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Developmental Biology

हाइड्रोज़ोन जेलीफिश क्लैडोनेमा पैसिफिकम में स्टेम जैसी कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन और 5-एथिनिल -2'-डीऑक्सीयूरिडिन लेबलिंग

Published: August 3, 2022 doi: 10.3791/64285
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

यहां, हम जेलीफिश क्लैडोनेमा में स्टेम जैसी प्रसार कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। स्टेम सेल मार्कर के साथ सीटू संकरण में होल-माउंट फ्लोरोसेंट स्टेम जैसी कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, और 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडिन लेबलिंग प्रसार कोशिकाओं की पहचान को सक्षम बनाता है। साथ में, सक्रिय रूप से स्टेम जैसी कोशिकाओं का पता लगाया जा सकता है।

Abstract

समुद्री एनीमोन, कोरल और जेलीफिश सहित निडारियन, विविध आकृति विज्ञान और जीवन शैली का प्रदर्शन करते हैं जो सेसिल पॉलीप्स और फ्री-स्विमिंग मेडुसे में प्रकट होते हैं। जैसा कि हाइड्रा और नेमाटोस्टेला जैसे स्थापित मॉडलों में उदाहरण दिया गया है, स्टेम सेल और / या प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं निडारियन पॉलीप्स के विकास और उत्थान में योगदान करती हैं। हालांकि, अधिकांश जेलीफ़िश में अंतर्निहित सेलुलर तंत्र, विशेष रूप से मेडुसा चरण में, काफी हद तक अस्पष्ट हैं, और इस प्रकार, विशिष्ट सेल प्रकारों की पहचान करने के लिए एक मजबूत विधि विकसित करना महत्वपूर्ण है। यह पेपर हाइड्रोज़ोन जेलीफिश क्लैडोनेमा पैसिफिकम में स्टेम जैसी प्रसार कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। क्लैडोनेमा मेडुसे के पास शाखित तम्बू होते हैं जो लगातार बढ़ते हैं और अपने वयस्क चरण में पुनर्योजी क्षमता को बनाए रखते हैं, एक अनूठा मंच प्रदान करते हैं जिसके साथ प्रसार और / या स्टेम जैसी कोशिकाओं द्वारा आयोजित सेलुलर तंत्र का अध्ययन किया जाता है। स्टेम सेल मार्कर का उपयोग करके होल-माउंट फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण (फिश) स्टेम जैसी कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, जबकि 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडिन (ईडीयू), एक एस चरण मार्कर के साथ पल्स लेबलिंग, प्रसार कोशिकाओं की पहचान को सक्षम बनाता है। फिश और ईडीयू लेबलिंग दोनों के संयोजन से, हम निश्चित जानवरों पर सक्रिय रूप से स्टेम जैसी कोशिकाओं के प्रसार का पता लगा सकते हैं, और इस तकनीक को गैर-मॉडल जेलीफिश प्रजातियों सहित अन्य जानवरों पर व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

Introduction

निडारिया को एक बेसल ब्रांचिंग मेटाज़ोन फाइलम माना जाता है जिसमें नसों और मांसपेशियों वाले जानवर होते हैं, जो उन्हें पशु विकास और शरीर विज्ञान 1,2 के विकास को समझने के लिए एक अनूठी स्थिति में रखते हैं। निडारियन को दो मुख्य समूहों में वर्गीकृत किया गया है: एंथोज़ोआ (जैसे, समुद्री एनीमोन और कोरल) में केवल प्लानुला लार्वा और सेसिल पॉलीप चरण होते हैं, जबकि मेडुसोज़ोआ (हाइड्रोज़ोआ, स्टौरोज़ोआ, साइफोज़ोआ और कुबोज़ोआ के सदस्य) आमतौर पर फ्री-स्विमिंग मेडुसे, या जेलीफ़िश, साथ ही प्लानुला लार्वा और पॉलीप्स का रूप लेते हैं। निडारियन आमतौर पर उच्च पुनर्योजी क्षमता प्रदर्शित करते हैं, और उनके अंतर्निहित सेलुलर तंत्र, विशेष रूप से वयस्क स्टेम कोशिकाओं और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं के उनके कब्जे ने बहुत ध्यान आकर्षित कियाहै। प्रारंभ में हाइड्रा में पहचाने गए, हाइड्रोज़ोन स्टेम सेल एक्टोडर्मल उपकला कोशिकाओं के बीच अंतरालीय रिक्त स्थान में स्थित होते हैं और आमतौर पर अंतरालीय कोशिकाओं या आई-कोशिकाओंके रूप में संदर्भित होते हैं।

हाइड्रोज़ोन आई-कोशिकाएं सामान्य विशेषताओं को साझा करती हैं जिनमें मल्टीपोटेंसी, व्यापक रूप से संरक्षित स्टेम सेल मार्करों (जैसे, नैनोस, पिवी, वासा) की अभिव्यक्ति और माइग्रेशन क्षमता 3,5,6,7,8 शामिल हैं। कार्यात्मक स्टेम कोशिकाओं के रूप में, आई-कोशिकाएं हाइड्रोज़ोन जानवरों के विकास, शरीर विज्ञान और पर्यावरणीय प्रतिक्रियाओं में बड़े पैमाने पर शामिल होती हैं, जो उनकी उच्च पुनर्योजी क्षमता औरप्लास्टिसिटी 3 को प्रमाणित करती हैं। जबकि आई-कोशिकाओं के समान स्टेम कोशिकाओं को हाइड्रोज़ोन्स के बाहर नहीं पहचाना गया है, यहां तक कि स्थापित मॉडल प्रजातियों नेमाटोस्टेला में भी, प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं अभी भी दैहिक ऊतक के रखरखाव और पुनर्जनन में शामिल हैं, साथ ही रोगाणु रेखा9 भी। चूंकि निडारियन विकास और पुनर्जनन में अध्ययन मुख्य रूप से पॉलीप-प्रकार के जानवरों जैसे हाइड्रा, हाइड्रैक्टिनिया और नेमाटोस्टेला पर आयोजित किए गए हैं, जेलीफिश प्रजातियों में स्टेम कोशिकाओं की सेलुलर गतिशीलता और कार्य काफी हद तक संबोधित नहीं किए गए हैं।

