Summary
여기에서는 해파리 Cladonema에서 줄기 유사 증식 세포를 시각화하는 프로토콜을 설명합니다. 줄기 세포 마커를 사용한 전체 장착 형광 in situ 혼성화는 줄기 유사 세포의 검출을 가능하게 하고 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 표지는 증식하는 세포의 식별을 가능하게 합니다. 함께, 활발하게 증식하는 줄기 유사 세포를 검출 할 수 있습니다.
Abstract
말미잘, 산호, 해파리를 포함한 자포동물은 고착 폴립과 자유 수영 메두사에서 나타나는 다양한 형태와 생활 방식을 나타냅니다. 히드라 및 네마토스텔라와 같은 확립된 모델에서 예시된 바와 같이, 줄기 세포 및/또는 증식성 세포는 자포동물 폴립의 발달 및 재생에 기여한다. 그러나 대부분의 해파리, 특히 메두사 단계의 기본 세포 메커니즘은 대체로 불분명하므로 특정 세포 유형을 식별하기 위한 강력한 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 이 논문은 수중 동물 해파리 Cladonema pacificum에서 줄기 유사 증식 세포를 시각화하기위한 프로토콜을 설명합니다. Cladonema medusae는 성체 단계 내내 지속적으로 성장하고 재생 능력을 유지하는 분지 촉수를 가지고 있어 증식 및/또는 줄기 유사 세포에 의해 조정된 세포 메커니즘을 연구할 수 있는 고유한 플랫폼을 제공합니다. 줄기 세포 마커를 사용하는 전체 장착 형광 현장 혼성화(FISH)를 통해 줄기 유사 세포를 검출할 수 있으며, S상 마커인 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)을 사용한 펄스 라벨링은 증식하는 세포를 식별할 수 있습니다. FISH와 EdU 라벨링을 결합하여 고정 동물에서 활발하게 증식하는 줄기 유사 세포를 검출 할 수 있으며,이 기술은 비 모델 해파리 종을 포함한 다른 동물에 광범위하게 적용될 수 있습니다.
Introduction
Cnidaria는 신경과 근육을 가진 동물을 포함하는 기저 분기 후생 동물 문으로 간주되어 동물 발달 및 생리학 1,2의 진화를 이해할 수있는 독특한 위치에 배치합니다. Cnidarians는 두 가지 주요 그룹으로 분류됩니다 : Anthozoa (예 : 말미잘 및 산호)는 평면 유충과 고착 폴립 단계 만 가지고있는 반면, Medusozoa (Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa 및 Cubozoa의 구성원)는 일반적으로 자유 수영 메두사 또는 해파리뿐만 아니라 평면 유충 및 폴립의 형태를 취합니다. Cnidarians는 일반적으로 높은 재생 능력을 나타내며, 기본 세포 메커니즘, 특히 성체 줄기 세포와 증식 세포의 소유는 많은 관심을 끌었습니다 3,4. Hydra에서 처음 확인 된 수중 동물 줄기 세포는 외배엽 상피 세포 사이의 간질 공간에 위치하며 일반적으로 간질 세포 또는 i- 세포3라고합니다.
Hydrozoan i- 세포는 다 효능, 널리 보존 된 줄기 세포 마커 (예 : Nanos, Piwi, Vasa)의 발현 및 이동 잠재력 3,5,6,7,8을 포함하는 공통 특성을 공유합니다. 기능성 줄기 세포로서 i- 세포는 수생 동물의 발달, 생리학 및 환경 반응에 광범위하게 관여하며, 이는 높은 재생 능력과 가소성을 입증합니다3. i- 세포와 유사한 줄기 세포는 수생 동물 외부에서 확인되지 않았지만 확립 된 모델 종 인 Nematostella에서도 증식 세포는 여전히 체세포 및 생식 계통9의 유지 및 재생에 관여합니다. 자포동물 발달 및 재생에 대한 연구가 주로 히드라, 히드라티니아, 네마토스텔라와 같은 폴립형 동물에 대해 수행되었기 때문에 해파리 종에서 줄기세포의 세포 역학과 기능은 크게 다루어지지 않은 상태로 남아 있습니다.
지중해와 북미를 포함한 전 세계의 다양한 서식지를 가진 국제적인 해파리 종인 수중동물 해파리 Clytia hemisphaerica 는 여러 발달 및 진화 연구에서 실험 모델 동물로 활용되었습니다10. 작은 크기, 쉬운 취급 및 큰 알을 갖춘 Clytia 는 실험실 유지 관리뿐만 아니라 최근에 확립 된 형질 전환 및 녹아웃 방법11과 같은 유전 도구의 도입에 적합하여 해파리 생물학의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 자세한 분석 기회를 열어줍니다. Clytia medusa 촉수에서 i- 세포는 전구라고하는 근위 영역에 국한되며, 선충 세포와 같은 전구 세포는 선충 세포12를 포함한 별개의 세포 유형으로 분화하면서 말단부로 이동합니다.
해파리의 구강 기관인 Clytia manubrium을 재생하는 동안 생식선에 존재하는 Nanos1+ i-세포는 손상에 반응하여 제조소가 손실되는 영역으로 이동하여 제조7의 재생에 참여합니다. 이러한 발견은 Clytia의 i- 세포가 형태 형성 및 재생에 관여하는 기능적 줄기 세포로도 작용한다는 아이디어를 뒷받침합니다. 그러나 i-세포의 성질이 히드라(Hydra)와 히드라티니아(Hydractinia)3와 같은 대표적인 폴립형 동물마다 다르다는 점을 감안할 때, 줄기세포의 특성과 기능은 해파리 종에 따라 다양화될 가능성이 있다. 또한 Clytia를 제외하고 다른 해파리에 대한 실험 기술은 제한적이며 증식 세포와 줄기 세포의 상세한 역학은 알려져 있지 않습니다13.
