano picante (por ejemplo, anti-DIG-POD).
    2. Solución madre diluida de tiramida conjugada con colorante fluorescente (Cy5-tiramida) (1:50) en el tampón diluyente de amplificación para producir la solución activa de tiramida Cy5 (Figura 2).
    3. Retire la mayor cantidad de TNT posible y, a continuación, agregue la solución activa de Cy5-tiramida. Incubar las muestras durante 10 minutos en la oscuridad.
    4. Lave las muestras con PBST durante 3 x 10 minutos en la oscuridad.
  6. Detección de EdU
    NOTA: El kit EdU detecta EdU incorporado como señales fluorescentes (Figura 2).
    1. Para preparar el cóctel de detección EdU, mezcle los componentes como se muestra en la Tabla 1. Utilice 100 μL de cóctel de detección de EdU para cada muestra.
      NOTA: Prepare 1x aditivo de tampón de reacción diluyendo 10x aditivo de tampón de reacción con agua ultrapura.
    2. Elimine PBST y, a continuación, agregue el cóctel de detección EdU. Incubar en la oscuridad durante 30 min.
    3. Lavar con PBST durante 3 x 10 min en la oscuridad.
  7. Tinción de ADN
    1. Diluir Hoechst 33342 (1:500) en PBST para preparar la solución de Hoechst. Quite el PBST y, a continuación, agregue la solución de Hoechst. Incubar las muestras durante 30 minutos en la oscuridad (Figura 2).
    2. Lave las muestras con PBST durante 3-4 x 10 minutos en la oscuridad.
  8. Montura
    1. Haga un banco en el portaobjetos de vidrio para evitar que la muestra se aplaste. Aplique cinta de vinilo a la corredera de vidrio y ahueca el centro.
    2. Transfiera las medusas al banco en el vidrio deslizante usando una pipeta de transferencia de 3,1 ml con la punta cortada.
      NOTA: Tenga cuidado de no dejar que los tentáculos se superpongan.
    3. Retire cualquier PBST con una pipeta P200 y luego agregue lentamente glicerol al 70% como medio de montaje (Figura 2).
      NOTA: En lugar de 70% de glicerol, se puede usar un medio de montaje antidecolorante para evitar que la fluorescencia se desvanezca.
    4. Coloque suavemente un cubreobjetos en las medusas con pinzas y selle el costado del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
    5. Mantener los portaobjetos a 4 °C en la oscuridad si no se realiza inmediatamente la observación microscópica.
  9. Imagenológico
    1. Utilice un microscopio confocal de barrido láser para adquirir imágenes. Para una resolución de una sola celda, use una lente de aceite de 40x o una lente para un aumento mayor.
    2. Después de la adquisición de la imagen, abra las imágenes con el software ImageJ/FIJI y cuente las celdas que son positivas para EdU+ y/o Nanos1+ con la herramienta multipunto20.

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Representative Results

Los tentáculos de Cladonema se han utilizado como modelo para estudiar los procesos celulares de morfogénesis y regeneración15,16,17. La estructura del tentáculo está compuesta por un tubo epitelial donde las células madre, o células i, se encuentran en la región proximal, llamada bulbo del tentáculo, y se agregan nuevas ramas secuencialmente a la parte posterior de la región distal del bulbo a lo largo del lado adaxial (Figura 3A)15. Informes anteriores han indicado que la proliferación celular es activa tanto en el bulbo del tentáculo como en los nuevos sitios de ramificación utilizando el etiquetado EdU o BrdU16,17. Sin embargo, debido a la resolución de la hibridación in situ, no está claro si las células madre son realmente proliferativas o no. Para visualizar simultáneamente células madre y proliferativas a nivel celular, realizamos FISH para marcadores de células madre (Nanos1 o Piwi) y etiquetado EdU para células de fase S en las mismas muestras.