भूमध्य सागर और उत्तरी अमेरिका सहित दुनिया भर के विभिन्न आवासों के साथ एक महानगरीय जेलीफ़िश प्रजाति हाइड्रोज़ोन जेलीफ़िश क्लिटिया हेमिसफेरिका का उपयोग कई विकासात्मक और विकासवादीअध्ययनों में एक प्रयोगात्मक मॉडल जानवर के रूप में किया गया है। अपने छोटे आकार, आसान हैंडलिंग और बड़े अंडों के साथ, क्लिटिया प्रयोगशाला रखरखाव के लिए उपयुक्त है, साथ ही हाल ही में स्थापित ट्रांसजेनेसिस और नॉकआउट विधियों11 जैसे आनुवंशिक उपकरणों की शुरूआत के लिए, जेलीफिश जीव विज्ञान के अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र के विस्तृत विश्लेषण का अवसर खोलता है। क्लिटिया मेडुसा टेंटेकल में, आई-कोशिकाओं को समीपस्थ क्षेत्र में स्थानीयकृत किया जाता है, जिसे बल्ब कहा जाता है, और नेमाटोब्लास्ट्स जैसे पूर्वज अलग-अलग सेल प्रकारों में अंतर करते हुए डिस्टल टिप पर चले जाते हैं, जिसमें नेमाटोसाइट्स12 भी शामिल हैं।

जेलीफिश के मौखिक अंग क्लिटिया मैनुब्रियम के पुनर्जनन के दौरान, नैनोस 1 + आई-कोशिकाएं जो गोनाड में मौजूद होती हैं, उस क्षेत्र में स्थानांतरित हो जाती हैं जहां क्षति के जवाब में मनुब्रियम खो जाता है और मैनुब्रियम7 के उत्थान में भाग लेता है। ये निष्कर्ष इस विचार का समर्थन करते हैं कि क्लिटिया में आई-कोशिकाएं कार्यात्मक स्टेम कोशिकाओं के रूप में भी व्यवहार करती हैं जो मॉर्फोजेनेसिस और पुनर्जनन में शामिल होती हैं। हालांकि, यह देखते हुए कि आई-कोशिकाओं के गुण प्रतिनिधि पॉलीप-प्रकार के जानवरों जैसे हाइड्रा और हाइड्रैक्टिनिया3 के बीच भिन्न होते हैं, यह संभव है कि स्टेम कोशिकाओं की विशेषताओं और कार्यों को जेलीफिश प्रजातियों के बीच विविध किया जाता है। इसके अलावा, क्लिटिया के अपवाद के साथ, प्रयोगात्मक तकनीकों को अन्य जेलीफिश के लिए सीमित किया गया है, और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं और स्टेम कोशिकाओं की विस्तृतगतिशीलता अज्ञात है।

हाइड्रोज़ोन जेलीफ़िश क्लैडोनेमा पैसिफिकम एक उभरता हुआ मॉडल जीव है जिसे पानी के पंप या निस्पंदन प्रणाली के बिना प्रयोगशाला वातावरण में रखा जा सकता है। क्लैडोनेमा मेडुसा में शाखित तम्बू हैं, जो क्लैडोनमेटिडे परिवार में एक आम विशेषता है, और बल्ब14 के पास एक्टोडर्मल परत पर ओसेलस नामक एक फोटोरिसेप्टर अंग है। तम्बू शाखाओं की प्रक्रिया एक नई शाखाओं की साइट पर होती है जो तम्बू के अक्षीय पक्ष के साथ दिखाई देती है। समय के साथ, तम्बू लम्बी और शाखाएं जारी रखते हैं, पुरानी शाखाओं को टिप15 की ओर धकेल दिया जाता है। इसके अलावा, क्लैडोनेमा टेंटेकल विच्छेदन पर कुछ दिनों के भीतर पुनर्जीवित हो सकते हैं। हाल के अध्ययनों ने क्लैडोनेमा16,17 में तम्बू शाखाओं और पुनर्जनन में कोशिकाओं और स्टेम जैसी कोशिकाओं के प्रसार की भूमिका का सुझाव दिया है। हालांकि, जबकि क्लैडोनेमा में जीन अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए पारंपरिक इन सीटू संकरण (आईएसएच) का उपयोग किया गया है, इसके कम रिज़ॉल्यूशन के कारण, वर्तमान में सेलुलर स्तर पर स्टेम सेल गतिशीलता का विस्तार से निरीक्षण करना मुश्किल है।

यह पेपर फिश द्वारा क्लैडोनेमा में स्टेम जैसी कोशिकाओं की कल्पना करने और ईडीयू के साथ सह-धुंधला करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो सेल प्रसार18 का एक मार्कर है। हम फिश द्वारा एक स्टेम सेल मार्कर 5,17 नैनोस 1 के अभिव्यक्ति पैटर्न की कल्पना करते हैं, जो एकल-सेल स्तर पर स्टेम जैसे सेल वितरण की पहचान के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, ईडीयू लेबलिंग के साथ नैनोस 1 अभिव्यक्ति का सह-धुंधलापन सक्रिय रूप से स्टेम जैसी कोशिकाओं को अलग करना संभव बनाता है। स्टेम जैसी कोशिकाओं और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं दोनों की निगरानी के लिए इस विधि को जांच क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है, जिसमें क्लैडोनेमा में टेंटेकल ब्रांचिंग, ऊतक होमियोस्टेसिस और अंग पुनर्जनन शामिल हैं, और इसी तरह का दृष्टिकोण अन्य जेलीफिश प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. जांच संश्लेषण

