Summary
Här beskriver vi ett protokoll för visualisering av stamliknande prolifererande celler i maneten Cladonema. Helmonterad fluorescerande in situ-hybridisering med en stamcellsmarkör möjliggör detektering av stamliknande celler, och 5-etynyl-2'-deoxiuridinmärkning möjliggör identifiering av prolifererande celler. Tillsammans kan aktivt prolifererande stamliknande celler detekteras.
Abstract
Cnidarians, inklusive havsanemoner, koraller och maneter, uppvisar olika morfologi och livsstilar som manifesteras i sessila polyper och frisimmande medusae. Som exemplifieras i etablerade modeller som Hydra och Nematostella bidrar stamceller och/eller proliferativa celler till utveckling och regenerering av cnidariska polyper. De underliggande cellulära mekanismerna i de flesta maneter, särskilt i medusastadiet, är dock till stor del oklara, och därför är det viktigt att utveckla en robust metod för att identifiera specifika celltyper. Detta dokument beskriver ett protokoll för visualisering av stamliknande prolifererande celler i hydrozoan maneter Cladonema pacificum. Cladonema medusae har grenade tentakler som kontinuerligt växer och upprätthåller regenerativ kapacitet under hela sitt vuxna stadium, vilket ger en unik plattform för att studera de cellulära mekanismerna som orkestreras av prolifererande och / eller stamliknande celler. Helmonterad fluorescerande in situ-hybridisering (FISH) med hjälp av en stamcellsmarkör möjliggör detektering av stamliknande celler, medan pulsmärkning med 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU), en S-fasmarkör, möjliggör identifiering av prolifererande celler. Genom att kombinera både FISH- och EdU-märkning kan vi upptäcka aktivt prolifererande stamliknande celler på fasta djur, och denna teknik kan tillämpas brett på andra djur, inklusive maneter som inte är modeller.
Introduction
Cnidaria anses vara en basalt förgrenande metazoisk fylum som innehåller djur med nerver och muskler, vilket placerar dem i en unik position för att förstå utvecklingen av djurutveckling och fysiologi 1,2. Cnidarians kategoriseras i två huvudgrupper: Anthozoa (t.ex. havsanemoner och koraller) har endast planulalarver och sessila polypstadier, medan Medusozoa (medlemmar av Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa och Cubozoa) vanligtvis har formen av frisimmande medusae eller maneter, liksom planula larver och polyper. Cnidarians uppvisar vanligtvis hög regenerativ kapacitet, och deras underliggande cellulära mekanismer, särskilt deras innehav av vuxna stamceller och proliferativa celler, har väckt stor uppmärksamhet 3,4. Ursprungligen identifierade i Hydra är hydrozoa stamceller belägna i de interstitiella utrymmena mellan ektodermala epitelceller och kallas vanligtvis interstitiella celler eller i-celler3.
Hydrozoa i-celler delar gemensamma egenskaper som inkluderar multipotens, uttryck av allmänt bevarade stamcellsmarkörer (t.ex. Nanos, Piwi, Vasa) och migrationspotential 3,5,6,7,8. Som funktionella stamceller är i-celler i stor utsträckning involverade i utveckling, fysiologi och miljörespons hos hydrozoa djur, vilket vittnar om deras höga regenerativa kapacitet och plasticitet3. Medan stamceller, som liknar i-celler, inte har identifierats utanför hydrozoer, även i den etablerade modellarten Nematostella, är proliferativa celler fortfarande involverade i underhåll och regenerering av somatisk vävnad, liksom bakterielinjen9. Eftersom studier i cnidarisk utveckling och regenerering huvudsakligen har utförts på polyp-typ djur som Hydra, Hydractinia och Nematostella, förblir den cellulära dynamiken och funktionerna hos stamceller i manetarter i stort sett oadresserade.
Den hydrozoiska maneten Clytia hemisphaerica , en kosmopolitisk manetart med olika livsmiljöer runt om i världen, inklusive Medelhavet och Nordamerika, har använts som ett experimentellt modelldjur i flera utvecklings- och evolutionära studier10. Med sin lilla storlek, enkla hantering och stora ägg är Clytia lämplig för laboratorieunderhåll, liksom för introduktion av genetiska verktyg som de nyligen etablerade transgenes- och knockoutmetoderna11, vilket öppnar möjligheten för detaljerad analys av de cellulära och molekylära mekanismerna som ligger till grund för manetbiologi. I Clytia medusa-tentakeln är i-celler lokaliserade i den proximala regionen, kallad glödlampan, och förfäder som nematoblaster migrerar till den distala spetsen medan de differentieras till distinkta celltyper, inklusive nematocyter12.