A resolución celular por FISH, la expresión de Nanos1 se localizó en el bulbo del tentáculo y el nuevo sitio de ramificación (Figura 3B). Piwi también se expresó en el bulbo del tentáculo y en el nuevo sitio de ramificación en un patrón similar al de Nanos1 (Figura 3C). Estos resultados fueron consistentes con las observaciones de la hibridación in situ de montaje completo en un informe anterior17, donde la rama en ciernes de una medusa de 7 días de edad fue etiquetada casi uniformemente por Nanos1 y Piwi. Para visualizar el comienzo de la acumulación de células madre, monitoreamos el nuevo sitio de ramificación de una medusa de 5 días de edad. El etiquetado conjunto de la expresión de Nanos1 y las células positivas para EdU reveló el patrón espacial de células madre y células proliferativas en el tentáculo (Figura 4A). Aunque las distribuciones brutas de las células EdU+ y Nanos1+ fueron consistentes con los informes anteriores16,17, las células EdU+ se distribuyeron más ampliamente en todo el bulbo del tentáculo, al menos al comienzo de la ramificación, mientras que las células Nanos1+ se acumularon más localmente en el bulbo del tentáculo y en el nuevo sitio de ramificación (Figura 4A y Figura 4E ). Estas observaciones sugieren que se detectan distintas distribuciones de células madre y células en proliferación dependiendo del momento del desarrollo y las diferentes etapas.

Una vista más detallada del bulbo y del nuevo sitio de ramificación reveló que las señales de EdU se fusionan con la tinción nuclear, mientras que la expresión de Nanos1 está limitada al citoplasma que rodea el núcleo, de acuerdo con un informe anterior5 (Figura 4B, C). Una fracción (19,79%) de las células exhibieron co-etiquetado de EdU y Nanos1 (EdU+ Nanos1+; Figura 4B, C, puntas de flecha amarillas y Figura 4D), lo que sugiere que estas células son una población de células madre que prolifera activamente. Curiosamente, se encontró que el 14,46% de las células eran EdU + Nanos1− en el centro del bulbo y en el nuevo sitio de ramificación, lo que sugiere la presencia de células proliferativas no similares al tallo (Figura 4B, C, flechas blancas y Figura 4D). En contraste, se observó que el 26.32% de las células eran EdU− Nanos1+ en la base del bulbo y en el nuevo sitio de ramificación, lo que indica la presencia de una población de células madre que es de ciclo lento o quiescente, ninguna de las cuales es detectada por el etiquetado del pulso EdU (Figura 4B, C, flechas amarillas y Figura 4D).

