Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Fluorescerende in situ hybridisering og 5-etynyl-2'-deoksyuridinmerking for stamceller i hydrozoan maneter cladonema pacificum

Published: August 3, 2022 doi: 10.3791/64285
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

Summary

Her beskriver vi en protokoll for visualisering av stammelignende prolifererende celler i maneten Cladonema. Helmontert fluorescerende in situ hybridisering med stamcellemarkør muliggjør påvisning av stamcellelignende celler, og 5-etynyl-2'-deoksyuridinmerking muliggjør identifisering av prolifererende celler. Sammen kan aktivt prolifererende stamcellelignende celler detekteres.

Abstract

Cnidarians, inkludert sjøanemoner, koraller og maneter, viser ulike morfologi og livsstil som manifesteres i sessile polypper og frittsvømmende medusae. Som eksemplifisert i etablerte modeller som Hydra og Nematostella, bidrar stamceller og / eller proliferative celler til utvikling og regenerering av cnidarian polypper. Imidlertid er de underliggende cellulære mekanismene i de fleste maneter, spesielt på medusa-stadiet, stort sett uklare, og det er derfor kritisk å utvikle en robust metode for å identifisere spesifikke celletyper. Dette papiret beskriver en protokoll for visualisering av stammelignende prolifererende celler i hydrozoan maneter Cladonema pacificum. Cladonema medusae har forgrenede tentakler som kontinuerlig vokser og opprettholder regenerativ kapasitet gjennom hele voksenstadiet, og gir en unik plattform for å studere de cellulære mekanismene orkestrert av prolifererende og / eller stamceller. Helmontert fluorescerende in situ hybridisering (FISH) ved hjelp av en stamcellemarkør muliggjør påvisning av stamcellelignende celler, mens pulsmerking med 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU), en S-fasemarkør, muliggjør identifisering av prolifererende celler. Ved å kombinere både FISH- og EdU-merking kan vi oppdage aktivt prolifererende stamceller på faste dyr, og denne teknikken kan brukes bredt på andre dyr, inkludert ikke-modellmanetarter.

Introduction

Cnidaria regnes som en basalt forgrening metazoan phylum som inneholder dyr med nerver og muskler, og plasserer dem i en unik posisjon for å forstå utviklingen av dyrs utvikling og fysiologi 1,2. Cnidarians er kategorisert i to hovedgrupper: Anthozoa (f.eks. Sjøanemoner og koraller) har bare planula larver og sessile polyppstadier, mens Medusozoa (medlemmer av Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa og Cubozoa) vanligvis tar form av frittsvømmende medusae, eller maneter, samt planula larver og polypper. Cnidarians viser ofte høy regenerativ kapasitet, og deres underliggende cellulære mekanismer, spesielt deres besittelse av voksne stamceller og proliferative celler, har tiltrukket seg mye oppmerksomhet 3,4. Opprinnelig identifisert i Hydra, er hydrozoan stamceller lokalisert i interstitielle mellomrom mellom ektodermale epitelceller og blir ofte referert til som interstitielle celler eller i-celler3.

Hydrozoiske i-celler deler vanlige egenskaper som inkluderer multipotens, uttrykket av vidt konserverte stamcellemarkører (f.eks. Nanos, Piwi, Vasa) og migrasjonspotensial 3,5,6,7,8. Som funksjonelle stamceller er i-celler i stor grad involvert i utvikling, fysiologi og miljøresponser hos hydrozodyr, noe som vitner om deres høye regenerative kapasitet ogplastisitet. Mens stamceller, som ligner på i-celler, ikke er identifisert utenfor hydrozoer, selv i den etablerte modellarten Nematostella, er proliferative celler fortsatt involvert i vedlikehold og regenerering av somatisk vev, så vel som kimlinjen9. Ettersom studier i cnidarian utvikling og regenerering hovedsakelig har blitt utført på polyp-type dyr som Hydra, Hydractinia og Nematostella, forblir den cellulære dynamikken og funksjonene til stamceller i manetarter stort sett uadressert.

Hydrozomaneten Clytia hemisphaerica , en kosmopolitisk manetart med forskjellige habitater rundt om i verden, inkludert Middelhavet og Nord-Amerika, har blitt brukt som et eksperimentelt modelldyr i flere utviklings- og evolusjonære studier10. Med sin lille størrelse, enkle håndtering og store egg, er Clytia egnet for laboratorievedlikehold, samt for innføring av genetiske verktøy som de nylig etablerte transgenese- og knockoutmetodene11, noe som åpner muligheten for detaljert analyse av de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for manetbiologi. I Clytia medusa tentacle er i-celler lokalisert i den proksimale regionen, kalt pæren, og forfedre som nematoblaster migrerer til distalspissen mens de differensierer i forskjellige celletyper, inkludert nematocytter12.

Under regenerering av Clytia manubrium, det orale organet av maneter, migrerer Nanos1 + i-celler som er tilstede i gonadene til regionen der manubriumet går tapt som svar på skade og deltar i regenerering av manubrium7. Disse funnene støtter ideen om at i-celler i Clytia også oppfører seg som funksjonelle stamceller som er involvert i morfogenese og regenerering. Men gitt at egenskapene til i-celler er forskjellige blant representative polyp-type dyr som Hydra og Hydractinia3, er det mulig at egenskapene og funksjonene til stamceller er diversifisert blant manetarter. Videre, med unntak av Clytia, har eksperimentelle teknikker vært begrenset for andre maneter, og den detaljerte dynamikken til proliferative celler og stamceller er ukjent13.