Under regenerering av Clytia manubrium migrerar det orala organet av maneter, Nanos1+ i-celler som finns i gonaderna till regionen där manubriet går förlorat som svar på skador och deltar i regenereringen av manubrium7. Dessa fynd stöder tanken att i-celler i Clytia också beter sig som funktionella stamceller som är involverade i morfogenes och regenerering. Med tanke på att egenskaperna hos i-celler skiljer sig åt bland representativa polyp-typ djur såsom Hydra och Hydractinia3, är det möjligt att stamcellernas egenskaper och funktioner är diversifierade bland manetarter. Dessutom, med undantag för Clytia, har experimentella tekniker begränsats för andra maneter, och den detaljerade dynamiken hos proliferativa celler och stamceller är okänd13.
Den hydrozoa maneten Cladonema pacificum är en framväxande modellorganism som kan hållas i laboratoriemiljö utan vattenpump eller filtreringssystem. Cladonema medusa har grenade tentakler, en vanlig egenskap i familjen Cladonematidae, och ett fotoreceptororgan som kallas ocellus på det ektodermala skiktet nära glödlampan14. Tentakelförgreningsprocessen sker vid en ny förgreningsplats som visas längs tentakelns adaxiala sida. Med tiden fortsätter tentaklerna att förlängas och förgrena sig, med de äldre grenarna som skjuts ut mot spetsen15. Dessutom kan Cladonema-tentakler regenerera inom några dagar vid amputation. Nya studier har föreslagit rollen av prolifererande celler och stamliknande celler i tentakelförgrening och regenerering i Cladonema16,17. Men medan konventionell in situ-hybridisering (ISH) har använts för att visualisera genuttryck i Cladonema, på grund av dess låga upplösning, är det för närvarande svårt att observera stamcellsdynamik på cellnivå i detalj.
Denna artikel beskriver en metod för att visualisera stamliknande celler i Cladonema av FISH och samfärgning med EdU, en markör för cellproliferation18. Vi visualiserar uttrycksmönstret för Nanos1, en stamcellsmarkör 5,17, av FISH, vilket möjliggör identifiering av stamliknande cellfördelning på encellsnivå. Dessutom gör samfärgningen av Nanos1-uttryck med EdU-märkning det möjligt att skilja aktivt prolifererande stamliknande celler. Denna metod för övervakning av både stamliknande celler och proliferativa celler kan tillämpas på ett brett spektrum av undersökningsområden, inklusive tentakelförgrening, vävnadshomeostas och organregenerering i Cladonema, och ett liknande tillvägagångssätt kan tillämpas på andra manetarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialförteckningen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och utrustning som används i detta protokoll.
1. Sondsyntes
- RNA-extraktion
- Placera tre levande Cladonema medusae som odlas i konstgjort havsvatten (ASW) i ett 1,5 ml rör med en 3,1 ml överföringspipett med spetsen avskuren och ta bort så mycket ASW som möjligt.
OBS: ASW framställs genom att lösa en blandning av mineralsalter i kranvatten med klorneutralisator; den slutliga specifika vikten (SG) är 1,018 eller delarna per tusen (ppt) är ~ 27. - Frys 1,5 ml rören i flytande kväve för att hämma RNas-aktiviteten. Tillsätt 30 μl lysbuffert från den totala RNA-isoleringssatsen i vilken 2-merkaptoetanol (1 μl/100 μl lysbuffert) har tillsatts och homogenisera proverna i lysbufferten med hjälp av en homogenisator.
OBS: För att undvika överflöde av bufferten och provet från rören rekommenderas homogenisering med en liten mängd lysbuffert. - Tillsätt 570 μL lysbuffert och extrahera det totala RNA enligt protokollet för den totala RNA-isoleringssatsen (figur 1).
- Mät koncentrationen av det extraherade RNA med hjälp av en spektrofotometer och förvara vid −80 °C tills det används.
- Placera tre levande Cladonema medusae som odlas i konstgjort havsvatten (ASW) i ett 1,5 ml rör med en 3,1 ml överföringspipett med spetsen avskuren och ta bort så mycket ASW som möjligt.
- cDNA-syntes
- Använd ett kit, syntetisera cDNA med hjälp av det totala RNA som extraherats från medusa som en mall (figur 1 och tabell 1).
- Inkubera vid 65 °C i 5 minuter.
- Kyl snabbt på is.
- Utför cDNA-syntes med blandningen från steg 1.2.1 (tabell 1). Blanda noggrant genom pipettering och inkubera vid 42 °C i 60 minuter.
- Inkubera vid 95 °C i 5 minuter.
- Kyl snabbt på is.
- Mät koncentrationen av det syntetiserade cDNA med hjälp av en spektrofotometer och förvara vid eller under −20 °C tills det används.
- PCR-produktsyntes
- För att skapa en PCR-mall, designa den specifika primern med Primer-BLAST. Hämta referenssekvensen från NCBI-data eller RNA-seq-data.