수중 동물 해파리 Cladonema pacificum은 워터 펌프 나 여과 시스템없이 실험실 환경에 보관할 수있는 새로운 모델 유기체입니다. Cladonema medusa는 Cladonematidae 가족의 일반적인 특징 인 분지 촉수와 전구14 근처의 외배엽 층에 ocellus라고하는 광 수용체 기관을 가지고 있습니다. 촉수 분기 과정은 촉수의 축 방향 측면을 따라 나타나는 새로운 분기 부위에서 발생합니다. 시간이 지남에 따라 촉수는 계속 늘어나고 가지가 갈라지며 오래된 가지는 끝15쪽으로 밀려납니다. 또한 Cladonema 촉수는 절단 후 며칠 이내에 재생될 수 있습니다. 최근 연구는 Cladonema16,17에서 촉수 분기 및 재생에서 증식하는 세포와 줄기 유사 세포의 역할을 제안했습니다. 그러나 기존의 현장 혼성화(ISH)는 Cladonema에서 유전자 발현을 시각화하는 데 활용되었지만 해상도가 낮기 때문에 현재 세포 수준에서 줄기 세포 역학을 자세히 관찰하기가 어렵습니다.
이 논문은 FISH에 의해 Cladonema에서 줄기 유사 세포를 시각화하고 세포 증식 마커 인 EdU와 공동 염색하는 방법을 설명합니다18. 우리는 FISH에 의해 줄기 세포 마커 인 Nanos1,17의 발현 패턴을 시각화하여 단일 세포 수준에서 줄기 유사 세포 분포를 식별 할 수 있습니다. 또한, Nanos1 발현과 EdU 표지의 동시 염색은 활발하게 증식하는 줄기 유사 세포를 구별하는 것을 가능하게 한다. 줄기 유사 세포와 증식 세포를 모두 모니터링하기 위한 이 방법은 Cladonema의 촉수 분지, 조직 항상성 및 장기 재생을 포함한 광범위한 조사 영역에 적용될 수 있으며 유사한 접근 방식을 다른 해파리 종에도 적용할 수 있습니다.
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Protocol
알림: 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 프로브 합성
- RNA 추출
- 인공 해수(ASW)에서 배양된 살아있는 클라도네마 메두사 3개를 팁이 잘린 상태에서 3.1mL 전달 피펫을 사용하여 1.5mL 튜브에 넣고 가능한 한 많은 ASW를 제거합니다.
알림: ASW는 수돗물에 미네랄 염의 혼합물을 염소 중화제로 용해시켜 준비됩니다. 최종 비중(SG)은 1.018이거나 천분율(ppt)은 ~27입니다. - RNase 활성을 억제하기 위해 액체 질소에 1.5mL 튜브를 동결합니다. 2-메르캅토에탄올(1μL/100μL의 용해 완충액)이 첨가된 전체 RNA 분리 키트에서 30μL의 용해 완충액을 추가하고 균질화를 사용하여 용해 완충액에서 샘플을 균질화합니다.
참고: 튜브에서 버퍼와 샘플의 오버플로를 방지하려면 소량의 용해 버퍼로 균질화하는 것이 좋습니다. - 570μL의 용해 버퍼를 추가하고 전체 RNA 분리 키트의 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출합니다(그림 1).
- 분광 광도계를 사용하여 추출 된 RNA의 농도를 측정하고 사용할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오.
- 인공 해수(ASW)에서 배양된 살아있는 클라도네마 메두사 3개를 팁이 잘린 상태에서 3.1mL 전달 피펫을 사용하여 1.5mL 튜브에 넣고 가능한 한 많은 ASW를 제거합니다.
- cDNA 합성
- 키트를 사용하여 메두새에서 추출한 전체 RNA를 주형으로 사용하여 cDNA를 합성합니다(그림 1 및 표 1).
- 65°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 얼음 위에서 빠르게 식히십시오.
- 단계 1.2.1의 혼합물로 cDNA 합성을 수행한다(표 1). 피펫팅으로 완전히 혼합하고 42°C에서 60분 동안 배양합니다.
- 95°C에서 5분 동안 배양합니다.
- 얼음 위에서 빠르게 식히십시오.
- 분광 광도계를 사용하여 합성 된 cDNA의 농도를 측정하고 사용할 때까지 -20 ° C 이하에서 보관하십시오.
- PCR 산물 합성
- PCR 템플릿을 만들려면 프라이머-BLAST를 사용하여 특정 프라이머를 디자인합니다. NCBI 데이터 또는 RNA-seq 데이터로부터 참조 서열을 소싱합니다.
참고: 이 프로토콜에 사용된 프라이머에 대해서는 재료 표를 참조하십시오. - 표적 서열을 증폭하려면 제한 효소를 사용할 필요가없는 TA 클로닝을 수행하십시오. 3' 말단에 아데닌이 첨가된 PCR 산물을 얻으려면 다음 설정을 사용하십시오: 2분 동안 98°C; 10 초 동안 98 ° C, 30 초 동안 55-60 ° C, 1 분 동안 72 ° C의 35 사이클. 반응에 Taq DNA 중합 효소를 사용하십시오 (표 1).