Hydrozoan maneter Cladonema pacificum er en fremvoksende modellorganisme som kan holdes i et laboratoriemiljø uten vannpumpe eller filtreringssystem. Cladonema medusa har forgrenede tentakler, et vanlig kjennetegn i familien Cladonematidae, og et fotoreseptororgan kalt ocellus på ektodermallaget nær pæren14. Tentakelforgreningsprosessen skjer på et nytt forgreningssted som vises langs den adaksiale siden av tentakelen. Over tid fortsetter tentaklene å forlenge og forgrene seg, med de eldre grenene presset ut mot spissen15. I tillegg kan Cladenamas tentakler regenerere i løpet av få dager ved amputasjon. Nylige studier har antydet rollen som prolifererende celler og stamcellelignende celler i tentakelforgrening og regenerering i Cladonema16,17. Men mens konvensjonell in situ hybridisering (ISH) har blitt brukt til å visualisere genuttrykk i Cladonema, på grunn av sin lave oppløsning, er det for tiden vanskelig å observere stamcelledynamikk på mobilnivå i detalj.

Dette papiret beskriver en metode for å visualisere stamcellelignende celler i Cladonema av FISH og co-farging med EdU, en markør for celleproliferasjon18. Vi visualiserer ekspresjonsmønsteret til Nanos1, en stamcellemarkør 5,17, av FISH, som gjør det mulig å identifisere stamcellelignende cellefordeling på enkeltcellenivå. I tillegg gjør co-farging av Nanos1-uttrykk med EdU-merking det mulig å skille aktivt prolifererende stamceller. Denne metoden for overvåking av både stamceller og proliferative celler kan brukes på et bredt spekter av undersøkelsesområder, inkludert tentakelforgrening, vevhomeostase og organregenerering i Cladonema, og en lignende tilnærming kan brukes på andre manetarter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Se materialtabellen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen.

1. Sondesyntese

  1. RNA-ekstraksjon
    1. Plasser tre levende Cladonema medusae som dyrkes i kunstig sjøvann (ASW) i et 1,5 ml rør ved hjelp av en 3,1 ml overføringspipette med spissen avskåret, og fjern så mye ASW som mulig.
      MERK: ASW fremstilles ved å oppløse en blanding av mineralsalter i vann fra springen med klornøytralisator; den endelige egenvekten (S.G.) er 1.018 eller delene per tusen (ppt) er ~ 27.
    2. Frys 1,5 ml rørene i flytende nitrogen for å hemme RNase-aktiviteten. Tilsett 30 μL lysisbuffer fra det totale RNA-isolasjonssettet der 2-merkaptoetanol (1 μL / 100 μL lysisbuffer) er tilsatt og homogeniser prøvene i lysisbufferen ved hjelp av en homogenisator.
      MERK: For å unngå overløp av bufferen og prøven fra rørene, anbefales homogenisering med en liten mengde lysisbuffer.
    3. Tilsett 570 μL lysisbuffer og trekk ut det totale RNA etter protokollen til det totale RNA-isolasjonssettet (figur 1).
    4. Mål konsentrasjonen av det ekstraherte RNA ved hjelp av et spektrofotometer og oppbevar ved -80 ° C til bruk.
  2. cDNA-syntese
    1. Bruk et sett til å syntetisere cDNA ved hjelp av det totale RNA ekstrahert fra medusae som en mal (figur 1 og tabell 1).
    2. Inkuber ved 65 °C i 5 minutter.
    3. Avkjøl raskt på is.
    4. Utfør cDNA-syntese med blandingen fra trinn 1.2.1 (tabell 1). Bland grundig ved pipettering og inkuber ved 42 °C i 60 minutter.
    5. Inkuber ved 95 °C i 5 minutter.
    6. Avkjøl raskt på is.
    7. Mål konsentrasjonen av det syntetiserte cDNA ved hjelp av et spektrofotometer og oppbevar ved eller under −20 °C til bruk.
  3. PCR-produkt syntese
    1. For å lage en PCR-mal, design den spesifikke primeren ved hjelp av Primer-BLAST. Kilde referansesekvensen fra NCBI-data eller RNA-seq-data.
      MERK: Se materialtabellen for primerne som brukes i denne protokollen.
    2. For å forsterke målsekvensen, utfør TA-kloning, som ikke krever bruk av restriksjonsenzymer. For å få et PCR-produkt der en adenin tilsettes ved 3'-enden, bruk følgende innstillinger: 98 °C i 2 minutter; 35 sykluser på 98 °C i 10 s, 55-60 °C i 30 s, 72 °C i 1 min. Bruk Taq DNA-polymerase til reaksjonene (tabell 1).
      MERK: For å bestemme PCR-forholdene, følg protokollen som følger med DNA-polymerasen som skal brukes, som generelt gir en anbefalt glødetemperatur og forlengelsestid.
    3. Kjør PCR-produktet gjennom en 1% agarosegel og kutt ut båndet av interesse. Trekk ut PCR-produktene fra kuttgelene ved hjelp av et gelekstraksjonssett.
  4. Ligation
    1. Ligate PCR-produktet til vektoren med 3' tyminoverheng ved å blande reagensene (tabell 1) og inkubere ved 37 °C i 30 minutter (figur 1).
      MERK: Det molekylære forholdet mellom vektor: PCR skal være 1: >3. pTA2-vektorstørrelsen er ca. 3 kb. Hvis PCR-produktet (innsats) er A (kb) og B (ng / μL), kan volumet av innsatsen (X i tabell 1) som skal tas, beregnes ved ([50 ng vektor × A kb innsats])/(3 kb vektor × [ 1/3]) = 50 · En ng av innsats. Hvis konsentrasjonen av innsatsen er B ng / μL, er volumet tatt 50 · A/B μL av innsats.
  5. Transformasjon og plating
    1. For transformasjon, tine de kompetente cellene på is og dispensere dem i 20 μL aliquots hver. Tilsett 1 μL av plasmidene som inneholder PCR-produktet (mindre enn 5% av kompetent cellevolum) og virvel for 1 s. Inkuber på is i 5 minutter, og inkuber deretter ved 42 °C i 45 s, og virvel i 1 s.
    2. Tilsett 180 μL Super Optimal buljong med Catabolite repression (SOC) medium (et næringsrikt bakteriekulturmedium) til de kompetente cellene og inkuber ved 37 °C i 30 minutter. Etter 30 minutter sprer du de kompetente cellene på en agarplate som inneholder ampicillin, 5-bromo-4-klor-3-indolyl-beta-D-galakto-pyranosid (X-gal) og isopropyl-β-d-1-tiogalaktopyranosid (IPTG), og inkuberer ved 37 °C i 12-16 timer (figur 1).
      MERK: X-gal og IPTG brukes til å velge blå og hvite kolonier.
  6. Flytende kultur
    1. Plukk en hvit koloni ut av de hvite og blå koloniene på tallerkenen. Tilsett det til 3-5 ml LB-medium med ampicillin og inkuber på en shaker i 12-16 timer ved 37 °C (figur 1).
  7. Miniprep
    1. Trekk ut plasmidet fra LB-mediet ved hjelp av en plasmid miniprep (figur 1).
    2. Kvantifiser plasmidkonsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer.
  8. Les sekvensen.
    1. For å lese DNA-sekvensen til plasmidet, send plasmidet for Sanger-sekvensering og bruk deretter programvare for å justere det med genom / transkriptomsekvensen for å bekrefte om målsekvensen er riktig syntetisert og vurdere i hvilken retning målsekvensen settes inn i plasmidet (5 'til 3' eller 3' til 5 ').
      MERK: Hvis målsekvensen settes inn i plasmidet i 5 'til 3' retning fra RNA-polymerasebindingsstedet nær 3'-enden, kan en antisense-sonde genereres ved in vitro-transkripsjon . Hvis målsekvensen settes inn i omvendt 3 'til 5' retning, kan en følelsessonde (negativ kontroll) genereres. Hvis du bruker vektorer som pTA2, kan to transkripsjonsbindingssteder brukes avhengig av formålet.
  9. Transkripsjon in vitro
    1. Klargjør DNA-malen fra det opprettede plasmidet ved å utføre PCR ved hjelp av primere utenfor RNA-polymerasebindingsstedet (f.eks. T7 / T3-bindingssteder) i plasmidet (figur 1).
      MERK: Universelle primere som M13-20 fremoverprimer og M13 omvendt primer kan brukes til å fremstille en DNA-mal som inkluderer RNA-polymerasebindingssteder.
    2. Rens malen etter PCR-forsterkning ved hjelp av et gel/PCR-ekstraksjonssett.
    3. Bland reagensene vist nedenfor, og utfør transkripsjonsreaksjonen ved 37 °C i 3 timer (figur 1 og tabell 1).
    4. Tilsett 1,5 μL DNase og inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
    5. Tilsett 10 μL RNasefritt vann og rens sonden fra transkripsjonsreaksjonsløsningen ved hjelp av en oppryddingskolonne.
    6. Kontroller størrelsen på det syntetiserte RNA ved å laste 1 μL på en 1% agarosegel og bestem konsentrasjonen ved hjelp av et spektrofotometer.
      MERK: Syntetiserte RNA-sonder bør ha en konsentrasjon på minst 100 ng / μL.
    7. Tilsett 30 μL formamid til oppbevaring ved eller under −20 °C.