OBS: Se materialförteckningen för de primers som används i detta protokoll. - För att förstärka målsekvensen, utför TA-kloning, vilket inte kräver användning av restriktionsenzymer. För att få en PCR-produkt i vilken en adenin tillsätts i slutet av 3', använd följande inställningar: 98 °C i 2 minuter; 35 cykler med 98 °C i 10 s, 55–60 °C i 30 s, 72 °C i 1 min.
OBS: För att bestämma PCR-förhållandena, följ protokollet som följer med DNA-polymeraset som ska användas, vilket i allmänhet ger en rekommenderad glödgningstemperatur och förlängningstid. - Kör PCR-produkten genom en 1% agarosgel och skär ut intressebandet. Extrahera PCR-produkterna från de skurna gelerna med hjälp av ett gelextraktionssats.
- För att skapa en PCR-mall, designa den specifika primern med Primer-BLAST. Hämta referenssekvensen från NCBI-data eller RNA-seq-data.
- Ligatur
- Ligera PCR-produkten till vektorn med 3' tyminöverhäng genom att blanda reagenserna (tabell 1) och inkubera vid 37 °C i 30 minuter (figur 1).
OBS: Det molekylära förhållandet mellan vektor: PCR bör vara 1: > 3. PTA2-vektorstorleken är ungefär 3 kb. Om PCR-produkten (insats) är A (kb) och B (ng/μL) kan volymen för det införda materialet (X i tabell 1) som ska tas beräknas med ([50 ng vektor × A kb insats])/(3 kb vektor × [ 1/3]) = 50· En ng av insats. Om koncentrationen av insatsen är B ng / μL, är volymen 50 · A/B μL för insatsen.
- Ligera PCR-produkten till vektorn med 3' tyminöverhäng genom att blanda reagenserna (tabell 1) och inkubera vid 37 °C i 30 minuter (figur 1).
- Transformation och plätering
- För transformation, tina de kompetenta cellerna på is och fördela dem i 20 μL alikvoter vardera. Tillsätt 1 μl av plasmiderna som innehåller PCR-produkten (mindre än 5% av den kompetenta cellvolymen) och virvel i 1 s. Inkubera på is i 5 minuter och inkubera sedan vid 42 °C i 45 s och virvel i 1 s.
- Tillsätt 180 μL superoptimal buljong med katabolitförtryck (SOC) medium (ett näringsrikt bakterieodlingsmedium) till de kompetenta cellerna och inkubera vid 37 °C i 30 minuter. Efter 30 minuter sprider du de kompetenta cellerna på en agarplatta som innehåller ampicillin, 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D-galakto-pyranosid (X-gal) och isopropyl-β-d-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) och inkuberar vid 37 °C i 12-16 timmar (figur 1).
OBS: X-gal och IPTG används för att välja blå och vita kolonier.
- Flytande kultur
- Välj en vit koloni ur de vita och blå kolonierna på tallriken. Tillsätt det till 3-5 ml LB-medium med ampicillin och inkubera på en shaker i 12-16 timmar vid 37 °C (figur 1).
- Miniprep
- Extrahera plasmiden från LB-mediet med hjälp av en plasmid miniprep (figur 1).
- Kvantifiera plasmidkoncentrationen med hjälp av en spektrofotometer.
- Läs sekvensen.
- För att läsa DNA-sekvensen för plasmiden, skicka plasmiden för Sanger-sekvensering och använd sedan programvara för att anpassa den till genom- / transkriptomsekvensen för att bekräfta om målsekvensen är korrekt syntetiserad och bedöma i vilken riktning målsekvensen sätts in i plasmiden (5 'till 3' eller 3' till 5').
OBS: Om målsekvensen sätts in i plasmiden i 5'till 3'-riktningen från RNA-polymerasbindningsstället nära 3'-änden, kan en antisense-sond genereras genom in vitro-transkription. Om målsekvensen sätts in i omvänd riktning från 3' till 5' kan en sense-sond (negativ kontroll) genereras. Om du använder vektorer som pTA2 kan två transkriptionsbindningsställen användas beroende på syftet.
- För att läsa DNA-sekvensen för plasmiden, skicka plasmiden för Sanger-sekvensering och använd sedan programvara för att anpassa den till genom- / transkriptomsekvensen för att bekräfta om målsekvensen är korrekt syntetiserad och bedöma i vilken riktning målsekvensen sätts in i plasmiden (5 'till 3' eller 3' till 5').
- In vitro-transkription
- Förbered DNA-mallen från den skapade plasmiden genom att utföra PCR med hjälp av primers utanför RNA-polymerasbindningsstället (t.ex. T7/T3-bindningsställen) i plasmiden (figur 1).
