Burada, denizanası Cladonema'daki kök benzeri çoğalan hücreleri görselleştirmek için bir protokol açıklıyoruz. Bir kök hücre belirteci ile tam montajlı floresan in situ hibridizasyon, kök benzeri hücrelerin tespit edilmesine izin verir ve 5-etinil-2'-deoksiüridin etiketlemesi, çoğalan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Birlikte, aktif olarak çoğalan kök benzeri hücreler tespit edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hidrozoan Denizanası Cladonema pacificum'daki Kök Benzeri Hücreler için Floresan In Situ Hibridizasyon ve 5-Etinil-2'-Deoksiüridin Etiketleme
Bu makalede
Özet
Özet
Deniz anemonları, mercanlar ve denizanası da dahil olmak üzere Cnidarian'lar, sapsız poliplerde ve serbest yüzme medusalarında ortaya çıkan çeşitli morfoloji ve yaşam tarzları sergilerler. Hydra ve Nematostella gibi yerleşik modellerde örneklendiği gibi, kök hücreler ve / veya proliferatif hücreler cnidarian poliplerin gelişimine ve yenilenmesine katkıda bulunur. Bununla birlikte, çoğu denizanasında, özellikle medusa aşamasında, altta yatan hücresel mekanizmalar büyük ölçüde belirsizdir ve bu nedenle, spesifik hücre tiplerini tanımlamak için sağlam bir yöntem geliştirmek kritik öneme sahiptir. Bu yazıda, hidrozoan denizanası Cladonema pacificum'daki kök benzeri çoğalan hücreleri görselleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. Cladonema medusae, yetişkin evreleri boyunca sürekli büyüyen ve rejeneratif kapasiteyi koruyan dallanmış dokunaçlara sahiptir ve çoğalan ve / veya kök benzeri hücreler tarafından düzenlenen hücresel mekanizmaları incelemek için eşsiz bir platform sağlar. Bir kök hücre belirteci kullanan tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (FISH), kök benzeri hücrelerin tespit edilmesine izin verirken, bir S faz belirteci olan 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile nabız etiketlemesi, çoğalan hücrelerin tanımlanmasını sağlar. Hem FISH hem de EdU etiketlemesini birleştirerek, sabit hayvanlar üzerinde aktif olarak çoğalan kök benzeri hücreleri tespit edebiliriz ve bu teknik, model olmayan denizanası türleri de dahil olmak üzere diğer hayvanlara geniş çapta uygulanabilir.
Giriş
Cnidaria, sinir ve kasları olan hayvanları içeren temel olarak dallanan bir metazoan filum olarak kabul edilir ve onları hayvan gelişiminin ve fizyolojisinin evrimini anlamak için benzersiz bir konuma yerleştirir 1,2. Cnidarians iki ana gruba ayrılır: Anthozoa (örneğin, deniz anemonları, mercanlar) sadece planula larvalarına ve sapsız polip aşamalarına sahipken, Medusozoa (Hydrozoa, Staurozoa, Scyphozoa ve Cubozoa üyeleri) tipik olarak serbest yüzme medusae veya denizanası ile planula larvaları ve polipleri şeklini alır. Cnidarians genellikle yüksek rejeneratif kapasite sergiler ve altta yatan hücresel mekaniz....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Prob sentezi
- RNA ekstraksiyonu
- Yapay deniz suyunda (ASW) kültürlenmiş üç canlı Cladonema medusae'yi, ucu kesilmiş 3,1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla ASW'yi çıkarın.
NOT: ASW, mineral tuzların bir karışımını musluk suyunda klor nötrleştirici ile çözerek hazırlanır; nihai özgül ağırlık (S.G.) 1.018 veya bin başına parça (ppt) ~ 27'dir. - RNaz aktivitesini inhibe etmek için 1,5 mL tüpler....