  1. आरएनए निष्कर्षण
    1. 3.1 एमएल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके कृत्रिम समुद्री जल (एएसडब्ल्यू) में संवर्धित तीन जीवित क्लैडोनेमा मेडुसे रखें, और जितना संभव हो उतना एएसडब्ल्यू हटा दें।
      नोट: एएसडब्ल्यू क्लोरीन न्यूट्रलाइज़र के साथ नल के पानी में खनिज लवण के मिश्रण को घोलकर तैयार किया जाता है; अंतिम विशिष्ट गुरुत्वाकर्षण (एसजी) 1.018 है या भाग प्रति हजार (पीपीटी) ~ 27 है।
    2. RNase गतिविधि को रोकने के लिए तरल नाइट्रोजन में 1.5 एमएल ट्यूबों को फ्रीज करें। कुल आरएनए आइसोलेशन किट से 30 μL लाइसिस बफर जोड़ें जिसमें 2-मर्काप्टोएथेनॉल (1 μL/ 100 μL लाइसिस बफर) जोड़ा गया है और एक होमोजेनाइज़र का उपयोग करके लाइसिस बफर में नमूनों को समरूप करें।
      नोट: ट्यूबों से बफर और नमूने के अतिप्रवाह से बचने के लिए, लाइसिस बफर की थोड़ी मात्रा के साथ समरूपीकरण की सिफारिश की जाती है।
    3. लाइसिस बफर के 570 μL जोड़ें और कुल आरएनए अलगाव किट (चित्रा 1) के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए कुल आरएनए निकालें।
    4. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निकाले गए आरएनए की एकाग्रता को मापें और उपयोग होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. सीडीएनए संश्लेषण
    1. एक किट का उपयोग करके, एक टेम्पलेट के रूप में मेडुसे से निकाले गए कुल आरएनए का उपयोग करके सीडीएनए को संश्लेषित करें (चित्रा 1 और तालिका 1)।
    2. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. बर्फ पर तेजी से ठंडा करें।
    4. चरण 1.2.1 (तालिका 1) से मिश्रण के साथ सीडीएनए संश्लेषण करें। पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और 60 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. बर्फ पर तेजी से ठंडा करें।
    7. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संश्लेषित सीडीएनए की एकाग्रता को मापें और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर या उससे नीचे स्टोर करें।
  3. पीसीआर उत्पाद संश्लेषण
    1. पीसीआर टेम्पलेट बनाने के लिए, प्राइमर-ब्लास्ट का उपयोग करके विशिष्ट प्राइमर डिज़ाइन करें। एनसीबीआई डेटा या आरएनए-सेक डेटा से संदर्भ अनुक्रम स्रोत।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    2. लक्ष्य अनुक्रम को बढ़ाने के लिए, टीए क्लोनिंग करें, जिसके लिए प्रतिबंध एंजाइमों के उपयोग की आवश्यकता नहीं होती है। एक पीसीआर उत्पाद प्राप्त करने के लिए जिसमें 3 ' अंत में एक एडेनिन जोड़ा जाता है, निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: 2 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए 55-60 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। प्रतिक्रियाओं के लिए टैक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करें (तालिका 1)।
      नोट: पीसीआर स्थितियों को निर्धारित करने के लिए, उपयोग किए जाने वाले डीएनए पोलीमरेज़ के साथ प्रोटोकॉल का पालन करें, जो आम तौर पर अनुशंसित एनीलिंग तापमान और विस्तार समय प्रदान करता है।
    3. पीसीआर उत्पाद को 1% अगारोस जेल के माध्यम से चलाएं और ब्याज के बैंड को काट दें। जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके कटे हुए जैल से पीसीआर उत्पादों को निकालें।
  4. बंधाव
    1. पीसीआर उत्पाद को अभिकर्मकों (तालिका 1) को मिलाकर 3 'थाइमिन ओवरहैंग्स के साथ वेक्टर में ले जाएं और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (चित्रा 1)।
      नोट: वेक्टर: पीसीआर का आणविक अनुपात 1: >3 होना चाहिए। पीटीए 2 वेक्टर आकार लगभग 3 केबी है। यदि पीसीआर उत्पाद (सम्मिलित) A (kb) और B (ng/μL) है, तो सम्मिलित किए जाने वाले सम्मिलित ( तालिका 1 में X) की मात्रा की गणना ([वेक्टर का 50 ng × सम्मिलित का A kb])/(3 kb वेक्टर × [1/3]) = 50 द्वारा की जा सकती है। डालने का एक तरीका। यदि सम्मिलित करने की सांद्रता B ng/μL है, तो लिया गया आयतन 50 · है। A/B μL डालने का.
  5. परिवर्तन और चढ़ाना
    1. परिवर्तन के लिए, बर्फ पर सक्षम कोशिकाओं को पिघलाएं और उन्हें प्रत्येक में 20 μL एलिकोट में वितरित करें। पीसीआर उत्पाद (सक्षम सेल वॉल्यूम के 5% से कम) और 1 सेकंड के लिए भंवर युक्त प्लास्मिड का 1 μL जोड़ें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें, और फिर 45 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस और 1 सेकंड के लिए भंवर पर इनक्यूबेट करें।
    2. सक्षम कोशिकाओं में कैटाबोलाइट दमन (एसओसी) माध्यम (एक पौष्टिक रूप से समृद्ध जीवाणु संस्कृति माध्यम) के साथ सुपर ऑप्टिमल शोरबा का 180 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 30 मिनट के बाद, सक्षम कोशिकाओं को एम्पीसिलीन, 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल-बीटा-डी-गैलेक्टो-पाइरानोसाइड (एक्स-गैल), और आइसोप्रोपिल-β-डी-1-थियोगलैक्टोपायरानोसाइड (आईपीटीजी) युक्त एगर प्लेट पर फैलाएं, और 12-16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (चित्रा 1)।
      नोट: एक्स-गैल और आईपीटीजी का उपयोग नीले और सफेद कॉलोनियों का चयन करने के लिए किया जाता है।
  6. तरल संस्कृति
    1. प्लेट पर सफेद और नीली कॉलोनियों में से एक सफेद कॉलोनी चुनें। इसे एम्पीसिलीन के साथ एलबी माध्यम के 3-5 एमएल में जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 12-16 घंटे के लिए शेकर पर इनक्यूबेट करें (चित्रा 1)।
  7. मिनीप्रेप
    1. प्लास्मिड मिनीप्रेप (चित्रा 1) का उपयोग करके एलबी माध्यम से प्लास्मिड निकालें।
    2. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्लास्मिड एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  8. अनुक्रम पढ़ें।
    1. प्लास्मिड के डीएनए अनुक्रम को पढ़ने के लिए, प्लास्मिड को सेंगर अनुक्रमण के लिए भेजें और फिर इसे जीनोम / ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रम के साथ संरेखित करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि लक्ष्य अनुक्रम ठीक से संश्लेषित है या नहीं और यह आकलन करें कि लक्ष्य अनुक्रम को प्लास्मिड (5' से 3' या 3' से 5') में किस दिशा में डाला गया है।
      नोट: यदि लक्ष्य अनुक्रम को 3' अंत के पास आरएनए पोलीमरेज़ बाइंडिंग साइट से 5 ' से 3 ' दिशा में प्लास्मिड में डाला जाता है, तो इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा एक एंटीसेंस जांच उत्पन्न की जा सकती है। यदि लक्ष्य अनुक्रम को रिवर्स 3 ' से 5 ' दिशा में डाला जाता है, तो एक सेंस प्रोब (नकारात्मक नियंत्रण) उत्पन्न हो सकता है। यदि पीटीए 2 जैसे वैक्टर का उपयोग करते हैं, तो उद्देश्य के आधार पर दो प्रतिलेखन बाध्यकारी साइटों का उपयोग किया जा सकता है।
  9. इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन
    1. प्लास्मिड में आरएनए पोलीमरेज़ बाइंडिंग साइट (जैसे, टी 7 / टी 3 बाइंडिंग साइटों) के बाहर प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर का प्रदर्शन करके बनाए गए प्लास्मिड से डीएनए टेम्पलेट तैयार करें (चित्रा 1)।
      नोट: यूनिवर्सल प्राइमर जैसे एम 13-20 फॉरवर्ड प्राइमर और एम 13 रिवर्स प्राइमर का उपयोग डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के लिए किया जा सकता है जिसमें आरएनए पोलीमरेज़ बाइंडिंग साइट्स शामिल हैं।
    2. पीसीआर निष्कर्षण किट का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन के बाद टेम्पलेट को शुद्ध करें।
    3. नीचे दिखाए गए अभिकर्मकों को मिलाएं, और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिलेखन प्रतिक्रिया करें (चित्रा 1 और तालिका 1)।
    4. DNase का 1.5 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
    5. 10 μL RNase-मुक्त पानी जोड़ें और एक क्लीन-अप कॉलम का उपयोग करके प्रतिलेखन प्रतिक्रिया समाधान से जांच को शुद्ध करें।
    6. 1% अगारोस जेल पर 1 μL लोड करके संश्लेषित आरएनए के आकार की जांच करें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकाग्रता निर्धारित करें।
      नोट: संश्लेषित आरएनए जांच में कम से कम 100 एनजी /
    7. -20 डिग्री सेल्सियस पर या उससे नीचे भंडारण के लिए फॉर्मामाइड का 30 μL जोड़ें।