2. EdU-innlemmelse og fiksering

  1. Plasser Cladonema medusae (5-10 dyr per rør) i 1,5 ml rør ved hjelp av en 3,5 ml overføringspipette og tilsett ASW opp til et totalt volum på 500 μL. Tilsett 7,5 μL 10 mM EdU stamløsning og inkuber prøvene i 1 time ved 22 °C (figur 2). EdU sluttkonsentrasjon er 150 μM.
    MERK: Bruk 5-7 dager gammel medusae for å overvåke tredje grendannelse (figur 3A). Dagen som medusae løsner fra polyppen regnes som dag 1, og på dag 5 begynner medusae vanligvis å vise en tredje gren på hovedtentaklene.
  2. Etter 1 time, fjern så mye ASW som inneholder EdU som mulig.
  3. For å bedøve medusae, tilsett 7% MgCl 2 i H2 O og inkuberi 5 minutter.
  4. Fjern 7 % MgCl 2 i H 2 O og fiks medusae over natten (O.N.) ved 4 °C med 4 % paraformaldehyd (PFA) i ASW (figur 2).
    MERK: Når du utfører FISH uten EdU-inkorporering, kan prøver fikses på samme måte som de som behandles med EdU etter bedøvelse (trinn 2.3-2.4).

3. Fluorescerende in situ hybridisering

  1. Proteinasebehandling og postfiksering
    1. Fjern PFA og vask prøvene med PBS som inneholder 0,1% Tween-20 (PBST) i 3 x 10 minutter. Bruk 300-500 μL PBST per vask.
      MERK: Fra dette trinnet til slutten av hybridisering, bør eksperimentet utføres i et RNase-fritt miljø, iført hansker og maske. 1x PBS i dette trinnet må lages med DEPC-behandlet vann. Etter hybridisering kan 1x PBS laget med vann uten DEPC-behandling brukes. Noen ISH- og FISH-protokoller dehydrerer prøver ved hjelp av metanoltrinn, noe som gjør det mulig å lagre de faste prøvene ved -20 ° C til bruk. For å unngå overflødig arbeid utelates dehydreringsprosessen fra denne protokollen, spesielt siden prøvene kan oppbevares i PBST i opptil noen dager.
    2. Etter fiksering, legg prøven i 1,5 ml rør på en shaker, bortsett fra anti-DIG-POD antistoff O.N. inkubasjonstrinn (trinn 3.4.2). Etter vask, tilsett 10 mg/ml Proteinase K stamløsning i PBST og inkuber medusae med Proteinase K (endelig konsentrasjon: 10 μg/ml) ved 37 °C i 10 minutter.
    3. Fjern Proteinase K-løsningen og vask prøvene i 2 x 1 minutter med PBST.
    4. For å postfiksere medusae, tilsett 4% PFA i 1x PBS og inkuber ved 37 ° C i 15 minutter.
    5. Fjern PFA-løsningen og vask prøvene i 2 x 10 minutter med PBST.
      MERK: Hvis målgenet er høyt uttrykt med lavt bakgrunnssignal, kan trinn 3.1.2-3.1.5 hoppes over.
  2. Hybridisering
    1. Fjern PBST-en, og legg til Hybridiseringsbuffer (HB-buffer, tabell 1). Inkuber prøvene i HB Buffer i 15 minutter ved romtemperatur (RT). Bruk 300-400 μL HB Buffer, som gir nok volum for vellykket hybridisering.
      MERK: HB Buffer, Wash Buffer 1 og Wash Buffer 2 er klargjort med 20x SSC-lager. HB-buffer lagres ved eller under −20 °C og må bringes til RT før bruk.
    2. Fjern HB-bufferen og legg til ny HB-buffer. Prehybridiser ved 55 °C i minst 2 timer i en hybridiseringsinkubator.
    3. Fjern HB-bufferen og inkuber med HB-bufferen som inneholder sondene som ble lagret i trinn 1.9.7 (endelig sondekonsentrasjon: 0,5-1 ng/μL i HB-buffer). Hybridiser ved 55 °C i 18-24 timer (figur 2) i en hybridiseringsinkubator.
      MERK: FISH-signalintensitet og spesifisitet kan variere på grunn av målgenuttrykk, samt sondelengde og spesifisitet. For å øke intensiteten kan parametere som hybridiseringsvarighet (18-72 timer) og temperatur (50-65 °C) justeres, og forskjellige prober kan testes. For å unngå uspesifikke signaler kan Proteinase K-behandling (konsentrasjon og varighet) modifiseres19.
  3. Fjerning av sonde
    1. Fjern HB-bufferen som inneholder sonder, og legg deretter til Vask buffer 1 (tabell 1). Vask prøvene med Vask buffer 1 i 2 x 15 minutter ved 55 °C. Bruk 300-400 μL vaskebuffer.
      MERK: HB Buffer som inneholder sonder kan brukes gjentatte ganger, opptil ti ganger. I stedet for å kastes, oppbevar den brukte HB-bufferen som inneholder sonder ved eller under −20 °C. Forvarm Wash Buffer 1, Wash Buffer 2, 2x SSC og PBST ved 55 °C før bruk.
    2. Fjern Vask Buffer 1, og legg deretter til Vask Buffer 2 (Tabell 1). Vask prøvene med Vask buffer 2 i 2 x 15 minutter ved 55 °C.
    3. Fjern Wash Buffer 2, og legg deretter til 2x SSC. Vask prøvene med 2x SSC i 2 x 15 minutter ved 55 °C.
    4. Fjern 2x SSC, og legg deretter til forvarmet PBST. Vask prøvene i 1 x 15 min med PBST på RT.