- Yapay deniz suyunda (ASW) kültürlenmiş üç canlı Cladonema medusae'yi, ucu kesilmiş 3,1 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve mümkün olduğunca fazla ASW'yi çıkarın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kladonoma dokunaçları, morfogenez ve rejenerasyonun hücresel süreçlerini incelemek için bir model olarak kullanılmıştır15,16,17. Tentacle yapısı, kök benzeri hücrelerin veya i-hücrelerinin, dokunaç ampulü adı verilen proksimal bölgede bulunduğu ve ampulün distal bölgesinin arkasına adaksiyal taraf boyunca sırayla yeni dalların eklendiği bir epitel tüpünden oluşur (Şekil 3A)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Proliferasyon yapan hücreler ve kök hücreler morfogenez, büyüme ve rejenerasyon gibi çeşitli süreçlerde önemli hücresel kaynaklardır21,22. Bu yazıda kök hücre belirteci Nanos1'in Cladonema medusae'de FISH ve EdU etiketlemesi ile birlikte boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır. EdU veya BrdU etiketlemesini kullanan önceki çalışmalar, proliferatif hücrelerin dokunaç ampulleri16,17'ye lokalize olduğunu,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma AMED tarafından JP22gm6110025 Hibe Numarası altında (YN'ye) ve JSPS KAKENHI Hibe Numarası 22H02762 (YN'ye) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-Merkaptoetanol | Wako | 137-06862 | |
| 3.1 mL transfer pipeti | Thermo Scientific | 233-20S | |
| 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid (X-Gal) | Wako | 029-15043 | |
| anti-DIG-POD | Roche | 11207733910 | |
| Cladonema pacificum Nanos1 ileri astar | 5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3' | ||
| Cladonema pacificum Nanos1 ters astar | 5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi ileri astar | 5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3' | ||
| Cladonema pacificum Piwi ters astar | 5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3' | ||
| Görüntüleme için Click-iT EdU Hücre Proliferasyon Kiti, Alexa Fluor 488 boya | Invitrogen | C10337 | EdU kiti |
| Coroline off | GEX Co. ltd | N / A | klor nötrleştirici |
| DIG Nükleik Asit Tespit Kiti Bloke Reaktifi | Roche | 11175041910 | bloke edici tampon |
| DIG RNA etiketleme karışımı | Roche | 11277073910 | |
| DTT | Promega | P117B | |
| ECOS yetkili hücre DH5 ve alfa; | NIPPON GENE | 316-06233 | yetkili hücre |
| Hızlı gen Jel / PCR Ekstraksiyon kiti | Hızlı gen | FG-91302 | jel ekstraksiyon kiti |
| Hızlı gen plazmid mini kiti | Hızlı gen | FG-90502 | plazmid miniprep |
| Formamid | Wako | 068-00426 | |
| Domuz SIGMA-ALDRICH'ten heparin sodyum tuzu | H3393-10KU | ||
| İzopropil-β-D(-)-tiyokalaktopiranosit (IPTG) | Wako | 096-05143 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | agar plakası |
| LB Et Suyu Baz | İnvitrojen | 12780-052 | LB orta |
| Maleik asit | Wako | 134-00495 | |
| mini Hızlı döndürme RNA sütunları | Roche | 11814427001 | temizleme sütunu |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| Wi-Fi ile NanoDrop OneC Mikro Hacimli UV-Vis Spektrofotometre | Thermo Scientific | ND-ONEC-W | spektrofotometre |
| Polioksietilen (20) Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | Wako | 166-21115 | |
| PowerMasher 2 | nippe | 891300 | homojenizatör |
| Proteinaz K | Nacarai Tesque | 29442-14 | |
| RNase İnhibitörü | TaKaRa | 2313A | |
| RNeasy Mini kiti | Qiagen | 74004 | toplam RNA izolasyon kiti |
| RQ1 RNaz İçermeyen Dnase | Promega | M6101 | |
| Tuzlu Sodyum Sitrat Tamponu 20x toz (20x SSC) | TaKaRa | T9172 | |
| SEA LIFE | Marin Tech | N/A | mineral tuzları |
| karışımı T3 RNA polimeraz | Roche | 11031163001 | |
| T7 RNA polimeraz | Roche | 10881767001 | |
| TAITEC HB-100 | TAITEC | 0040534-000 | Hibridizasyon eksüvatörü |
| TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | Taq DNA polimeraz |
| TaKaRa PrimeScript 2 1st iplikçik cDNA Sentez Kiti | TaKaRa | 6210A | cDNA sentez kiti |
| Hedef Klon | TOYOBO | TAK101 | pTA2 Vektör |
| tRNA | Roche | 10109541001 | |
| TSA Plus Siyanin 5 | AKOYA Biosciences | NEL745001KT | tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) tekniği |
| Zeiss LSM 880 | ZEISS | N/A | lazer taramalı konfokal mikroskop |
Kaynaklar
- Leclère, L., Röttinger, E. Diversity of cnidarian muscles: Function, anatomy, development and regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 157(2017).
- Bosch, T. C. G., et al. Back to the basics: Cnidarians start to fire....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