참고: PCR 조건을 결정하려면 일반적으로 권장 어닐링 온도 및 확장 시간을 제공하는 사용할 DNA 중합효소와 함께 제공되는 프로토콜을 따르십시오. - PCR 산물을 1% 아가로스 겔을 통해 실행하고 관심 밴드를 잘라냅니다. 겔 추출 키트를 사용하여 절단된 겔로부터 PCR 산물을 추출한다.
- PCR 템플릿을 만들려면 프라이머-BLAST를 사용하여 특정 프라이머를 디자인합니다. NCBI 데이터 또는 RNA-seq 데이터로부터 참조 서열을 소싱합니다.
- 결찰
- PCR 산물을 3' 티민 오버행과 함께 벡터에 라이게이션하여 시약을 혼합하고(표 1) 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다(도 1).
참고: 벡터:PCR의 분자 비율은 1:>3이어야 합니다. pTA2 벡터 크기는 약 3kb입니다. PCR 산물(삽입물)이 A(kb) 및 B(ng/μL)인 경우, 채취할 삽입물의 부피( 표 1의 X)는 ([삽입물의 벡터 × A kb의 50ng])/(3kb 벡터 × [1/3]) = 50· 삽입물의 ng. 삽입물의 농도가 B ng / μL 인 경우, 취해진 양은 50 · 삽입물의 A/B μL.
- PCR 산물을 3' 티민 오버행과 함께 벡터에 라이게이션하여 시약을 혼합하고(표 1) 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다(도 1).
- 변형 및 도금
- 형질전환을 위해, 유능한 세포를 얼음 위에서 해동하고 각각 20μL 분취량으로 분주한다. PCR 산물(적격 세포 부피의 5% 미만)을 포함하는 플라스미드 1μL를 추가하고 1초 동안 와동합니다. 얼음 위에서 5분 동안 배양한 다음 42°C에서 45초 동안 배양하고 1초 동안 와류를 배양합니다.
- 이화석 억제(SOC) 배지(영양학적으로 풍부한 박테리아 배양 배지)가 포함된 슈퍼 옵티멀 브로스 180μL를 적격 세포에 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 암피실린, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토-피라노사이드(X-gal) 및 이소프로필-β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 함유하는 한천 플레이트에 적격 세포를 펼치고 37°C에서 12-16시간 동안 배양합니다(그림 1).
알림: X-gal 및 IPTG는 파란색과 흰색 콜로니를 선택하는 데 사용됩니다.
- 액체 배양
- 접시에 있는 흰색과 파란색 식민지에서 흰색 식민지를 선택합니다. 암피실린과 함께 3-5mL의 LB 배지에 추가하고 셰이커에서 37°C에서 12-16시간 동안 배양합니다(그림 1).
- 미니프렙
- 플라스미드 미니프렙을 사용하여 LB 배지에서 플라스미드를 추출합니다(그림 1).
- 분광광도계를 사용하여 플라스미드 농도를 정량화한다.
- 순서를 읽으십시오.
- 플라스미드의 DNA 서열을 판독하려면 Sanger 시퀀싱을 위해 플라스미드를 보낸 다음 소프트웨어를 사용하여 게놈/전사체 서열과 정렬하여 표적 서열이 제대로 합성되었는지 확인하고 표적 서열이 플라스미드에 삽입되는 방향(5' to 3' 또는 3' to 5')으로 평가합니다.
참고: 표적 서열이 3' 말단 근처의 RNA 중합효소 결합 부위로부터 5' 내지 3' 방향으로 플라스미드 내로 삽입되는 경우, 시험 관내 전사에 의해 안티센스 프로브가 생성될 수 있다. 표적 서열이 역방향으로 3' 내지 5' 방향으로 삽입되는 경우, 센스 프로브(음성 대조군)가 생성될 수 있다. pTA2와 같은 벡터를 사용하는 경우, 목적에 따라 2개의 전사 결합 부위를 사용할 수 있다.
- 플라스미드의 DNA 서열을 판독하려면 Sanger 시퀀싱을 위해 플라스미드를 보낸 다음 소프트웨어를 사용하여 게놈/전사체 서열과 정렬하여 표적 서열이 제대로 합성되었는지 확인하고 표적 서열이 플라스미드에 삽입되는 방향(5' to 3' 또는 3' to 5')으로 평가합니다.
- 시험관 내 전사
- 플라스미드의 RNA 중합효소 결합 부위(예: T7/T3 결합 부위) 외부의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 생성된 플라스미드로부터 DNA 주형을 준비합니다(그림 1).
참고: M13-20 정방향 프라이머 및 M13 역방향 프라이머와 같은 범용 프라이머를 사용하여 RNA 중합효소 결합 부위를 포함하는 DNA 주형을 제조할 수 있습니다. - 겔/PCR 추출 키트를 사용하여 PCR 증폭 후 주형을 정제합니다.
- 아래에 표시된 시약을 혼합하고 37°C에서 3시간 동안 전사 반응을 수행합니다(그림 1 및 표 1).
- 1.5 μL의 DNase를 첨가하고 37 °C에서 30 분 동안 배양한다.
- RNase가 없는 물 10μL를 추가하고 클린업 컬럼을 사용하여 전사 반응 용액에서 프로브를 정제합니다.