  4. Anti-DIG antistoffinkubasjon
    1. Fjern PBST, og legg deretter til 1 % blokkeringsbuffer. Inkuber prøvene i minst 1 time ved RT mens du rister sakte på en rocker.
      MERK: Forbered 1% blokkeringsbuffer på nytt ved å fortynne 5% blokkerende bufferbeholdning (tabell 1). Kontroller prøvene før neste antistoffreaksjon fordi prøven har en tendens til å feste seg på baksiden av lokket eller veggen som følge av risting.
    2. Etter blokkering fjerner du blokkeringsbufferen på 1 %, legger til anti-DIG-POD-løsning (1:500, i 1 % blokkeringsbuffer) og inkuberer prøvene O.N. ved 4 °C (figur 2).
      NOTAT: Vær forsiktig med å holde inkubasjonstiden innen 12-16 timer for å forhindre deteksjon av ikke-spesifikke signaler.
  5. Påvisning av DIG-merket sonde
    1. Fjern anti-DIG-POD-løsningen, og legg deretter til Tris-NaCl-Tween Buffer (TNT, tabell 1). Vask prøvene med TNT i 3 x 10 min ved RT.
      MERK: Bruken av tyramid signalforsterkning (TSA) teknikken gir en bedre oppløsning bilde mot pepperrot peroksidase-merkede reagenser (f.eks anti-DIG-POD).
    2. Fortynn fluorescerende fargestoffkonjugert tyramid (Cy5-tyramid) stamløsning (1:50) i forsterkningsfortynningsbufferen for å lage den aktive Cy5-tyramidoppløsningen (figur 2).
    3. Fjern så mye TNT som mulig, og tilsett deretter den aktive Cy5-tyramidoppløsningen. Inkuber prøvene i 10 minutter i mørket.
    4. Vask prøvene med PBST i 3 x 10 minutter i mørket.
  6. Påvisning av EdU
    MERK: EdU-settet oppdager innlemmet EdU som fluorescerende signaler (figur 2).
    1. For å tilberede EdU-deteksjonscocktailen blander du komponentene som vist i tabell 1. Bruk 100 μL EdU-deteksjonscocktail for hver prøve.
      MERK: Forbered 1x Reaction Buffer additiv ved å fortynne 10x Reaction Buffer additiv med ultrarent vann.
    2. Fjern PBST, og legg deretter til EdU-deteksjonscocktailen. Inkuber i mørket i 30 min.
    3. Vask med PBST i 3 x 10 min i mørket.
  7. DNA-farging
    1. Fortynn Hoechst 33342 (1:500) i PBST for å klargjøre Hoechst-oppløsningen. Fjern PBST, og legg deretter til Hoechst-løsningen. Inkuber prøvene i 30 minutter i mørket (figur 2).
    2. Vask prøvene med PBST i 3-4 x 10 minutter i mørket.
  8. Montering
    1. Lag en bank på glassglasset for å forhindre at prøven knuses. Påfør vinylbånd på glassglasset og hul ut midten.
    2. Overfør medusae til banken på lysbildeglasset ved hjelp av en 3,1 ml overføringspipette med spissen avskåret.
      MERK: Vær forsiktig så du ikke lar tentaklene overlappe hverandre.
    3. Fjern PBST med en P200-pipette, og tilsett deretter sakte 70 % glyserol som monteringsmedium (figur 2).
      MERK: I stedet for 70% glyserol kan anti-falmende monteringsmedium brukes til å forhindre at fluorescensen falmer.
    4. Legg forsiktig et deksel på medusae med tang, og forsegl siden av dekselet med klar neglelakk.
    5. Hold lysbildene ved 4 °C i mørket hvis du ikke umiddelbart utfører mikroskopiobservasjon.
  9. Imaging
    1. Bruk et konfokalmikroskop for laserskanning for å skaffe bilder. For encellet oppløsning, bruk en 40x oljelinse eller et objektiv for høyere forstørrelse.
    2. Etter bildeopptak åpner du bildene ved hjelp av ImageJ/FIJI-programvaren og teller celler som er positive for EdU+ og/eller Nanos1+ ved hjelp av flerpunktsverktøyet20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cladonema tentakler har blitt brukt som en modell for å studere de cellulære prosessene for morfogenese og regenerering15,16,17. Tentakelstrukturen består av et epitelrør hvor stamlignende celler, eller i-celler, befinner seg i det proksimale området, kalt tentakelpæren, og nye grener legges sekvensielt på baksiden av pærens distale region langs adaksialsiden (figur 3A)15. Tidligere rapporter har indikert at celleproliferasjon er aktiv både i tentakelpæren og på de nye forgreningsstedene ved hjelp av enten EdU eller BrdU-merking16,17. På grunn av oppløsningen av in situ hybridisering er det imidlertid uklart om stamcellelignende celler virkelig er proliferative eller ikke. For å visualisere både stamlignende og proliferative celler samtidig på cellenivå, utførte vi FISH for stamcellemarkører (Nanos1 eller Piwi) og EdU-merking for S-faseceller i de samme prøvene.