OBS: Universella primers som M13-20 framåtprimer och M13 omvänd primer kan användas för att förbereda en DNA-mall som inkluderar RNA-polymerasbindningsställen. - Rena mallen efter PCR-förstärkning med hjälp av en gel / PCR-extraktionssats.
- Blanda reagenserna nedan och utför transkriptionsreaktionen vid 37 °C i 3 timmar (figur 1 och tabell 1).
- Tillsätt 1,5 μl DNase och inkubera vid 37 °C i 30 minuter.
- Tillsätt 10 μl RNasfritt vatten och rena sonden från transkriptionsreaktionslösningen med hjälp av en rengöringskolonn.
- Kontrollera storleken på det syntetiserade RNA genom att ladda 1 μL på en 1% agarosgel och bestäm koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer.
OBS: Syntetiserade RNA-sonder bör ha en koncentration på minst 100 ng / μl. - Tillsätt 30 μl formamid för förvaring vid eller under −20 °C.
- Förbered DNA-mallen från den skapade plasmiden genom att utföra PCR med hjälp av primers utanför RNA-polymerasbindningsstället (t.ex. T7/T3-bindningsställen) i plasmiden (figur 1).
2. EdU-inkorporering och fixering
- Placera Cladonema medusae (5-10 djur per rör) i 1,5 ml rör med en 3,5 ml överföringspipett och tillsätt ASW upp till en total volym på 500 μl. Tillsätt 7,5 μl 10 mM EdU stamlösning och inkubera proverna i 1 timme vid 22 °C (figur 2). Den slutliga koncentrationen av EdU är 150 μM.
OBS: Använd 5-7 dagar gamla medusae för att övervaka tredje grenbildning (figur 3A). Dagen då medusan lossnar från polypen räknas som dag 1, och på dag 5 börjar medusae vanligtvis uppvisa en tredje gren på sina huvudtentakler. - Efter 1 h, ta bort så mycket ASW som innehåller EdU som möjligt.
- För att bedöva medusorna, tillsätt 7% MgCl2 iH2O och inkubera i 5min.
- Ta bort 7 % MgCl2 iH2Ooch fixera medusorna över natten (O.N.) vid 4 °C med 4 % paraformaldehyd (PFA) i ASW (figur 2).
OBS: Vid utförande av FISH utan EdU-inkorporering kan prover fixeras på samma sätt som de som behandlas med EdU efter bedövning (steg 2.3-2.4).
3. Fluorescerande in situ hybridisering
- Proteinasbehandling och postfixering
- Ta bort PFA och tvätta proverna med PBS som innehåller 0,1% Tween-20 (PBST) i 3 x 10 min. Använd 300-500 μL PBST per tvätt.
OBS: Från detta steg till slutet av hybridiseringen bör experimentet utföras i en RNas-fri miljö, med handskar och en mask. 1x PBS i detta steg måste göras med DEPC-behandlat vatten. Efter hybridisering kan 1x PBS tillverkad med vatten utan DEPC-behandling användas. Vissa ISH- och FISH-protokoll dehydrerar prover med metanolsteg, vilket gör det möjligt att spara de fasta proverna vid −20 °C tills de används. För att undvika överflödigt arbete utelämnas uttorkningsprocessen från detta protokoll, särskilt eftersom proverna kan förvaras i PBST i upp till några dagar. - Efter fixering, placera provet i 1,5 ml rör på en skakapparat, med undantag för anti-DIG-POD-antikropp O.N. inkubationssteg (steg 3.4.2). Efter tvättning, tillsätt 10 mg/ml Proteinas K stamlösning i PBST och inkubera medusan med Proteinas K (slutlig koncentration: 10 μg/ml) vid 37 °C i 10 min.
- Ta bort Proteinas K-lösningen och tvätta proverna i 2 x 1 min med PBST.
- För att postfixera medusorna, tillsätt 4% PFA i 1x PBS och inkubera vid 37 ° C i 15 min.
- Ta bort PFA-lösningen och tvätta proverna i 2 x 10 min med PBST.
OBS: Om målgenen uttrycks starkt med låg bakgrundssignal kan steg 3.1.2-3.1.5 hoppas över.
- Ta bort PFA och tvätta proverna med PBS som innehåller 0,1% Tween-20 (PBST) i 3 x 10 min. Använd 300-500 μL PBST per tvätt.
- Hybridisering
- Ta bort PBST och lägg till hybridiseringsbuffert (HB-buffert, tabell 1). Inkubera proverna i HB-buffert i 15 minuter vid rumstemperatur (RT). Använd 300-400 μL HB-buffert, vilket ger tillräckligt med volym för framgångsrik hybridisering.