2. ईडीयू निगमन और निर्धारण

  1. क्लैडोनेमा मेडुसे (प्रति ट्यूब 5-10 जानवर) को 3.5 एमएल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके 1.5 एमएल ट्यूबों में रखें और 500 μL की कुल मात्रा तक ASW जोड़ें। 10 mM EdU स्टॉक समाधान का 7.5 μL जोड़ें और नमूनों को 22 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें (चित्रा 2)। ईडीयू अंतिम एकाग्रता 150 μM है।
    नोट: तीसरी शाखा के गठन की निगरानी के लिए 5-7 दिन पुराने मेडुसे का उपयोग करें (चित्रा 3 ए)। जिस दिन मेदुसे पॉलीप से अलग हो जाता है, उसे दिन 1 के रूप में गिना जाता है, और दिन 5 पर, मेडुसे आमतौर पर अपने मुख्य तम्बू पर एक तीसरी शाखा प्रदर्शित करना शुरू कर देता है।
  2. 1 घंटे के बाद, जितना संभव हो उतना एएसडब्ल्यू हटा दें।
  3. मेडुसे को एनेस्थेटाइज करने के लिए, एच2 ओ में 7% एमजीसीएल2जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. H2 O में 7% MgCl2को हटा दें और ASW में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) के साथ रात भर (O.N.) पर मेडुसे (O.N.) को ठीक करें (चित्रा 2)।
    नोट: ईडीयू निगमन के बिना मछली का प्रदर्शन करते समय, नमूने एनेस्थेटाइजेशन (चरण 2.3-2.4) के बाद ईडीयू के साथ इलाज किए गए लोगों के समान तय किए जा सकते हैं।

3. फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण

  1. प्रोटीन उपचार और पोस्ट फिक्सेशन
    1. पीएफए को हटा दें और 3 x 10 मिनट के लिए 0.1% ट्वीन -20 (पीबीएसटी) युक्त पीबीएस के साथ नमूने धो लें। प्रति धोने के लिए 300-500 μL PBST का उपयोग करें।
      नोट: इस चरण से संकरण के अंत तक, प्रयोग को एक आरएनएस-मुक्त वातावरण में किया जाना चाहिए, दस्ताने और मास्क पहनना चाहिए। इस चरण में 1x PBS को DEPC-उपचारित पानी के साथ बनाया जाना चाहिए। संकरण के बाद, डीईपीसी उपचार के बिना पानी से बने 1x PBS का उपयोग किया जा सकता है। कुछ आईएसएच और फिश प्रोटोकॉल मेथनॉल चरणों का उपयोग करके नमूनों को निर्जलित करते हैं, जिससे उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर निश्चित नमूनों को सहेजना संभव हो जाता है। अनावश्यक काम से बचने के लिए, निर्जलीकरण प्रक्रिया को इस प्रोटोकॉल से हटा दिया जाता है, खासकर जब से नमूने कुछ दिनों तक पीबीएसटी में रखे जा सकते हैं।
    2. निर्धारण के बाद, नमूना को एक शेकर पर 1.5 एमएल ट्यूबों में रखें, एंटी-डीआईजी-पीओडी एंटीबॉडी ओ.एन. इनक्यूबेशन चरण (चरण 3.4.2) को छोड़कर। धोने के बाद, पीबीएसटी में 10 मिलीग्राम / एमएल प्रोटीनेज के स्टॉक समाधान जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन के (अंतिम एकाग्रता: 10 μg / mL) के साथ मेडुसे को इनक्यूबेट करें।
    3. प्रोटीन के समाधान को हटा दें और नमूने को पीबीएसटी के साथ 2 x 1 मिनट के लिए धो लें।
    4. मेडुसे को पोस्टफिक्स करने के लिए, 1x PBS में 4% PFA जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
    5. पीएफए समाधान निकालें और नमूने को पीबीएसटी के साथ 2 x 10 मिनट के लिए धो लें।
      नोट: यदि लक्ष्य जीन को कम पृष्ठभूमि संकेत के साथ अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, तो चरण 3.1.2-3.1.5 को छोड़ा जा सकता है।
  2. संकरण
    1. पीबीएसटी को हटा दें और हाइब्रिडाइजेशन बफर (एचबी बफर, तालिका 1) जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए एचबी बफर में नमूने इनक्यूबेट करें। एचबी बफर के 300-400 μL का उपयोग करें, जो सफल संकरण के लिए पर्याप्त मात्रा प्रदान करता है।
      नोट: एचबी बफर, वॉश बफर 1, और वॉश बफर 2 20 एक्स एसएससी स्टॉक के साथ तैयार किए जाते हैं। एचबी बफर को -20 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे संग्रहीत किया जाता है और उपयोग से पहले आरटी में लाया जाना चाहिए।
    2. एचबी बफर निकालें और नया एचबी बफर जोड़ें। संकरण इनक्यूबेटर में कम से कम 2 घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहाइब्रिडाइज करें।
    3. एचबी बफर को हटा दें और एचबी बफर के साथ इनक्यूबेट करें जिसमें चरण 1.9.7 में संग्रहीत जांच शामिल है (अंतिम जांच एकाग्रता: एचबी बफर में 0.5-1 एनजी / संकरण इनक्यूबेटर में 18-24 घंटे (चित्रा 2) के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर संकरण करें।
      नोट: मछली संकेत तीव्रता और विशिष्टता लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति, साथ ही जांच लंबाई और विशिष्टता के कारण भिन्न हो सकती है। तीव्रता बढ़ाने के लिए, संकरण अवधि (18-72 घंटे) और तापमान (50-65 डिग्री सेल्सियस) जैसे मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है, और विभिन्न जांचों का परीक्षण किया जा सकता है। गैर-विशिष्ट संकेतों से बचने के लिए, प्रोटीन के उपचार (एकाग्रता और अवधि)को संशोधित किया जा सकता है।
  3. जांच हटाने की मांग
    1. जांच युक्त एचबी बफर निकालें, और फिर वॉश बफर 1 (तालिका 1) जोड़ें। 55 डिग्री सेल्सियस पर 2 x 15 मिनट के लिए वॉश बफर 1 के साथ नमूने धोएं। वॉश बफर के 300-400 μL का उपयोग करें।
      नोट: एचबी बफर युक्त जांच का उपयोग बार-बार किया जा सकता है, लगभग दस बार तक। छोड़ने के बजाय, इस्तेमाल किए गए एचबी बफर को -20 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे जांच वाले स्टोर करें। उपयोग से पहले 55 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट वॉश बफर 1, वॉश बफर 2, 2एक्स एसएससी और पीबीएसटी।
    2. वॉश बफर 1 निकालें, और फिर वॉश बफर 2 (तालिका 1) जोड़ें। 55 डिग्री सेल्सियस पर 2 x 15 मिनट के लिए वॉश बफर 2 के साथ नमूने धोएं।
    3. वॉश बफर 2 निकालें, और फिर 2x SSC जोड़ें। नमूने को 2x SSC के साथ 2x 15 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर धो लें।
    4. 2x SSC निकालें, और तब पहले से गरम PBST जोड़ें। आरटी पर पीबीएसटी के साथ 1 x 15 मिनट के लिए नमूने धो लें।
  4. एंटी-डीआईजी एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. PBST निकालें, और फिर 1% ब्लॉकिंग बफर जोड़ें। एक रॉकर पर धीरे-धीरे हिलाते हुए आरटी में कम से कम 1 घंटे के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
      नोट: 5% ब्लॉकिंग बफर स्टॉक को पतला करके 1% ब्लॉकिंग बफर को ताजा तैयार करें (तालिका 1)। अगली एंटीबॉडी प्रतिक्रिया से पहले नमूनों की जांच करें क्योंकि झटकों के परिणामस्वरूप नमूना ढक्कन या दीवार के पीछे चिपक जाता है।
    2. ब्लॉक करने के बाद, 1% ब्लॉकिंग बफर को हटा दें, एंटी-डीआईजी-पीओडी समाधान जोड़ें (1: 500, 1% ब्लॉकिंग बफर में), और नमूने ओ.एन. को 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (चित्रा 2)।
      नोट: गैर-विशिष्ट संकेतों का पता लगाने से रोकने के लिए 12-16 घंटे के भीतर इनक्यूबेशन समय रखने के लिए सावधान रहें।
  5. डीआईजी लेबल की जांच का पता लगाना
    1. एंटी-डीआईजी-पीओडी समाधान निकालें, और फिर Tris-NaCl-ट्वीन बफर (TNT, तालिका 1) जोड़ें। आरटी पर 3 x 10 मिनट के लिए टीएनटी के साथ नमूने धोएं।
      नोट: टायरामाइड सिग्नल एम्प्लीफिकेशन (टीएसए) तकनीक का उपयोग हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-लेबल अभिकर्मकों (जैसे, एंटी-डीआईजी-पीओडी) के खिलाफ एक बेहतर रिज़ॉल्यूशन छवि प्रदान करता है।
    2. सक्रिय Cy5-tyramide समाधान (चित्रा 2) बनाने के लिए प्रवर्धन डिल्यूएंट बफर में पतला फ्लोरोसेंट डाई-संयुग्मित टायरामाइड (Cy5-tyramide) स्टॉक समाधान (1: 50)।
    3. जितना संभव हो उतना TNT निकालें, और फिर सक्रिय Cy5-टायरामाइड समाधान जोड़ें। अंधेरे में 10 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    4. नमूने को अंधेरे में 3 x 10 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ धो लें।
  6. ईडीयू का पता लगाना
    नोट: ईडीयू किट फ्लोरोसेंट सिग्नल (चित्रा 2) के रूप में शामिल ईडीयू का पता लगाता है।
    1. ईडीयू डिटेक्शन कॉकटेल तैयार करने के लिए, तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार घटकों को मिलाएं। प्रत्येक नमूने के लिए ईडीयू डिटेक्शन कॉकटेल के 100 μL का उपयोग करें।
      नोट: अल्ट्राप्योर पानी के साथ 10x रिएक्शन बफर एडिटिव को पतला करके 1x रिएक्शन बफर एडिटिव तैयार करें।
    2. पीबीएसटी निकालें, और फिर ईडीयू डिटेक्शन कॉकटेल जोड़ें। 30 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
    3. अंधेरे में 3 x 10 मिनट के लिए पीबीएसटी से धो लें।
  7. डीएनए धुंधला होना
    1. होचस्ट समाधान तैयार करने के लिए पीबीएसटी में होचस्ट 33342 (1: 500) को पतला करें। PBST निकालें, और उसके बाद Hoechst समाधान जोड़ें। अंधेरे में 30 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें (चित्रा 2)।
    2. नमूने को अंधेरे में 3-4 x 10 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ धो लें।
  8. बढ़ता हुआ
    1. नमूने को कुचलने से रोकने के लिए ग्लास स्लाइड पर एक बैंक बनाएं। ग्लास स्लाइड पर विनाइल टेप लागू करें और केंद्र को खोखला करें।
    2. टिप कट ऑफ के साथ 3.1 एमएल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके स्लाइड ग्लास पर मेडुसे को बैंक में स्थानांतरित करें।
      नोट: सावधान रहें कि तम्बू को ओवरलैप न होने दें।
    3. पी 200 पिपेट के साथ किसी भी पीबीएसटी को हटा दें, और फिर धीरे-धीरे बढ़ते माध्यम के रूप में 70% ग्लिसरॉल जोड़ें (चित्रा 2)।
      नोट: 70% ग्लिसरॉल के बजाय, प्रतिदीप्ति को लुप्त होने से रोकने के लिए एंटी-लुप्त माउंटिंग माध्यम का उपयोग किया जा सकता है।
    4. धीरे से मेडुसे पर एक कवरस्लिप रखें, और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारे को सील करें।
    5. यदि तुरंत माइक्रोस्कोपी अवलोकन नहीं किया जाता है तो स्लाइड को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  9. इमेजिंग
    1. छवियों को प्राप्त करने के लिए लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन के लिए, उच्च आवर्धन के लिए 40x तेल लेंस या लेंस का उपयोग करें।
    2. छवि अधिग्रहण के बाद, इमेजजे / फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों को खोलें और मल्टीपॉइंट टूल20 द्वारा ईडीयू + और / या नैनोस 1 + के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की गणना करें।