Ved celleoppløsning av FISH ble uttrykket av Nanos1 lokalisert ved tentakelpæren og det nye forgreningsstedet (figur 3B). Piwi ble også uttrykt i tentakelpæren og på det nye forgreningsstedet i et mønster som ligner på Nanos1 (figur 3C). Disse resultatene var i samsvar med observasjonene fra whole-mount in situ hybridisering i en tidligere rapport17, hvor den spirende grenen av en 7 dager gammel medusa var nesten jevnt merket av Nanos1 og Piwi. For å visualisere begynnelsen av akkumuleringen av stamcellelignende celler, overvåket vi det nye forgreningsstedet til en 5 dager gammel medusa. Sammerkingen av Nanos1-uttrykk og EdU-positive celler avslørte det romlige mønsteret av stamcellelignende celler og proliferative celler i tentakkelen (figur 4A). Selv om bruttofordelingene av EdU + og Nanos1 + -celler var i samsvar med tidligere rapporter16,17, var EdU + -celler mer utbredt i hele tentakelpæren, i hvert fall i begynnelsen av forgreningen, mens Nanos1 + -celler akkumulerte mer lokalt ved tentakelpæren og det nye forgreningsstedet (figur 4A og figur 4E ). Disse observasjonene antyder at forskjellige fordelinger av stamcellelignende celler og prolifererende celler oppdages avhengig av utviklingstidspunktet og forskjellige stadier.