- 1% 아가로스 겔에 1 μL를 로딩하여 합성된 RNA의 크기를 확인하고 분광광도계를 이용하여 농도를 결정한다.
참고: 합성된 RNA 프로브의 농도는 100ng/μL 이상이어야 합니다. - -20 °C 이하에서 보관하기 위해 30 μL의 포름아미드를 추가합니다.
- 플라스미드의 RNA 중합효소 결합 부위(예: T7/T3 결합 부위) 외부의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 생성된 플라스미드로부터 DNA 주형을 준비합니다(그림 1).
2. EdU 통합 및 고정
- 3.5mL 이송 피펫을 사용하여 클라도네마 메두사에(튜브당 5-10마리)를 1.5mL 튜브에 넣고 총 부피 500μL까지 ASW를 추가합니다. 7.5μL의 10mM EdU 원액을 추가하고 22°C에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다(그림 2). EdU 최종 농도는 150μM입니다.
알림: 5-7일 된 메두새를 사용하여 세 번째 가지 형성을 모니터링합니다(그림 3A). 메두새가 폴립에서 분리된 날은 1일로 계산되며, 5일째에 메두새는 일반적으로 주 촉수에 세 번째 가지를 보이기 시작합니다. - 1시간 후 EdU가 포함된 ASW를 최대한 많이 제거합니다.
- 메두사를 마취하기 위해, H 2 O에 7 % MgCl2 을 첨가하고 5 분동안 배양한다.
- H2O에서 7%MgCl2를 제거하고 ASW 중 4% 파라포름알데히드(PFA)로 4°C에서 밤새 메두새를 고정합니다(그림 2).
참고 : EdU 통합없이 FISH를 수행 할 때 마취 후 EdU로 처리 한 샘플과 유사하게 샘플을 고정 할 수 있습니다 (2.3-2.4 단계).
3. 형광 현장 혼성화
- 프로테이나제 치료 및 사후 고정
- PFA를 제거하고 샘플을 0.1% 트윈-20(PBST)을 함유하는 PBS로 3 x 10분 동안 세척한다. 세척당 300-500 μL의 PBST를 사용하십시오.
참고: 이 단계부터 혼성화가 끝날 때까지 실험은 장갑과 마스크를 착용하고 RNase가 없는 환경에서 수행해야 합니다. 이 단계의 1x PBS는 DEPC 처리된 물로 만들어야 합니다. 혼성화 후, DEPC 처리 없이 물로 만든 1x PBS를 사용할 수 있다. 일부 ISH 및 FISH 프로토콜은 메탄올 단계를 사용하여 샘플을 탈수하므로 고정 샘플을 사용할 때까지 -20 ° C에서 저장할 수 있습니다. 불필요한 작업을 피하기 위해, 탈수 과정은 특히 샘플이 최대 며칠 동안 PBST에 보관될 수 있기 때문에 이 프로토콜에서 생략됩니다. - 고정 후, 항-DIG-POD 항체 O.N. 배양 단계(단계 3.4.2)를 제외하고 샘플을 쉐이커의 1.5mL 튜브에 넣습니다. 세척 후, PBST에 10 mg/mL 프로테이나제 K 원액을 첨가하고, 37°C에서 10분 동안 프로테이나제 K(최종 농도: 10 μg/mL)로 메두새를 배양한다.
- 프로테이나제 K 용액을 제거하고 PBST로 2 x 1분 동안 샘플을 세척한다.
- 메두새를 후위사로 만들려면 1x PBS에 4% PFA를 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- PFA 용액을 제거하고 PBST로 2 x 10분 동안 샘플을 세척합니다.
참고: 표적 유전자가 낮은 배경 신호로 고도로 발현되는 경우 3.1.2-3.1.5단계를 건너뛸 수 있습니다.
- PFA를 제거하고 샘플을 0.1% 트윈-20(PBST)을 함유하는 PBS로 3 x 10분 동안 세척한다. 세척당 300-500 μL의 PBST를 사용하십시오.
- 교 잡
- PBST를 제거하고 하이브리드화 버퍼(HB 버퍼, 표 1)를 추가합니다. 샘플을 HB 버퍼에서 실온(RT)에서 15분 동안 인큐베이션합니다. 성공적인 혼성화를 위한 충분한 부피를 제공하는 300-400μL의 HB 버퍼를 사용하십시오.
알림: HB 버퍼, 세척 버퍼 1 및 세척 버퍼 2는 20x SSC 스톡으로 준비됩니다. HB 버퍼는 -20 ° C 이하에서 보관되며 사용하기 전에 RT로 가져와야합니다. - HB 버퍼를 제거하고 새 HB 버퍼를 추가합니다. 혼성화 인큐베이터에서 최소 2시간 동안 55°C에서 사전 혼성화합니다.
- HB 완충액을 제거하고 단계 1.9.7에서 저장된 프로브를 포함하는 HB 완충액으로 배양합니다(최종 프로브 농도: HB 완충액 중 0.5-1ng/μL). 하이브리드화 인큐베이터에서 55°C에서 18-24시간 동안 하이브리드화합니다(그림 2).
참고: FISH 신호 강도 및 특이성은 표적 유전자 발현, 프로브 길이 및 특이성으로 인해 달라질 수 있습니다. 강도를 높이기 위해 혼성화 기간(18-72시간) 및 온도(50-65°C)와 같은 매개변수를 조정할 수 있으며 다양한 프로브를 테스트할 수 있습니다. 비특이적 신호를 피하기 위해, 프로테이나제 K 처리(농도 및 기간)를 수정할 수 있다19.