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Representative Results

क्लैडोनेमा टेंटेकल्स का उपयोग मॉर्फोजेनेसिस और पुनर्जनन15,16,17 की सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया गया है। तम्बू संरचना एक उपकला ट्यूब से बनी होती है जहां स्टेम जैसी कोशिकाएं, या आई-कोशिकाएं समीपस्थ क्षेत्र में स्थित होती हैं, जिन्हें तम्बू बल्ब कहा जाता है, और नई शाखाओं को क्रमिक रूप से अक्षीय पक्ष (चित्रा 3 ए) 15 के साथ बल्ब के बाहर के क्षेत्र के पीछे जोड़ा जाता है। पिछली रिपोर्टों ने संकेत दिया है कि सेल प्रसार तम्बू बल्ब और नई शाखाओं की साइटों पर ईडीयू या बीआरडीयू लेबलिंग16,17 का उपयोग करके सक्रिय है। हालांकि, सीटू संकरण के समाधान के कारण, यह स्पष्ट नहीं है कि स्टेम जैसी कोशिकाएं वास्तव में प्रोलिफेरेटिव हैं या नहीं। सेलुलर स्तर पर एक साथ स्टेम जैसी और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं दोनों की कल्पना करने के लिए, हमने स्टेम सेल मार्करों (नैनोस 1 या पिवी) के लिए फिश और एक ही नमूने में एस चरण कोशिकाओं के लिए ईडीयू लेबलिंग का प्रदर्शन किया।

फिश द्वारा सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर, नैनोस 1 की अभिव्यक्ति को टेंटेकल बल्ब और नई ब्रांचिंग साइट (चित्रा 3 बी) पर स्थानीयकृत किया गया था। पिवी को टेंटेकल बल्ब में और नई ब्रांचिंग साइट पर नैनोस 1 (चित्रा 3 सी) के समान पैटर्न में भी व्यक्त किया गया था। ये परिणाम पिछली रिपोर्ट17 में सीटू संकरण में पूरे-माउंट के अवलोकनों के अनुरूप थे, जहां 7 दिन पुराने मेडुसा की उभरती शाखा को नैनोस 1 और पिवी द्वारा लगभग समान रूप से लेबल किया गया था। स्टेम जैसी कोशिकाओं के संचय की शुरुआत की कल्पना करने के लिए, हमने 5 दिन पुराने मेडुसा की नई ब्रांचिंग साइट की निगरानी की। नैनोस 1 अभिव्यक्ति और ईडीयू-पॉजिटिव कोशिकाओं के सह-लेबलिंग ने तम्बू में स्टेम जैसी कोशिकाओं और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं के स्थानिक पैटर्न का खुलासा किया (चित्रा 4 ए)। यद्यपि EdU+ और Nanos1+ कोशिकाओं का सकल वितरण पिछली रिपोर्ट16,17 के अनुरूप था, EdU + कोशिकाओं को कम से कम शाखाओं की शुरुआत में पूरे तम्बू बल्ब में अधिक व्यापक रूप से वितरित किया गया था, जबकि Nanos1+ कोशिकाएं तम्बू बल्ब और नई शाखाओं की साइट (चित्रा 4A और चित्रा 4E) पर अधिक स्थानीय रूप से जमा हुईं । ). इन अवलोकनों से पता चलता है कि विकास के समय और विभिन्न चरणों के आधार पर स्टेम जैसी कोशिकाओं और प्रसार कोशिकाओं के अलग-अलग वितरण का पता लगाया जाता है।

बल्ब और नई शाखाओं की साइट के अधिक विस्तृत दृश्य से पता चला कि ईडीयू सिग्नल परमाणु धुंधलापन के साथ विलय हो जाते हैं, जबकि नैनोस 1 अभिव्यक्ति नाभिक के आसपास के साइटोप्लाज्म तक सीमित होती है, जो पिछली रिपोर्ट5 (चित्रा 4 बी, सी) के अनुरूप है। कोशिकाओं के एक अंश (19.79%) ने ईडीयू और नैनोस 1 (ईडीयू + नैनोस 1 +) के सह-लेबलिंग का प्रदर्शन किया; चित्रा 4 बी, सी, पीले तीर के निशान, और चित्रा 4 डी), यह सुझाव देते हुए कि ये कोशिकाएं सक्रिय रूप से प्रसार स्टेम सेल आबादी हैं। दिलचस्प रूप से, 14.46% कोशिकाओं को बल्ब के बीच में और नई शाखाओं की साइट पर ईडीयू + नैनोस 1 - पाया गया, जो गैर-स्टेम जैसी प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं (चित्रा 4 बी, सी, सफेद तीर और चित्रा 4 डी) की उपस्थिति का सुझाव देता है। इसके विपरीत, बल्ब के आधार पर और नई शाखाओं की साइट पर 26.32% कोशिकाओं को ईडीयू- नैनोस 1 + के रूप में देखा गया, जो एक स्टेम सेल आबादी की उपस्थिति को दर्शाता है जो या तो धीमी गति से साइकिल चला रहा है या क्विसेंट है, जिनमें से कोई भी ईडीयू पल्स लेबलिंग (चित्रा 4 बी, सी, पीले तीर और चित्रा 4 डी) द्वारा पता नहीं लगाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: सीटू संकरण के लिए जांच संश्लेषण की योजना। मेडुसे से कुल आरएनए का निष्कर्षण और कुल आरएनए से सीडीएनए संश्लेषण। नैनोएस 1-विशिष्ट पीसीआर उत्पादों को सीडीएनए से संश्लेषित किया गया था। पीसीआर उत्पादों को वैक्टर में शामिल किया गया था, और प्रवर्धित वैक्टर सक्षम सेल संस्कृति के माध्यम से एकत्र किए गए थे। आरएनए पोलीमरेज़ बाइंडिंग साइटों के साथ पीसीआर उत्पादों को टेम्पलेट्स के रूप में प्लास्मिड का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। डीआईजी-लेबल आरएनए जांच को इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन द्वारा संश्लेषित किया गया था। संक्षिप्तरूप: डीआईजी = डिगॉक्सिजेनिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ईडीयू और फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण सह-धुंधलापन की योजना। मेडुसे को 1 घंटे के लिए 150 μM EdU के साथ इनक्यूबेट किया गया था। इसके बाद, मेडुसे को एच2ओ में 7% एमजीसीएल2 के साथ एनेस्थेटाइज्ड (ऊतक को आराम करने के लिए) किया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए ओएन के साथ तय किया गया। निर्धारण के बाद, नमूनों को 55 डिग्री सेल्सियस पर 20-24 घंटे के लिए जांच के साथ एचबी बफर के साथ संकरण किया गया था। संकरण प्रतिक्रिया के बाद, नमूनों को धोया गया और 4 डिग्री सेल्सियस पर एंटी-डीआईजी-पीओडी समाधान ओ.एन. के साथ इनक्यूबेट किया गया। मेडुसे को 10 मिनट के लिए Cy5-tyramide समाधान के साथ दाग दिया गया था, इसके बाद 30 मिनट के लिए ईडीयू का पता लगाया गया और 30 मिनट के लिए Hoechst 33342 के साथ धुंधला किया गया। सभी धुंधला प्रक्रियाओं को पूरा करने के बाद, मेडुसे को ग्लास स्लाइड पर रखा गया था, और छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया था। संक्षिप्तरूप: ईडीयू = 5-एथिनिल -2'-डीऑक्सीयूरिडिन; मछली = सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट; पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड; ओ.एन. = रातोंरात; एचबी = संकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: क्लैडोनेमा मेडुसा टेंटेकल के समीपस्थ अक्षीय पक्ष पर नैनोस 1 और पिवी अभिव्यक्ति पैटर्न। तम्बू का अक्षीय पक्ष: नई शाखाओं के साथ तम्बू बल्ब (सबसे समीपस्थ क्षेत्र) क्रमिक रूप से नई शाखाओं की साइट पर बनता है। इनसेट (डैश्ड स्क्वायर) कॉन्फोकल छवि द्वारा कैप्चर किए गए क्षेत्र को इंगित करता है। (बी) 7 दिन पुराने क्लैडोनेमा मेडुसा के तम्बू के समीपस्थ, अक्षीय पक्ष से नैनोस 1 जीन अभिव्यक्ति की मछली छवियां। (सी) 7 दिन पुराने क्लैडोनेमा मेडुसा के तम्बू के समीपस्थ, अक्षीय पक्ष से पिवी जीन अभिव्यक्ति की मछली छवियां। डीएनए: हरा, नैनोस 1: मैजेंटा। नैनोस 1 मछली के लिए बी'-सी' केवल छवियां। स्केल सलाखों = 100 μm (B, C)। संक्षिप्त नाम: मछली = सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: क्लैडोनेमा मेडुसा टेंटकल के समीपस्थ, अक्षीय पक्ष पर ईडीयू और नैनोस 1 अभिव्यक्ति पैटर्न। (ए-सी) क्लैडोनेमा मेडुसा टेंटेकल के समीपस्थ अक्षीय पक्ष की छवियां नैनोस 1 अभिव्यक्ति और ईडीयू के साथ सह-लेबल; 5 दिन के मेडुसे का इस्तेमाल किया गया। (ए) तम्बू का अवलोकन। पीले धराशायी वर्ग बी और सी के क्षेत्रों को इंगित करते हैं। (बी) तम्बू बल्ब का आवर्धन। (ग) एक नई शाखा स्थल का आवर्धन। पीले तीर के निशान उन कोशिकाओं को इंगित करते हैं जो ईडीयू और नैनोस 1 दोनों के लिए सकारात्मक हैं। पीले तीर उन कोशिकाओं को इंगित करते हैं जो केवल नैनोस 1 के लिए सकारात्मक हैं। सफेद तीर कोशिकाओं को केवल ईडीयू के लिए सकारात्मक संकेत देते हैं। ए-सी पैनल डीएनए (नीला), ईडीयू (हरा), और नैनोस 1 (मैजेंटा) के लिए विलय छवियां हैं। ए'-सी' केवल ईडीयू छवियों के लिए पैनल हैं; ए'-सी' नैनोस 1 मछली केवल छवियों के लिए हैं। स्केल सलाखों = 100 μm (A), 50 μm (B, C)। (डी) टेंटकल के बेसल साइड में ईडीयू- और / या नैनोस 1-पॉजिटिव कोशिकाओं का परिमाणीकरण (परिमाणीकरण क्षेत्र = 30.10 μm2 वर्ग, n = 6, कुल 249 कोशिकाएं)। ईडीयू + नैनोस 1 − कोशिकाएं, 14.46%; ईडीयू + नैनोस 1 + कोशिकाएं, 19.79%; ईडीयू - नैनोस 1 + कोशिकाएं, 26.32%; ईडीयू - नैनोस 1 − कोशिकाएं, 39.44%। (ई) अक्षीय पक्ष से क्लैडोनेमा मेडुसा टेंटेकल की योजनाबद्धता। ईडीयू + कोशिकाओं और नैनोस 1 + कोशिकाओं का समग्र वितरण क्रमशः ई और ई में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में विभिन्न पीसीआर प्रतिक्रियाओं और बफर की संरचना। लिगेशन प्रतिक्रिया में पीसीआर उत्पाद (एक्स 1एल) की मात्रा की गणना करने के लिए, प्रोटोकॉल चरण 1.4 के बाद नोट देखें। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोलिफ़ेरिंग सेल और स्टेम सेल विभिन्न प्रक्रियाओं जैसे मोर्फोजेनेसिस, विकास और पुनर्जनन21,22 में महत्वपूर्ण सेलुलर स्रोत हैं। यह पेपर क्लैडोनेमा मेडुसे में फिश और ईडीयू लेबलिंग द्वारा स्टेम सेल मार्कर नैनोस 1 को सह-धुंधला करने की एक विधि का वर्णन करता है। ईडीयू या बीआरडीयू लेबलिंग का उपयोग करके पिछले काम ने सुझाव दिया है कि प्रोलिफेरेटिव कोशिकाएंतम्बू बल्ब 16,17 के लिए स्थानीयकृत होती हैं, लेकिन उनकी आणविक विशेषताएं स्पष्ट नहीं थीं। वर्तमान अध्ययन प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं के वितरण और नैनोस 1 + स्टेम जैसी कोशिकाओं के स्थानीयकरण के एक साथ निर्धारण को दर्शाता है (चित्रा 4)। परिणामों से पता चला है कि कुछ प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं ने नैनोस 1 व्यक्त किया, लेकिन अन्य कोशिकाओं को केवल ईडीयू के साथ चिह्नित किया गया था और नैनोस 1 को व्यक्त नहीं किया गया था, जो स्टेम सेल विषमता या संभावित रूप से, अन्य प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं के अस्तित्व का सुझाव देता है। क्लैडोनेमा में विभिन्न प्रक्रियाओं के दौरान विस्तृत स्टेम सेल वितरण का विच्छेदन करना दिलचस्प होगा, जिसमें तम्बू शाखाएं, ऊतक होमियोस्टेसिस, अंग पुनर्जनन और रोगाणु कोशिका रखरखाव शामिल हैं।