OBS: HB-buffert, tvättbuffert 1 och tvättbuffert 2 är förberedda med 20x SSC-lager. HB-bufferten lagras vid eller under −20 °C och måste föras till RT före användning. - Ta bort HB-bufferten och lägg till en ny HB-buffert. Prehybridisera vid 55 °C i minst 2 timmar i en hybridiseringsinkubator.
- Ta bort HB-bufferten och inkubera med HB-buffert som innehåller sonderna som lagrades i steg 1.9.7 (slutlig sondkoncentration: 0,5–1 ng/μl i HB-buffert). Hybridisera vid 55 °C i 18-24 timmar (figur 2) i en hybridiseringsinkubator.
OBS: FISH-signalintensitet och specificitet kan variera beroende på målgenuttryck, såväl som sondlängd och specificitet. För att öka intensiteten kan parametrar som hybridiseringsvaraktighet (18-72 h) och temperatur (50-65 °C) justeras och olika sonder kan testas. För att undvika ospecifika signaler kan Proteinas K-behandling (koncentration och varaktighet) modifieras19.
- Ta bort PBST och lägg till hybridiseringsbuffert (HB-buffert, tabell 1). Inkubera proverna i HB-buffert i 15 minuter vid rumstemperatur (RT). Använd 300-400 μL HB-buffert, vilket ger tillräckligt med volym för framgångsrik hybridisering.
- Borttagning av sond
- Ta bort HB-bufferten som innehåller sonder och lägg sedan till tvättbuffert 1 (tabell 1). Tvätta proverna med tvättbuffert 1 i 2 x 15 min vid 55 °C. Använd 300-400 μL tvättbuffert.
HB-buffert som innehåller sonder kan användas upprepade gånger, upp till cirka tio gånger. I stället för att kasta den, förvara den använda HB-bufferten som innehåller sonder vid eller under −20 °C. Förvärm tvättbuffert 1, tvättbuffert 2, 2x SSC och PBST vid 55 °C före användning. - Ta bort tvättbuffert 1 och lägg sedan till tvättbuffert 2 (tabell 1). Tvätta proverna med tvättbuffert 2 i 2 x 15 min vid 55 °C.
- Ta bort Wash Buffer 2 och lägg sedan till 2x SSC. Tvätta proverna med 2x SSC i 2 x 15 min vid 55 °C.
- Ta bort 2x SSC och lägg sedan till förvärmd PBST. Tvätta proverna i 1 x 15 min med PBST vid RT.
- Ta bort HB-bufferten som innehåller sonder och lägg sedan till tvättbuffert 1 (tabell 1). Tvätta proverna med tvättbuffert 1 i 2 x 15 min vid 55 °C. Använd 300-400 μL tvättbuffert.
- Anti-DIG antikropp inkubation
- Ta bort PBST och lägg sedan till 1% blockerande buffert. Inkubera proverna i minst 1 timme vid RT medan du skakar långsamt på en vippa.
OBS: Förbered 1% blockerande buffert nyligen genom att späda ut 5% blockerande buffertlager (tabell 1). Kontrollera proverna före nästa antikroppsreaktion eftersom provet tenderar att fastna på baksidan av locket eller väggen som ett resultat av skakning. - Efter blockering, ta bort 1% blockerande buffert, tillsätt anti-DIG-POD-lösning (1:500, i 1% blockerande buffert) och inkubera proverna O.N. vid 4 °C (figur 2).
OBS: Var noga med att hålla inkubationstiden inom 12-16 h för att förhindra detektering av icke-specifika signaler.
- Ta bort PBST och lägg sedan till 1% blockerande buffert. Inkubera proverna i minst 1 timme vid RT medan du skakar långsamt på en vippa.
- Detektion av DIG-märkt sond
- Ta bort anti-DIG-POD-lösningen och lägg sedan till Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, tabell 1). Tvätta proverna med TNT i 3 x 10 min vid RT.
OBS: Användningen av tyramidsignalförstärkningstekniken (TSA) ger en bättre upplösningsbild mot pepparrotsperoxidasmärkta reagenser (t.ex. anti-DIG-POD). - Späd fluorescerande färgämneskonjugerad tyramid (Cy5-tyramid) stamlösning (1:50) i amplifieringsutspädningsbufferten för att göra den aktiva cy5-tyramidlösningen (figur 2).
- Ta bort så mycket TNT som möjligt och tillsätt sedan den aktiva Cy5-tyramidlösningen. Inkubera proverna i 10 minuter i mörkret.
- Tvätta proverna med PBST i 3 x 10 min i mörker.
- Ta bort anti-DIG-POD-lösningen och lägg sedan till Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, tabell 1). Tvätta proverna med TNT i 3 x 10 min vid RT.
- Detektion av EdU
OBS: EdU-satsen detekterar införlivad EdU som fluorescerande signaler (figur 2).- Förbered EdU-detektionscocktailen genom att blanda komponenterna enligt tabell 1. Använd 100 μL EdU-detektionscocktail för varje prov.