- PBST를 제거하고 하이브리드화 버퍼(HB 버퍼, 표 1)를 추가합니다. 샘플을 HB 버퍼에서 실온(RT)에서 15분 동안 인큐베이션합니다. 성공적인 혼성화를 위한 충분한 부피를 제공하는 300-400μL의 HB 버퍼를 사용하십시오.
- 프로브 제거
- 프로브가 포함된 HB 버퍼를 제거한 다음 세척 버퍼 1을 추가합니다(표 1). 샘플을 세척 버퍼 1로 55°C에서 2 x 15분 동안 세척합니다. 300-400 μL의 세척 완충액을 사용하십시오.
알림: 프로브가 포함된 HB 버퍼는 최대 약 10회까지 반복적으로 사용할 수 있습니다. 폐기하는 대신 프로브가 포함 된 사용 된 HB 버퍼를 -20 ° C 이하에서 보관하십시오. 사용하기 전에 세척 버퍼 1, 세척 버퍼 2, 2x SSC 및 PBST를 55°C로 예열합니다. - 세척 버퍼 1을 제거한 다음 세척 버퍼 2를 추가합니다(표 1). 샘플을 세척 버퍼 2로 55°C에서 2 x 15분 동안 세척합니다.
- 세척 버퍼 2를 제거한 다음 2x SSC를 추가합니다. 샘플을 2x SSC로 55°C에서 2 x 15분 동안 세척합니다.
- 2x SSC를 제거한 다음 예열된 PBST를 추가합니다. RT에서 PBST로 1 x 15분 동안 샘플을 세척합니다.
- 프로브가 포함된 HB 버퍼를 제거한 다음 세척 버퍼 1을 추가합니다(표 1). 샘플을 세척 버퍼 1로 55°C에서 2 x 15분 동안 세척합니다. 300-400 μL의 세척 완충액을 사용하십시오.
- 항 DIG 항체 배양
- PBST를 제거한 다음 1% 차단 버퍼를 추가합니다. 로커에서 천천히 흔들면서 RT에서 최소 1 시간 동안 샘플을 배양하십시오.
알림: 1% 블로킹 버퍼 스톡을 희석하여 5% 블로킹 버퍼를 새로 준비합니다(표 1). 샘플이 흔들림의 결과로 뚜껑 뒤쪽이나 벽에 달라붙는 경향이 있으므로 다음 항체 반응 전에 샘플을 확인하십시오. - 블로킹 후 1% 블로킹 완충액을 제거하고 anti-DIG-POD 용액(1:500, 1% 블로킹 완충액)을 추가하고 샘플 O.N.을 4°C에서 인큐베이션합니다(그림 2).
알림: 비특이적 신호가 감지되지 않도록 배양 시간을 12-16시간 이내로 유지하도록 주의하십시오.
- PBST를 제거한 다음 1% 차단 버퍼를 추가합니다. 로커에서 천천히 흔들면서 RT에서 최소 1 시간 동안 샘플을 배양하십시오.
- DIG 표지 프로브 검출
- 항-DIG-POD 용액을 제거한 다음, 트리스-NaCl-트윈 완충액(TNT, 표 1)을 첨가한다. RT에서 3 x 10 분 동안 TNT로 샘플을 세척하십시오.
참고: 티라마이드 신호 증폭(TSA) 기술을 사용하면 양 고추냉이 과산화효소 표지 시약(예: anti-DIG-POD)에 대해 더 나은 해상도의 이미지를 제공합니다. - 형광 염료 공액 티라마이드(Cy5-tyramide) 원액(1:50)을 증폭 희석 완충액에 희석하여 활성 Cy5-티라미드 용액을 만듭니다(그림 2).
- 가능한 한 많은 TNT를 제거한 다음 활성 Cy5- 티라마이드 용액을 첨가하십시오. 어둠 속에서 10 분 동안 샘플을 배양하십시오.
- 어둠 속에서 3 x 10분 동안 PBST로 샘플을 세척합니다.
- 항-DIG-POD 용액을 제거한 다음, 트리스-NaCl-트윈 완충액(TNT, 표 1)을 첨가한다. RT에서 3 x 10 분 동안 TNT로 샘플을 세척하십시오.
- EdU 검출
참고: EdU 키트는 통합된 EdU를 형광 신호로 감지합니다(그림 2).- EdU 검출 칵테일을 준비하려면 표 1과 같이 구성 요소를 혼합하십시오. 각 샘플에 대해 100μL의 EdU 검출 칵테일을 사용하십시오.
알림: 1x 반응 버퍼 첨가제를 초순수로 희석하여 10x 반응 버퍼 첨가제를 준비합니다. - PBST를 제거한 다음 EdU 검색 칵테일을 추가합니다. 어둠 속에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 어둠 속에서 PBST로 3 x 10 분 동안 씻으십시오.
- EdU 검출 칵테일을 준비하려면 표 1과 같이 구성 요소를 혼합하십시오. 각 샘플에 대해 100μL의 EdU 검출 칵테일을 사용하십시오.
- DNA 염색
- 회히스트 33342(1:500)를 PBST로 희석하여 회히스트 용액을 제조한다. PBST를 제거한 다음 Hoechst 솔루션을 추가합니다. 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양합니다(그림 2).
- 어둠 속에서 3-4 x 10분 동안 PBST로 샘플을 세척합니다.
- 장착
- 샘플이 부서지지 않도록 유리 슬라이드에 은행을 만드십시오. 유리 슬라이드에 비닐 테이프를 붙이고 중앙을 비우십시오.
- 팁이 잘린 상태에서 3.1mL 이송 피펫을 사용하여 메두새를 슬라이드 글라스의 은행으로 옮깁니다.
알림: 촉수가 겹치지 않도록주의하십시오. - P200 피펫으로 PBST를 제거한 다음 장착 매체로 70% 글리세롤을 천천히 추가합니다(그림 2).
참고: 70% 글리세롤 대신 퇴색 방지 장착 매체를 사용하여 형광이 퇴색되는 것을 방지할 수 있습니다. - 집게로 메두사에 커버슬립을 부드럽게 놓고 투명한 매니큐어로 커버슬립의 측면을 밀봉합니다.
- 슬라이드를 어둠 속에서 4°C로 유지하여 즉시 현미경 관찰을 수행하지 않는 경우.
- 이미징
- 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다. 단일 셀 해상도의 경우 40x 오일 렌즈 또는 더 높은 배율의 렌즈를 사용하십시오.
- 이미지 획득 후, ImageJ/FIJI 소프트웨어를 사용하여 이미지를 열고, 멀티포인트 툴(20)에 의해 EdU+ 및/또는 Nanos1+에 대해 양성인 셀을 계수한다.
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Representative Results
Cladonema 촉수는 형태 형성 및 재생15,16,17의 세포 과정을 연구하기위한 모델로 사용되었습니다. 촉수 구조는 줄기 유사 세포 또는 i- 세포가 촉수 전구라고하는 근위 영역에 위치하는 상피관으로 구성되며 축 쪽을 따라 전구의 원위 영역 뒤쪽에 새로운 가지가 순차적으로 추가됩니다 (그림 3A)15. 이전 보고서에 따르면 세포 증식은 촉수 전구와 EdU 또는 BrdU 표지16,17을 사용하는 새로운 분기 부위 모두에서 활성화됩니다. 그러나 in situ 혼성화의 분해로 인해 줄기 유사 세포가 실제로 증식하는지 여부는 불분명합니다. 줄기 유사 세포와 증식 세포를 세포 수준에서 동시에 시각화하기 위해 줄기 세포 마커 (Nanos1 또는 Piwi)에 대해 FISH를 수행하고 동일한 샘플에서 S 상 세포에 대해 EdU 라벨링을 수행했습니다.
FISH에 의한 세포 분해능에서, Nanos1의 발현은 촉수 구근과 새로운 분지 부위에 국한되었다 (그림 3B). Piwi는 또한 촉수 전구와 새로운 분기 부위에서 Nanos1과 유사한 패턴으로 발현되었습니다 (그림 3C). 이러한 결과는 이전 보고서17에서 전체 장착 현장 혼성화의 관찰과 일치했으며, 여기서 7일 된 메두사의 싹이 트는 가지가 Nanos1 및 Piwi에 의해 거의 균일하게 표지되었습니다. 줄기 유사 세포 축적의 시작을 시각화하기 위해 우리는 5 일 된 메두사의 새로운 분기 부위를 모니터링했습니다. Nanos1 발현과 EdU 양성 세포의 공동 표지는 촉수에서 줄기 유사 세포와 증식 세포의 공간 패턴을 나타냈습니다(그림 4A). EdU+ 및 Nanos1+ 세포의 총 분포는 이전 보고서16,17과 일치했지만, EdU+ 세포는 적어도 분지 초기에 촉수 구근 전체에 더 광범위하게 분포된 반면 Nanos1+ 세포는 촉수 구근과 새로운 분기 부위에 더 국부적으로 축적되었습니다(그림 4A 및 그림 4E ). 이러한 관찰은 줄기 유사 세포와 증식하는 세포의 뚜렷한 분포가 발달시기와 다른 단계에 따라 감지된다는 것을 시사합니다.
전구와 새로운 분기 부위를 더 자세히 살펴보면 EdU 신호가 핵 염색과 병합되는 반면 Nanos1 발현은 이전 보고서5와 일치하는 핵을 둘러싼 세포질로 제한된다는 것이 밝혀졌습니다(그림 4B,C). 세포의 분획(19.79%)은 EdU와 Nanos1(EdU+ Nanos1+; 그림 4B, C, 노란색 화살촉 및 그림 4D)는 이러한 세포가 활발하게 증식하는 줄기 세포 집단임을 시사합니다. 흥미롭게도 세포의 14.46%가 전구 중앙과 새로운 분기 부위에서 EdU+ Nanos1-로 발견되어 줄기와 유사하지 않은 증식 세포의 존재를 시사합니다(그림 4B, C, 흰색 화살표 및 그림 4D). 대조적으로, 세포의 26.32%가 전구의 기저부와 새로운 분기 부위에서 EdU- Nanos1+인 것으로 관찰되었으며, 이는 EdU 펄스 라벨링에 의해 감지되지 않는 느린 사이클링 또는 정지 상태의 줄기 세포 집단의 존재를 나타냅니다(그림 4B, C, 노란색 화살표 및 그림 4D).