Figure 1
Figura 1: Esquema de síntesis de la sonda para hibridación in situ . Extracción de ARN total de medusas y síntesis de ADNc a partir de ARN total. Los productos de PCR específicos de Nanos1 se sintetizaron a partir del ADNc. Los productos de PCR se ligaron a los vectores y los vectores amplificados se recolectaron a través de cultivos celulares competentes. Los productos de PCR con sitios de unión a ARN polimerasa se sintetizaron utilizando los plásmidos como plantillas. Las sondas de ARN marcadas con DIG se sintetizaron mediante transcripción in vitro . Abreviaturas: DIG = digoxigenina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquema de co-tinción de EdU e hibridación fluorescente in situ . Las medusas se incubaron con 150 μM de EdU durante 1 h. Posteriormente, las medusas fueron anestesiadas (para relajar el tejido) con MgCl2 al 7% enH2Oy fijadas con O.N. de PFA al 4% a 4 °C. Después de la fijación, las muestras se hibridaron con HB Buffer con una sonda durante 20-24 h a 55 °C. Después de la reacción de hibridación, las muestras se lavaron e incubaron con O.N. solución anti-DIG-POD a 4 °C. Las medusas se tiñeron con solución de Cy5-tiramida durante 10 min, seguido de la detección de EdU durante 30 min y la tinción con Hoechst 33342 durante 30 min. Después de completar todos los procesos de tinción, las medusas se montaron en el portaobjetos de vidrio y se obtuvieron imágenes con un microscopio confocal. Abreviaturas: EdU = 5-etinil-2'-desoxiuridina; FISH = hibridación fluorescente in situ ; PFA = paraformaldehído; O.N. = durante la noche; HB = hibridación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Patrones de expresión de Nanos1 y Piwi en el lado adaxial proximal del tentáculo de Cladonema medusa. (A) Esquema de una Cladonema medusa y tentáculo. El lado adaxial del tentáculo: el bulbo del tentáculo (la región más proximal) con nuevas ramas formadas secuencialmente en el nuevo sitio de ramificación. El recuadro (cuadrado discontinuo) indica el área capturada por la imagen confocal. (B) Imágenes FISH de la expresión génica Nanos1 del lado proximal y adaxial del tentáculo de una Cladonema medusa de 7 días de edad. (C) Imágenes FISH de la expresión del gen Piwi desde el lado proximal y adaxial del tentáculo de una Cladonema medusa de 7 días de edad. ADN: verde, Nanos1: magenta. B'-C' para imágenes solo Nanos1 FISH. Barras de escala = 100 μm (B,C). Abreviatura: FISH = hibridación fluorescente in situ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Patrones de expresión de EdU y Nanos1 en el lado proximal, adaxial del tentáculo de Cladonema medusa. (A-C) Imágenes del lado adaxial proximal del tentáculo de Cladonema medusa co-marcado con expresión Nanos1 y EdU; Se utilizaron medusas de 5 días de edad. (A) Una visión general del tentáculo. Los cuadrados discontinuos amarillos indican las áreas de B y C. (B) Aumento de la bombilla del tentáculo. (C) Ampliación de un nuevo sitio de ramificación. Las puntas de flecha amarillas indican las células que son positivas tanto para EdU como para Nanos1. Las flechas amarillas indican las células que solo son positivas para Nanos1. Las flechas blancas indican que las celdas solo son positivas para EdU. Los paneles A-C son imágenes combinadas para ADN (azul), EdU (verde) y Nanos1 (magenta). A'-C' son paneles para imágenes solo de EdU; A''-C'' son solo para imágenes Nanos1 FISH. Barras de escala = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) La cuantificación de células EdU- y/o Nanos1-positivas en el lado basal del tentáculo (área de cuantificación = 30.10 μm2 cuadrados, n = 6, un total de 249 células). Células EdU+ Nanos1−, 14,46%; Células EdU+ Nanos1+, 19,79%; EdU− células Nanos1+, 26,32%; Células EdU− Nanos1−, 39,44%. (E) Esquema de un tentáculo de Cladonema medusa desde el lado adaxial. La distribución general de las células EdU+ y las células Nanos1+ se muestran en E y E', respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición de diferentes reacciones de PCR y tampones en este protocolo. Para calcular el volumen del producto de PCR (X μL) en la reacción de ligadura, ver la nota después del paso 1.4 del protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Las células proliferantes y las células madre son fuentes celulares importantes en diversos procesos como la morfogénesis, el crecimiento y la regeneración21,22. Este artículo describe un método para teñir conjuntamente el marcador de células madre Nanos1 mediante el etiquetado de FISH y EdU en Cladonema medusae. Trabajos previos utilizando el etiquetado de EdU o BrdU han sugerido que las células proliferativas se localizan en los bulbos del tentáculo16,17, pero sus características moleculares no estaban claras. El presente estudio muestra la determinación simultánea de la distribución de células proliferativas y la localización de células madre similares a Nanos1+ (Figura 4). Los resultados mostraron que algunas células proliferativas expresaban Nanos1, pero otras células estaban marcadas solo con EdU y no expresaban Nanos1, lo que sugiere la existencia de heterogeneidad de células madre o, potencialmente, de otras células proliferativas. Será interesante diseccionar la distribución detallada de células madre durante diferentes procesos en Cladonema, incluida la ramificación de tentáculos, la homeostasis tisular, la regeneración de órganos y el mantenimiento de células germinales.

El principal cuello de botella para visualizar las células madre en animales es la identificación inicial de los marcadores de células madre. En los cnidarios, los marcadores de células madre no se han identificado en los no hidrozoos3, y por lo tanto, en esta etapa, la aplicación directa de FISH para marcadores de células madre permanece limitada a los hidrozoos. Sin embargo, FISH permite la detección de la expresión génica específica a nivel celular y, por lo tanto, al cambiar las sondas, este método puede extenderse para observar los patrones de expresión espacial de cualquier gen de interés en detalle. Por ejemplo, utilizando marcadores de células progenitoras y células diferenciadas, podemos verificar la distribución de tipos específicos de células en los tentáculos de Cladonema. Como advertencia, el protocolo actual puede tener que ser modificado dependiendo de los genes de interés debido a las diferencias en los niveles de expresión y la estabilidad del ARNm. En particular, las señales no específicas y las señales débiles son problemas comunes asociados con FISH. Cambiar el tiempo y la temperatura de hibridación, utilizando reactivos blanqueadores (formamida o metanol) y ajustar otros parámetros (tiempo de reacción TSA, tratamiento con proteinasa K, lavado después de la hibridación) puede producir señales más claras y menos señales inespecíficas23,24. También es importante seleccionar un protocolo FISH apropiado para el modelo animal que se está utilizando, ya que un protocolo FISH puede no ser aplicable a otras especies, incluso dentro del mismo taxón 7,25,26.

El etiquetado de EdU se utiliza generalmente para detectar células proliferativas, pero podría utilizarse para diferentes fines experimentales variando la concentración y el tiempo de incubación27. Para detectar células en proliferación, es fundamental determinar una duración y concentración exitosas para la incorporación de EdU. En el marcaje de pulso utilizado en este trabajo, solo se marcaron células proliferativas que pasaron por la fase S durante un corto período de tiempo, y se han utilizado métodos similares de incubación corta para detectar células proliferantes en otros cnidarios 6,28,29. Por el contrario, la combinación de la incorporación prolongada de EdU y Nanos1 FISH puede revelar la presencia de células madre de ciclo lento o quiescentes27. También es posible marcar no solo las células proliferativas sino también las células endocíclicas que han sufrido la síntesis de ADN sin división. Además, mediante el seguimiento de las células marcadas con EdU durante más tiempo, podemos determinar la capacidad celular de migración y diferenciación asociada con las células proliferativas y su linaje celular 6,30.

Si bien se ha utilizado la combinación de FISH y tinción EdU o BrdU 7,31, el método establecido aquí se puede aplicar fácilmente a otros invertebrados marinos y animales no modelo, incluidas diferentes especies de medusas. La tinción de EdU es más simple y sensible que la tinción de BrdU18, y con su corto tiempo de incubación, permite la detección de células en proliferación, a diferencia del estudio anterior que utilizó EdU para el etiquetado celular a largo plazo7. En los últimos años, con el avance de las tecnologías de secuenciación de próxima generación, la información sobre el genoma y la expresión génica está disponible para muchas especies. La identificación de células madre y células proliferativas seguirá siendo un enfoque eficaz para comprender la heterogeneidad y diversidad de las células madre y proporcionar información sobre la dinámica celular subyacente a los diferentes fenómenos biológicos.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por AMED bajo el número de subvención JP22gm6110025 (a Y.N.) y por el número de subvención JSPS KAKENHI 22H02762 (a Y.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

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References

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Developmental Biology FISH EdU medusa medusa Cladonema pacificum células madre proliferación celular
Hibridación <em>fluorescente in situ</em> y etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria <em>Cladonema pacificum</em>
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Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., … More

Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. i. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

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