OBS: Förbered 1x reaktionsbuffertadditiv genom att späda 10x reaktionsbuffertadditiv med ultrarent vatten. - Ta bort PBST och lägg sedan till EdU-detekteringscocktailen. Inkubera i mörkret i 30 min.
- Tvätta med PBST i 3 x 10 min i mörker.
- Förbered EdU-detektionscocktailen genom att blanda komponenterna enligt tabell 1. Använd 100 μL EdU-detektionscocktail för varje prov.
- DNA-färgning
- Späd Hoechst 33342 (1:500) i PBST för beredning av Hoechst-lösningen. Ta bort PBST och lägg sedan till Hoechst-lösningen. Inkubera proverna i 30 minuter i mörker (figur 2).
- Tvätta proverna med PBST i 3-4 x 10 min i mörkret.
- Beslag
- Gör en bank på glasskivan för att förhindra att provet krossas. Applicera vinyltejp på glasskivan och ihåliga ut i mitten.
- Överför medusae till banken på glidglaset med en 3,1 ml överföringspipett med spetsen avskuren.
OBS: Var försiktig så att du inte låter tentaklerna överlappa varandra. - Ta bort eventuell PBST med en P200-pipett och tillsätt sedan långsamt 70% glycerol som monteringsmedium (figur 2).
OBS: Istället för 70% glycerol kan anti-fading monteringsmedium användas för att förhindra att fluorescensen bleknar. - Placera försiktigt en täckglas på medusae med pincett och försegla sidan av täckglaset med klart nagellack.
- Håll bilderna vid 4 °C i mörker om du inte omedelbart utför mikroskopiobservation.
- Imaging
- Använd ett konfokalmikroskop för laserskanning för att hämta bilder. För encellsupplösning, använd en 40x oljelins eller en lins för högre förstoring.
- Efter bildförvärv öppnar du bilderna med ImageJ/FIJI-programvaran och räknar celler som är positiva för EdU+ och/eller Nanos1+ med multipunktverktyget20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cladonema tentakler har använts som modell för att studera de cellulära processerna för morfogenes och regenerering15,16,17. Tentakelstrukturen består av ett epitelrör där stamliknande celler, eller i-celler, är belägna i den proximala regionen, kallad tentakellampan, och nya grenar läggs sekventiellt till baksidan av lampans distala region längs den adaxiella sidan (figur 3A)15. Tidigare rapporter har indikerat att cellproliferation är aktiv både i tentakellampan och vid de nya förgreningsställena med antingen EdU- eller BrdU-märkning16,17. På grund av upplösningen av in situ-hybridisering är det dock oklart om stamliknande celler verkligen är proliferativa eller inte. För att visualisera både stamliknande och proliferativa celler samtidigt på cellnivå utförde vi FISH för stamcellsmarkörer (Nanos1 eller Piwi) och EdU-märkning för S-fasceller i samma prover.
Vid cellulär upplösning av FISH lokaliserades uttrycket av Nanos1 vid tentakellampan och den nya förgreningsplatsen (figur 3B). Piwi uttrycktes också i tentakellampan och på den nya förgreningsplatsen i ett mönster som liknar nanos1 (figur 3C). Dessa resultat överensstämde med observationerna från helmonterad in situ-hybridisering i en tidigare rapport17, där den spirande grenen av en 7 dagar gammal medusa nästan enhetligt märktes av Nanos1 och Piwi. För att visualisera början av ackumuleringen av stamliknande celler övervakade vi den nya förgreningsplatsen för en 5 dagar gammal medusa. Sammärkningen av Nanos1-uttryck och EdU-positiva celler avslöjade det rumsliga mönstret av stamliknande celler och proliferativa celler i tentakeln (figur 4A). Även om bruttofördelningarna av EdU + och Nanos1 + -celler överensstämde med tidigare rapporter16,17, var EdU + -celler mer utbredda över tentakellampan, åtminstone i början av förgreningen, medan Nanos1 + -celler ackumulerades mer lokalt vid tentakellampan och den nya förgreningsplatsen (Figur 4A och Figur 4E ). Dessa observationer tyder på att distinkta fördelningar av stamliknande celler och prolifererande celler detekteras beroende på utvecklingstidpunkten och olika stadier.
En mer detaljerad bild av glödlampan och den nya förgreningsplatsen avslöjade att EdU-signaler smälter samman med kärnfärgning, medan Nanos1-uttrycket är begränsat till cytoplasman som omger kärnan, i överensstämmelse med en tidigare rapport5 (figur 4B, C). En bråkdel (19,79%) av cellerna uppvisade sammärkning av EdU och Nanos1 (EdU + Nanos1 +; Figur 4B,C, gula pilspetsar och figur 4D), vilket tyder på att dessa celler är en aktivt förökande stamcellspopulation. Intressant nog befanns 14,46% av cellerna vara EdU + Nanos1 - i mitten av glödlampan och vid den nya förgreningsplatsen, vilket tyder på närvaron av icke-stamliknande proliferativa celler (figur 4B, C, vita pilar och figur 4D). Däremot observerades 26,32% av cellerna vara EdU- Nanos1+ vid basen av glödlampan och vid den nya förgreningsplatsen, vilket indikerar närvaron av en stamcellspopulation som antingen är långsam cykling eller vilande, varav ingen detekteras av EdU-pulsmärkning (figur 4B, C, gula pilar och figur 4D).
Figur 1: Schema för sondsyntesen för in situ-hybridisering. Extraktion av totalt RNA från medusae och cDNA-syntes från totalt RNA. Nanos1-specifika PCR-produkter syntetiserades från cDNA. PCR-produkterna ligerades i vektorerna och förstärkta vektorer samlades in genom kompetent cellodling. PCR-produkterna med RNA-polymerasbindningsställen syntetiserades med hjälp av plasmiderna som mallar. DIG-märkta RNA-sonder syntetiserades genom in vitro-transkription. Förkortningar: DIG = digoxigenin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schema för EdU och fluorescerande in situ hybridisering samfärgning. Medusae inkuberades med 150 μM EdU i 1 h. Därefter bedövades medusorna (för att slappna av vävnaden) med 7% MgCl2i H2Ooch fixerades med 4% PFA O.N. vid 4 °C. Efter fixering hybridiserades proverna med HB-buffert med en sond i 20-24 timmar vid 55 °C. Efter hybridiseringsreaktionen tvättades proverna och inkuberades med anti-DIG-POD-lösning O.N. vid 4 °C. Medusan färgades med Cy5-tyramidlösning i 10 minuter, följt av detektion av EdU i 30 min och färgning med Hoechst 33342 i 30 min. Efter att ha slutfört alla färgningsprocesser monterades medusan på glasskivan och bilder erhölls med ett konfokalmikroskop. Förkortningar: EdU = 5-etynyl-2'-deoxiuridin; FISH = fluorescerande in situ hybridisering; PFA = paraformaldehyd; O.N. = över natten; HB = hybridisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Nanos1 och Piwi uttrycksmönster på den proximala adaxiala sidan av Cladonema medusa-tentakeln. (A) Schematisk över en Cladonema medusa och tentakel. Tentaklets adaxiala sida: tentakellampan (den mest proximala regionen) med nya grenar som bildas i följd på den nya förgreningsplatsen. Indraget (streckad fyrkant) anger det område som fångats av konfokalbilden. (B) FISH-bilder av Nanos1-genuttryck från den proximala, adaxiella sidan av tentakeln hos en 7 dagar gammal Cladonema medusa. (C) FISH-bilder av Piwi-genuttryck från den proximala, adaxiella sidan av tentakeln hos en 7 dagar gammal Cladonema medusa. DNA: grön, Nanos1: magenta. B'-C' för Nanos1 FISH endast bilder. Skalstänger = 100 μm (B,C). Förkortning: FISH = fluorescerande in situ hybridisering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: EdU- och Nanos1-uttrycksmönster på den proximala, adaxiella sidan av Cladonema medusa-tentakeln. (A-C) Bilder av den proximala adaxialsidan av Cladonema medusa-tentakeln märkt med Nanos1-uttryck och EdU; 5 dagar gamla medusae användes. (A) En översikt över tentakeln. Gula streckade rutor indikerar områdena B och C. (B) Förstoring av tentakellampan. (C) Förstoring av en ny förgreningsplats. Gula pilspetsar indikerar de celler som är positiva för både EdU och Nanos1. Gula pilar indikerar de celler som bara är positiva för Nanos1. Vita pilar indikerar celler som endast är positiva för EdU. A-C-paneler är sammanslagna bilder för DNA (blå), EdU (grön) och Nanos1 (magenta). A'-C' är paneler för endast EdU-bilder; A''-C'' är endast för Nanos1 FISH-bilder. Skalstänger = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) Kvantifiering av EdU- och/eller Nanos1-positiva celler i tentakelns basala sida (kvantifieringsarea = 30,10 μm2 kvadrat, n = 6, totalt 249 celler). EdU+ Nanos1− celler, 14,46%; EdU + Nanos1 + celler, 19,79%; EdU− Nanos1+ celler, 26,32%; EdU- Nanos1- celler, 39,44%. (E) Schematisk av en Cladonema medusa-tentakel från adaxialsidan. Den totala fördelningen av EdU+-celler och Nanos1+-celler visas i E respektive E'. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Sammansättning av olika PCR-reaktioner och buffertar i detta protokoll. För att beräkna volymen av PCR-produkten (X μL) i ligeringsreaktionen, se anteckningen efter protokoll steg 1.4. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prolifererande celler och stamceller är viktiga cellulära källor i olika processer såsom morfogenes, tillväxt och regenerering21,22. Denna artikel beskriver en metod för att samfärga stamcellsmarkören Nanos1 med FISH och EdU-märkning i Cladonema medusae. Tidigare arbete med EdU- eller BrdU-märkning har föreslagit att proliferativa celler lokaliseras till tentakellökarna16,17, men deras molekylära egenskaper var oklara. Den aktuella studien visar samtidig bestämning av fördelningen av proliferativa celler och lokaliseringen av Nanos1+ stamliknande celler (figur 4). Resultaten visade att vissa proliferativa celler uttryckte Nanos1, men andra celler märktes endast med EdU och uttryckte inte Nanos1, vilket tyder på förekomsten av stamcellsheterogenitet eller, potentiellt, av andra proliferativa celler. Det kommer att vara intressant att dissekera den detaljerade stamcellsfördelningen under olika processer i Cladonema, inklusive tentakelförgrening, vävnadshomeostas, organregenerering och underhåll av könsceller.
Den största flaskhalsen för att visualisera stamceller hos djur är den första identifieringen av stamcellsmarkörer. Hos cnidarians har stamcellsmarkörer inte identifierats i icke-hydrozoer3, och därför är den direkta tillämpningen av FISH för stamcellsmarkörer i detta skede begränsad till hydrozoer. Ändå möjliggör FISH detektion av specifikt genuttryck på cellulär nivå, och genom att ändra sonder kan denna metod utvidgas för att observera de rumsliga uttrycksmönstren för alla gener av intresse i detalj. Med hjälp av markörer av stamceller och differentierade celler kan vi till exempel verifiera fördelningen av specifika celltyper i Cladonema-tentaklerna. Som en varning kan det nuvarande protokollet behöva modifieras beroende på generna av intresse på grund av skillnader i uttrycksnivåer och mRNA-stabilitet. I synnerhet är ospecifika signaler och svaga signaler vanliga problem i samband med FISH. Att ändra hybridiseringstid och temperatur med blekningsreagens (formamid eller metanol) och justera andra parametrar (TSA-reaktionstid, Proteinas K-behandling, tvättning efter hybridisering) kan ge tydligare signaler och färre ospecifika signaler23,24. Det är också viktigt att välja ett FISH-protokoll som är lämpligt för den djurmodell som används, eftersom ett FISH-protokoll kanske inte är tillämpligt på andra arter, inte ens inom samma taxon 7,25,26.
EdU-märkning används vanligtvis för att detektera proliferativa celler men kan användas för olika experimentella ändamål genom att variera koncentrationen och inkubationstiden27. För att upptäcka prolifererande celler är det viktigt att bestämma en framgångsrik varaktighet och koncentration för EdU-införlivande. I pulsmärkningen som användes i detta arbete markerades endast proliferativa celler som passerade genom S-fas under en kort tidsperiod, och liknande korta inkubationsmetoder har använts för att detektera prolifererande celler i andra cnidarians 6,28,29. Däremot kan kombinationen av långvarig EdU-inkorporering och Nanos1 FISH avslöja förekomsten av långsamma eller vilande stamceller27. Det är också möjligt att markera inte bara proliferativa celler utan även endocyklingsceller som har genomgått DNA-syntes utan uppdelning. Genom att spåra EdU-märkta celler under en längre tid kan vi dessutom bestämma cellulär kapacitet för migration och differentiering associerad med proliferativa celler och deras cellinje 6,30.
Medan kombinationen av FISH och EdU- eller BrdU-färgning har använts 7,31, kan metoden som etablerats här enkelt tillämpas på andra marina ryggradslösa djur och icke-modelldjur, inklusive olika manetarter. EdU-färgning är enklare och känsligare än BrdU-färgning18, och med sin korta tidsinkubation möjliggör den detektering av prolifererande celler, till skillnad från den tidigare studien som använde EdU för långvarig cellmärkning7. Under de senaste åren, med utvecklingen av nästa generations sekvenseringsteknik, har genom- och genuttrycksinformation blivit tillgänglig för många arter. Att identifiera stamceller och proliferativa celler kommer att fortsätta att vara ett effektivt tillvägagångssätt för att förstå stamcellers heterogenitet och mångfald och ge insikter i den cellulära dynamiken som ligger till grund för olika biologiska fenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av AMED under bidragsnummer JP22gm6110025 (till Y.N.) och av JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (till Y.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
- Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
- Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
- Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
- Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
- David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
- Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
- Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
- Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
- Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
- Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
- Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
- Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
- Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
- Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
- Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z.
- Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
- Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
- He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
- Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
- Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
- Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
- Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
- Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).