도 1: in situ 하이브리드화를 위한 프로브 합성의 반응식. 메두사에서 총 RNA 추출 및 총 RNA에서 cDNA 합성. Nanos1 특이적 PCR 산물은 cDNA로부터 합성하였다. PCR 산물을 벡터 내로 라이게이션하고, 증폭된 벡터를 유능한 세포 배양을 통해 수집하였다. RNA 중합효소 결합 부위를 갖는 PCR 산물을 주형으로서 플라스미드를 사용하여 합성하였다. DIG 표지된 RNA 프로브는 시험관내 전사에 의해 합성되었다. 약어 : DIG = 디곡시 제닌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: EdU 및 형광 제자리 혼성화 공동 염색의 계획. 메두새를 1시간 동안 150 μM EdU와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 메두사를H2O중 7%MgCl2로 마취시키고(조직을 이완시키기 위해) 4°C에서 4% PFA O.N.으로 고정시켰다. 고정 후, 샘플을 55°C에서 20-24시간 동안 프로브로 HB 버퍼와 혼성화시켰다. 하이브리드화 반응 후, 샘플을 세척하고, 4°C에서 항-DIG-POD 용액 O.N.과 함께 인큐베이션하였다. 메두새를 Cy5-티라미드 용액으로 10분 동안 염색한 후, 30분 동안 EdU를 검출하고 30분 동안 Hoechst 33342로 염색하였다. 모든 염색 과정을 완료 한 후, 메두사를 유리 슬라이드에 장착하고 공초점 현미경으로 이미지를 얻었습니다. 약어: EdU = 5-에티닐-2'-데옥시우리딘; FISH = 형광 제자리 혼성화; PFA = 파라포름알데히드; O.N. = 하룻밤; HB = 혼성화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Cladonema 메두사 촉수의 근위 축쪽에 있는 Nanos1 및 Piwi 발현 패턴. (A) 클라도네마 메두사와 촉수의 개략도. 촉수의 축 방향 : 새로운 분기 부위에 순차적으로 형성된 새로운 가지가있는 촉수 전구 (가장 근위 영역). 삽입(파선 사각형)은 컨포칼 이미지가 캡처한 영역을 나타냅니다. (B) 7일 된 클라도네마 메두사의 촉수의 근위, 축쪽에서 Nanos1 유전자 발현의 FISH 이미지. (C) 7일 된 클라도네마 메두사의 촉수의 근위, 축쪽에서 피위 유전자 발현의 FISH 이미지. DNA: 녹색, Nanos1: 마젠타. Nanos1 FISH 전용 이미지의 경우 B'-C'입니다. 스케일 바 = 100 μm (B, C). 약어: FISH = 형광 제자리 혼성화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: EdU 및 Nanos1 발현 패턴은 클라도네마 메두사 촉수의 근위, 축쪽에 있습니다. (A-C) Nanos1 발현 및 EdU와 공동 표지된 클라도네마 메두사 촉수의 근위 축방향 측면의 이미지; 5 일 된 메두새가 사용되었습니다. (A) 촉수의 개요. 노란색 파선 사각형은 B와 C의 영역을 나타냅니다. (B) 촉수 전구의 배율. (C) 새로운 분기 사이트의 확대. 노란색 화살촉은 EdU와 Nanos1 모두에 대해 양성인 세포를 나타냅니다. 노란색 화살표는 Nanos1에 대해서만 양성인 셀을 나타냅니다. 흰색 화살표는 EdU에 대해서만 양성인 세포를 나타냅니다. A-C 패널은 DNA(파란색), EdU(녹색) 및 Nanos1(마젠타색)에 대한 병합 이미지입니다. A'-C'는 EdU 전용 이미지용 패널입니다. A''-C''는 Nanos1 FISH 전용 이미지용입니다. 스케일 바 = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) 촉수의 기저측에있는 EdU- 및 / 또는 Nanos1- 양성 세포의 정량화 (정량화 면적 = 30.10 μm2 square, n = 6, 총 249 개의 세포). EdU+ 나노1- 세포, 14.46%; EdU+ 나노1+ 세포, 19.79%; EdU- 나노1+ 세포, 26.32%; EdU− Nanos1− 세포, 39.44%. (E) 축 방향에서 본 클라도네마 메두사 촉수의 개략도. EdU+ 세포와 Nanos1+ 세포의 전체 분포는 각각 E와 E'로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 이 프로토콜에서 다양한 PCR 반응 및 완충액의 조성. 라이게이션 반응에서 PCR 산물의 부피(X μL)를 계산하려면 프로토콜 단계 1.4 이후의 참고 사항을 참조하십시오. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
증식 세포와 줄기 세포는 형태 형성, 성장 및 재생과 같은 다양한 과정에서 중요한 세포 공급원입니다21,22. 이 논문은 Cladonema medusae에서 FISH 및 EdU 표지에 의해 줄기 세포 마커 Nanos1을 공동 염색하는 방법을 설명합니다. EdU 또는 BrdU 표지를 사용한 이전 연구는 증식 세포가 촉수 전구16,17에 국한된다는 것을 제안했지만 분자 특성은 불분명했습니다. 본 연구는 증식 세포의 분포와 Nanos1+ 줄기 유사 세포의 국소화를 동시에 결정하는 것을 보여줍니다(그림 4). 결과는 일부 증식 세포가 Nanos1을 발현했지만 다른 세포는 EdU로만 표시되고 Nanos1을 발현하지 않았 음을 보여 줄기 세포 이질성 또는 잠재적으로 다른 증식 세포의 존재를 시사합니다. 촉수 분지, 조직 항상성, 장기 재생 및 생식 세포 유지를 포함하여 Cladonema의 다양한 과정에서 상세한 줄기 세포 분포를 해부하는 것은 흥미로울 것입니다.
동물에서 줄기 세포를 시각화하기위한 주요 병목 현상은 줄기 세포 마커의 초기 식별입니다. cnidarians에서, 줄기 세포 마커는 비 수생 동물3에서 확인되지 않았으므로,이 단계에서 줄기 세포 마커에 대한 FISH의 직접적인 적용은 수생 동물로 제한된다. 그럼에도 불구하고, FISH는 세포 수준에서 특정 유전자 발현의 검출을 허용하고, 따라서, 프로브를 변경함으로써, 이 방법은 임의의 관심 유전자의 공간적 발현 패턴을 상세히 관찰하도록 확장될 수 있다. 예를 들어, 전구 세포와 분화 된 세포의 마커를 사용하여 Cladonema 촉수에서 특정 세포 유형의 분포를 확인할 수 있습니다. 주의사항으로서, 본 프로토콜은 발현 수준 및 mRNA 안정성의 차이로 인해 관심있는 유전자에 따라 변형되어야 할 수 있다. 특히, 비특이적 신호 및 약한 신호는 FISH와 관련된 일반적인 문제입니다. 표백 시약 (포름 아미드 또는 메탄올)을 사용하고, 다른 매개 변수 (TSA 반응 시간, Proteinase K 처리, 혼성화 후 세척)를 조정하여 하이브리드 화 시간 및 온도를 변경하면 더 명확한 신호와 더 적은 비특이적 신호를 얻을 수 있습니다23,24. 하나의 FISH 프로토콜이 동일한 분류군 7,25,26 내에서도 다른 종에 적용되지 않을 수 있기 때문에 사용되는 동물 모델에 적합한 FISH 프로토콜을 선택하는 것도 중요합니다.
EdU 표지는 일반적으로 증식 세포를 검출하는 데 사용되지만 농도 및 배양 시간을 변화시킴으로써 다른 실험 목적으로 사용될 수 있습니다27. 증식하는 세포를 검출하려면 EdU 혼입의 성공적인 지속 기간과 농도를 결정하는 것이 중요합니다. 이 작업에 사용된 펄스 표지에서, 단기간 동안 S기를 통과한 증식성 세포만을 마킹하고, 유사한 짧은 배양 방법이 다른 자포동물에서 증식하는 세포를 검출하기 위해 활용되었다6,28,29. 대조적으로, 연장된 EdU 혼입 및 Nanos1 FISH의 조합은 서속-사이클링 또는 정지 줄기 세포(27)의 존재를 나타낼 수 있다. 증식 세포뿐만 아니라 분열없이 DNA 합성을 거친 세포 내순환 세포도 표시 할 수 있습니다. 또한 EdU 표지 세포를 더 오랜 기간 동안 추적함으로써 증식 세포 및 그 세포 계통과 관련된 이동 및 분화를위한 세포 용량을 결정할 수 있습니다 6,30.
FISH와 EdU 또는 BrdU 염색의 조합이 7,31 번 사용되었지만, 여기에 확립 된 방법은 다른 해파리 종을 포함한 다른 해양 무척추 동물 및 비 모델 동물에 쉽게 적용될 수 있습니다. EdU 염색은 BrdU 염색18보다 간단하고 민감하며, 짧은 시간 배양으로 장기세포 표지7에 EdU를 사용한 이전 연구와 달리 증식하는 세포를 검출할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 차세대 시퀀싱 기술의 발전으로 많은 종에서 게놈 및 유전자 발현 정보를 사용할 수있게되었습니다. 줄기 세포와 증식 세포를 식별하는 것은 줄기 세포의 이질성과 다양성을 이해하고 다양한 생물학적 현상의 기저에 있는 세포 역학에 대한 통찰력을 제공하는 효과적인 접근 방식이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 AMED가 보조금 번호 JP22gm6110025(Y.N.에게)와 JSPS KAKENHI 보조금 번호 22H02762(Y.N.에게)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipette | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 forward primer | 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3’ |
||
| Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer | 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’ | ||
| Cladonema pacificum Piwi forward primer | 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3’ |
||
| Cladonema pacificum Piwi reverse primer | 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3’ |
||
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen | C10337 | EdU kit |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N/A | chlorine neutralizer |
| DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent | Roche | 11175041910 | blocking buffer |
| DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS competent cell DH5α | NIPPON GENE | 316-06233 | competent cell |
| Fast gene Gel/PCR Extraction kit | Fast gene | FG-91302 | gel extraction kit |
| Fast gene plasmid mini kit | Fast gene | FG-90502 | plasmid miniprep |
| Formamide | Wako | 068-00426 | |
| Heparin sodium salt from porcine | SIGMA-ALDRICH | H3393-10KU | |
| Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plate |
| LB Broth Base | Invitrogen | 12780-052 | LB medium |
| Maleic acid | Wako | 134-00495 | |
| mini Quick spin RNA columns | Roche | 11814427001 | clean-up column |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spectrophotometer |
| Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippi | 891300 | homogenizer |
| Proteinase K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase Inhibitor | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74004 | total RNA isolation kit |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | |
| Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mixture of mineral salts |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hybridization incuvator |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polymerase |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit | TaKaRa | 6210A | cDNA synthesis kit |
| Target Clone | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vector |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Cyanine 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tyramide signal amplification (TSA) technique |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | laser scanning confocal microscope |
References
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