En mer detaljert visning av pæren og det nye forgreningsstedet avslørte at EdU-signaler smelter sammen med kjernefysisk farging, mens Nanos1-uttrykk er begrenset til cytoplasmaet som omgir kjernen, i samsvar med en tidligere rapport5 (figur 4B, C). En brøkdel (19,79%) av cellene viste co-merking av EdU og Nanos1 (EdU + Nanos1 +; Figur 4B, C, gule pilspisser og figur 4D), noe som tyder på at disse cellene er en aktivt prolifererende stamcellepopulasjon. Interessant nok ble 14,46% av cellene funnet å være EdU + Nanos1- midt i pæren og på det nye forgreningsstedet, noe som tyder på tilstedeværelsen av ikke-stammelignende proliferative celler (figur 4B, C, hvite piler og figur 4D). I motsetning til dette ble 26,32% av cellene observert å være EdU- Nanos1 + ved foten av pæren og på det nye forgreningsstedet, noe som indikerer tilstedeværelsen av en stamcellepopulasjon som enten er langsom sykling eller hvilende, og ingen av dem oppdages ved EdU-pulsmerking (figur 4B, C, gule piler og figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Skjema for sondesyntesen for in situ hybridisering. Ekstraksjon av totalt RNA fra medusae og cDNA-syntese fra totalt RNA. Nanos1-spesifikke PCR-produkter ble syntetisert fra cDNA. PCR-produktene ble ligert inn i vektorene, og forsterkede vektorer ble samlet inn gjennom kompetent cellekultur. PCR-produktene med RNA-polymerasebindingssteder ble syntetisert ved bruk av plasmidene som maler. DIG-merkede RNA-sonder ble syntetisert ved in vitro-transkripsjon . Forkortelser: DIG = digoxigenin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjema for EdU og fluorescerende in situ hybridisering co-farging. Medusae ble inkubert med 150 μM EdU i 1 time. Deretter ble medusae bedøvet (for å slappe av vevet) med 7% MgCl 2 i H2 O og festet med 4% PFAO.N. ved 4 ° C. Etter fiksering ble prøvene hybridisert med HB Buffer med en sonde i 20-24 timer ved 55 °C. Etter hybridiseringsreaksjonen ble prøvene vasket og inkubert med anti-DIG-POD-løsning O.N. ved 4 °C. Medusae ble farget med Cy5-tyramidløsning i 10 minutter, etterfulgt av påvisning av EdU i 30 minutter og farging med Hoechst 33342 i 30 minutter. Etter å ha fullført alle fargeprosessene ble medusae montert på glassglasset, og bilder ble oppnådd med et konfokalt mikroskop. Forkortelser: EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; FISH = fluorescerende in situ hybridisering; PFA = paraformaldehyd; O.N. = over natten; HB = hybridisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Nanos1- og Piwi-uttrykksmønstre på den proksimale adaxiale siden av Cladonema medusa-tentakelen. (A) Skjematisk av en Cladonema medusa og tentakel. Den adaksiale siden av tentakelen: tentakelpæren (den mest proksimale regionen) med nye grener sekvensielt dannet på det nye forgreningsstedet. Innfellingen (stiplet firkant) indikerer området som er tatt av det konfokale bildet. (B) FISH-bilder av Nanos1-genuttrykk fra den proksimale, adaksiale siden av tentakkelen til en 7 dager gammel Cladonema medusa. (C) FISH-bilder av Piwi-genuttrykk fra den proksimale, adaksiale siden av tentakkelen til en 7 dager gammel Cladonema medusa. DNA: grønn, Nanos1: magenta. B'-C' for Nanos1 FISH bare bilder. Skalastenger = 100 μm (B,C). Forkortelse: FISH = fluorescerende in situ hybridisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: EdU- og Nanos1-uttrykksmønstre på den proksimale, adaksiale siden av Cladonema medusa tentacle. (A-C) Bilder av den proksimale adaksiale siden av Cladonema medusa tentakel co-merket med Nanos1 uttrykk og EdU; 5 dager gamle Medusae ble brukt. (A) En oversikt over tentakelen. Gule stiplede firkanter indikerer områdene B og C. (B) Forstørrelse av tentakelpæren. (C) Forstørrelse av et nytt forgreningssted. Gule pilspisser indikerer cellene som er positive for både EdU og Nanos1. Gule piler indikerer cellene som bare er positive for Nanos1. Hvite piler angir celler som bare er positive for EdU. AC-paneler er sammenslåtte bilder for DNA (blå), EdU (grønn) og Nanos1 (magenta). A'-C' er paneler for EdU bare bilder; A''-C'' er kun for Nanos1 FISH-bilder. Skalastenger = 100 μm (A), 50 μm (B, C). (D) Kvantifiseringen av EdU- og/eller Nanos1-positive celler i basalsiden av tentakkelen (kvantifiseringsareal = 30,10 μm2 kvadrat, n = 6, totalt 249 celler). EdU+ Nanos1− celler, 14,46%; EdU + Nanos1 + celler, 19,79%; EdU- Nanos1+ celler, 26,32%; EdU- Nanos1-celler, 39,44%. (E) Skjematisk av en Cladonema medusa tentakel fra adaxial side. Den samlede fordelingen av EdU+-celler og Nanos1+-celler er vist i henholdsvis E og E'. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammensetning av ulike PCR-reaksjoner og buffere i denne protokollen. For å beregne volumet av PCR-produktet (X μL) i ligasjonsreaksjonen, se notat etter protokoll trinn 1.4. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prolifererende celler og stamceller er viktige cellulære kilder i ulike prosesser som morfogenese, vekst og regenerering21,22. Dette papiret beskriver en metode for co-farging av stamcellemarkøren Nanos1 ved FISH og EdU-merking i Cladonema medusae. Tidligere arbeid ved bruk av EdU eller BrdU-merking har antydet at proliferative celler lokaliserer til tentakelpærene16,17, men deres molekylære egenskaper var uklare. Denne studien viser samtidig bestemmelse av fordelingen av proliferative celler og lokalisering av Nanos1 + stamceller (figur 4). Resultatene viste at noen proliferative celler uttrykte Nanos1, men andre celler ble merket bare med EdU og uttrykte ikke Nanos1, noe som tyder på eksistensen av stamcelle heterogenitet eller potensielt av andre proliferative celler. Det vil være interessant å dissekere den detaljerte stamcellefordelingen under forskjellige prosesser i Cladonema, inkludert tentakelforgrening, vevhomeostase, organregenerering og vedlikehold av kimceller.