जानवरों में स्टेम कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए प्रमुख बाधा स्टेम सेल मार्करों की प्रारंभिक पहचान है। निडारियन में, स्टेम सेल मार्करों की पहचान गैर-हाइड्रोज़ोन्स3 में नहीं की गई है, और इस प्रकार, इस स्तर पर, स्टेम सेल मार्करों के लिए फिश का प्रत्यक्ष अनुप्रयोग हाइड्रोज़ोन्स तक सीमित रहता है। फिर भी, फिश सेलुलर स्तर पर विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने की अनुमति देता है, और इस प्रकार, जांच को बदलकर, इस विधि को विस्तार से रुचि के किसी भी जीन के स्थानिक अभिव्यक्ति पैटर्न का निरीक्षण करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पूर्वज कोशिकाओं और विभेदित कोशिकाओं के मार्करों का उपयोग करके, हम क्लैडोनेमा तम्बू में विशिष्ट सेल प्रकारों के वितरण को सत्यापित कर सकते हैं। एक चेतावनी के रूप में, अभिव्यक्ति के स्तर और एमआरएनए स्थिरता में अंतर के कारण रुचि के जीन के आधार पर वर्तमान प्रोटोकॉल को संशोधित करना पड़ सकता है। विशेष रूप से, गैर-विशिष्ट संकेत और कमजोर संकेत मछली से जुड़ी सामान्य समस्याएं हैं। संकरण समय और तापमान को बदलना, ब्लीचिंग अभिकर्मकों (फॉर्मामाइड या मेथनॉल) का उपयोग करना, और अन्य मापदंडों (टीएसए प्रतिक्रिया समय, प्रोटीनेज के उपचार, संकरण के बाद धोना) को समायोजित करना स्पष्ट संकेत और कम गैर-विशिष्ट संकेत23,24 प्राप्त कर सकता है। उपयोग किए जा रहे पशु मॉडल के लिए उपयुक्त मछली प्रोटोकॉल का चयन करना भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक मछली प्रोटोकॉल अन्य प्रजातियों पर लागू नहीं हो सकता है, यहां तक कि एक ही टैक्सन 7,25,26 के भीतर भी।

ईडीयू लेबलिंग का उपयोग आमतौर पर प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया जाता है, लेकिन एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय27 को बदलकर विभिन्न प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए उपयोग किया जा सकता है। प्रसार कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, ईडीयू निगमन के लिए एक सफल अवधि और एकाग्रता निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। इस काम में उपयोग की जाने वाली पल्स लेबलिंग में, केवल प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को चिह्नित किया गया था जो थोड़े समय के लिए एस चरण से गुजरते थे, और इसी तरह के लघु इनक्यूबेशन विधियों का उपयोग अन्य निडारियन 6,28,29 में प्रसार कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया गया है। इसके विपरीत, लंबे समय तक ईडीयू निगमन और नैनोस 1 फिश के संयोजन से धीमी गति से साइकिल चलाने या क्विसेंट स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति का पता चलसकता है। न केवल प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं को चिह्नित करना संभव है, बल्कि एंडोसाइक्लिंग कोशिकाएं भी हैं जो विभाजन के बिना डीएनए संश्लेषण से गुजरी हैं। इसके अलावा, लंबी अवधि के लिए ईडीयू-लेबल कोशिकाओं को ट्रैक करके, हम प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं और उनके सेल वंश 6,30 से जुड़े प्रवास और भेदभाव के लिए सेलुलर क्षमता निर्धारित कर सकते हैं।

जबकि फिश और ईडीयू या बीआरडीयू स्टेनिंग के संयोजन का उपयोग 7,31 किया गया है, यहां स्थापित विधि को आसानी से अन्य समुद्री अकशेरुकी और गैर-मॉडल जानवरों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें विभिन्न जेलीफिश प्रजातियां शामिल हैं। ईडीयू धुंधला18 की तुलना में सरल और अधिक संवेदनशील है, और इसके कम समय इनक्यूबेशन के साथ, यह पिछले अध्ययन के विपरीत प्रसार कोशिकाओं का पता लगाने में सक्षम बनाता है, जिसमें दीर्घकालिक सेल लेबलिंग7 के लिए ईडीयू का उपयोग किया गया था। हाल के वर्षों में, अगली पीढ़ी की अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की प्रगति के साथ, जीनोम और जीन अभिव्यक्ति की जानकारी कई प्रजातियों के लिए उपलब्ध हो गई है। स्टेम सेल और प्रोलिफेरेटिव कोशिकाओं की पहचान करना स्टेम सेल विषमता और विविधता को समझने और विभिन्न जैविक घटनाओं को अंतर्निहित सेलुलर गतिशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण जारी रहेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एएमईडी द्वारा अनुदान संख्या जेपी 22 जीएम 6110025 (वाईएन के लिए) और जेएसपीएस काकेन्ही अनुदान संख्या 22 एच 02762 (वाईएन के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

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References

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

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हाइड्रोज़ोन जेलीफिश <em>क्लैडोनेमा पैसिफिकम</em> में स्टेम जैसी कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट इन <em>सीटू</em> हाइब्रिडाइजेशन और 5-एथिनिल -2'-डीऑक्सीयूरिडिन लेबलिंग
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Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. i. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

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