Den største flaskehalsen for å visualisere stamceller hos dyr er den første identifiseringen av stamcellemarkører. I cnidarians har stamcellemarkører ikke blitt identifisert i ikke-hydrozoer3, og dermed er den direkte anvendelsen av FISH for stamcellemarkører på dette stadiet begrenset til hydrozoer. Likevel tillater FISH deteksjon av spesifikt genuttrykk på mobilnivå, og dermed, ved å endre prober, kan denne metoden utvides til å observere de romlige uttrykksmønstrene til noen gener av interesse i detalj. For eksempel, ved hjelp av markører av stamceller og differensierte celler, kan vi verifisere fordelingen av bestemte celletyper i Cladenam-tentaklene. Som en advarsel kan det hende at den nåværende protokollen må endres avhengig av gener av interesse på grunn av forskjeller i uttrykksnivåer og mRNA-stabilitet. Spesielt er uspesifikke signaler og svake signaler vanlige problemer knyttet til FISH. Endring av hybridiseringstid og temperatur, bruk av blekemidler (formamid eller metanol) og justering av andre parametere (TSA-reaksjonstid, Proteinase K-behandling, vasking etter hybridisering) kan gi klarere signaler og færre uspesifikke signaler23,24. Det er også viktig å velge en FISH-protokoll som passer til dyremodellen som brukes, siden en FISH-protokoll kanskje ikke gjelder for andre arter, selv innenfor samme takson 7,25,26.

EdU-merking brukes vanligvis til å oppdage proliferative celler, men kan brukes til forskjellige eksperimentelle formål ved å variere konsentrasjonen og inkubasjonstiden27. For å oppdage prolifererende celler er det avgjørende å bestemme en vellykket varighet og konsentrasjon for EdU-innlemmelse. I pulsmerkingen som ble brukt i dette arbeidet, ble bare proliferative celler som passerte gjennom S-fasen i en kort periode merket, og lignende korte inkubasjonsmetoder har blitt brukt for å oppdage prolifererende celler i andre cnidarians 6,28,29. Derimot kan kombinasjonen av langvarig EdU-inkorporering og Nanos1 FISH avsløre tilstedeværelsen av sakte syklende eller hvilende stamceller27. Det er også mulig å markere ikke bare proliferative celler, men også endocycling celler som har gjennomgått DNA-syntese uten deling. Videre, ved å spore EdU-merkede celler i lengre tid, kan vi bestemme den cellulære kapasiteten for migrasjon og differensiering assosiert med proliferative celler og deres cellelinje 6,30.

Mens kombinasjonen av FISH og EdU eller BrdU farging har blitt brukt 7,31, kan metoden som er etablert her enkelt brukes på andre marine hvirvelløse dyr og ikke-modelldyr, inkludert forskjellige manetarter. EdU-farging er enklere og mer følsom enn BrdU-farging18, og med sin korte tidsinkubasjon muliggjør den påvisning av prolifererende celler, i motsetning til den forrige studien som brukte EdU for langsiktig cellemerking7. I de senere år, med utviklingen av neste generasjons sekvenseringsteknologier, har genom- og genuttrykksinformasjon blitt tilgjengelig for mange arter. Identifisering av stamceller og proliferative celler vil fortsatt være en effektiv tilnærming for å forstå stamcelle heterogenitet og mangfold og gi innsikt i den cellulære dynamikken som ligger til grunn for ulike biologiske fenomener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av AMED under Grant Number JP22gm6110025 (til Y.N.) og av JSPS KAKENHI Grant Number 22H02762 (til Y.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol  Wako 137-06862
3.1 mL transfer pipette Thermo Scientific 233-20S
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Wako 029-15043
anti-DIG-POD Roche 11207733910
Cladonema pacificum Nanos1 forward primer 5’-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC
GA-3’
Cladonema pacificum Nanos1 reverse primer 5’-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3’
Cladonema pacificum Piwi forward primer 5’- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA
AGGC -3’
Cladonema pacificum Piwi reverse primer 5’- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA
CTGGC -3’
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen  C10337 EdU kit
Coroline off GEX Co. ltd N/A chlorine neutralizer
DIG Nucleic Acid Detection Kit Blocking Reagent Roche 11175041910 blocking buffer 
DIG RNA labeling mix  Roche 11277073910
DTT  Promega P117B
ECOS competent cell DH5α NIPPON GENE 316-06233 competent cell
Fast gene Gel/PCR Extraction kit Fast gene FG-91302 gel extraction kit
Fast gene plasmid mini kit Fast gene FG-90502 plasmid miniprep
Formamide Wako  068-00426
Heparin sodium salt from porcine SIGMA-ALDRICH  H3393-10KU
Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside (IPTG) Wako 096-05143
LB Agar Invitrogen 22700-025 agar plate
LB Broth Base Invitrogen 12780-052 LB medium
Maleic acid Wako 134-00495
mini Quick spin RNA columns Roche 11814427001 clean-up column
NaCl Wako  191-01665
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Scientific ND-ONEC-W spectrophotometer
Polyoxyethlene (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) Wako  166-21115
PowerMasher 2 nippi  891300 homogenizer
Proteinase K Nacarai Tesque  29442-14
RNase Inhibitor TaKaRa 2313A
RNeasy Mini kit Qiagen  74004 total RNA isolation kit
RQ1 RNase-Free Dnase Promega M6101
Saline Sodium Citrate Buffer 20x powder (20x SSC) TaKaRa T9172
SEA LIFE Marin Tech N/A mixture of mineral salts
T3 RNA polymerase  Roche 11031163001
T7 RNA polymerase  Roche 10881767001
TAITEC HB-100 TAITEC 0040534-000 Hybridization incuvator
TaKaRa Ex Taq  TaKaRa RR001A Taq DNA polymerase
TaKaRa PrimeScript 2 1st strand cDNA Synthesis Kit TaKaRa 6210A cDNA synthesis kit
Target Clone TOYOBO  TAK101 pTA2 Vector
tRNA Roche 10109541001
TSA Plus Cyanine 5 AKOYA Biosciences NEL745001KT tyramide signal amplification (TSA) technique
Zeiss LSM 880 ZEISS N/A laser scanning confocal microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157 (2017).
  2. Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire. Trends in Neurosciences. 40 (2), 92-105 (2017).
  3. Gold, D. A., Jacobs, D. K. Stem cell dynamics in Cnidaria: Are there unifying principles. Development Genes and Evolution. 223 (1-2), 53-66 (2013).
  4. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology: Cnidaria. Development. 138 (8), 1447-1458 (2011).
  5. Leclère, L., et al. Maternally localized germ plasm mRNAs and germ cell/stem cell formation in the cnidarian Clytia. Developmental Biology. 364 (2), 236-248 (2012).
  6. Bradshaw, B., Thompson, K., Frank, U. Distinct mechanisms underlie oral vs aboral regeneration in the cnidarian Hydractinia echinata. eLife. 4, 05506 (2015).
  7. Sinigaglia, C., et al. Pattern regulation in a regenerating jellyfish. eLife. 9, 54868 (2020).
  8. David, C. N. Interstitial stem cells in Hydra: Multipotency and decision-making. The International Journal of Developmental Biology. 56 (6-7-8), 489-497 (2012).
  9. Röttinger, E. Nematostella vectensis, an emerging model for deciphering the molecular and cellular mechanisms underlying whole-body regeneration. Cells. 10 (10), 2692 (2021).
  10. Houliston, E., Momose, T., Manuel, M. Clytia hemisphaerica: A jellyfish cousin joins the laboratory. Trends in Genetics. 26 (4), 159-167 (2010).
  11. Peron, S., Houliston, E., Leclère, L. The Marine Jellyfish Model, Clytia hemisphaerica. Handbook of Marine Model Organisms in Experimental Biology. Boutet, A., Shierwater, B. , CRC Press. Boca. Raton, FL. 129-147 (2021).
  12. Denker, E., Manuel, M., Leclère, L., Le Guyader, H., Rabet, N. Ordered progression of nematogenesis from stem cells through differentiation stages in the tentacle bulb of Clytia hemisphaerica (Hydrozoa, Cnidaria). Developmental Biology. 315 (1), 99-113 (2008).
  13. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Regeneration potential of jellyfish: Cellular mechanisms and molecular insights. Genes. 12 (5), 758 (2021).
  14. Suga, H., et al. Flexibly deployed Pax genes in eye development at the early evolution of animals demonstrated by studies on a hydrozoan jellyfish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14263-14268 (2010).
  15. Fujiki, A. Branching pattern and morphogenesis of medusa tentacles in the jellyfish Cladonema pacificum (Hydrozoa, Cnidaria). Zoological Letters. 5 (12), 13 (2019).
  16. Fujita, S., Kuranaga, E., Nakajima, Y. Cell proliferation controls body size growth, tentacle morphogenesis, and regeneration in hydrozoan jellyfish Cladonema pacificum. PeerJ. 7, 7579 (2019).
  17. Hou, S., Zhu, J., Shibata, S., Nakamoto, A., Kumano, G. Repetitive accumulation of interstitial cells generates the branched structure of Cladonema medusa tentacles. Development. 148 (23), (2021).
  18. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  19. Angerer, L. M., Angerer, R. C. Detection of poly A + RNA in sea urchin eggs and embryos by quantitative in situ hybridization. Nucleic Acids Research. 9 (12), 2819-2840 (1981).
  20. Rakotomamonjy, J., Guemez-Gamboa, A. Purkinje cell survival in organotypic cerebellar slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (154), e60353 (2019).
  21. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Developmental Cell. 21 (1), 172-185 (2011).
  22. Penzo-Méndez, A. I., Stanger, B. Z. Organ-size regulation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 019240 (2015).
  23. Sinigaglia, C., Thiel, D., Hejnol, A., Houliston, E., Leclère, L. A safer, urea-based in situ hybridization method improves detection of gene expression in diverse animal species. Developmental Biology. 434 (1), 15-23 (2018).
  24. King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13 (1), 8 (2013).
  25. Flici, H., et al. An evolutionarily conserved SoxB-Hdac2 crosstalk regulates neurogenesis in a cnidarian. Cell Reports. 18 (6), 1395-1409 (2017).
  26. He, S., et al. An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis. Science. 361 (6409), 1377-1380 (2018).
  27. Govindasamy, N., Murthy, S., Ghanekar, Y. Slow-cycling stem cells in hydra contribute to head regeneration. Biology Open. 3 (12), 1236-1244 (2014).
  28. Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis. BMC Developmental Biology. 12 (1), 34 (2012).
  29. Gold, D. A., et al. Structural and developmental disparity in the tentacles of the moon jellyfish Aurelia sp.1. PLoS One. 10 (8), 0134741 (2015).
  30. Gold, D. A., Nakanishi, N., Hensley, N. M., Hartenstein, V., Jacobs, D. K. Cell tracking supports secondary gastrulation in the moon jellyfish Aurelia. Development Genes and Evolution. 226 (6), 383-387 (2016).
  31. Cheng, L. -C., Alvarado, A. S. Whole-mount BrdU staining with fluorescence in situ hybridization in planarians. Planarian Regeneration. 1774, 423-434 (2018).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 186 FISH EdU maneter medusa Cladonema pacificum stamceller celleproliferasjon
Fluorescerende <em>in situ</em> hybridisering og 5-etynyl-2'-deoksyuridinmerking for stamceller i hydrozoan maneter <em>cladonema pacificum</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., … More

Fujita, S., Kuranaga, E., Miura, M., Nakajima, Y. i. Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum. J. Vis. Exp. (186), e64285, doi:10.3791/64285 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter