Summary
यह प्रोटोकॉल सिस्टीन और मेथिओनिन के बीच बाइसल्काइलेशन के माध्यम से चक्रीय पेप्टाइड्स के संश्लेषण और प्रोपरगिल सल्फोनियम केंद्र द्वारा ट्रिगर की गई आसान थिओल-यने प्रतिक्रिया प्रस्तुत करता है।
Abstract
हाल के वर्षों में, चक्रीय पेप्टाइड्स ने अपनी उत्कृष्ट जैविक गतिविधियों के कारण दवा की खोज के क्षेत्र में बढ़ते ध्यान को आकर्षित किया है, और, परिणामस्वरूप, वे अब चिकित्सकीय रूप से उपयोग किए जाते हैं। इसलिए, दवा की खोज के क्षेत्र में उनके आवेदन को बढ़ावा देने के लिए चक्रीय पेप्टाइड्स को संश्लेषित करने के लिए प्रभावी रणनीतियों की तलाश करना महत्वपूर्ण है। यह पेपर ऑन-राल या इंट्रामोलेक्यूलर (इंटरमॉलिक्युलर) बाइसल्काइलेशन का उपयोग करके चक्रीय पेप्टाइड्स के कुशल संश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, रैखिक पेप्टाइड्स को रेजिन पर एक साथ युग्मित सिस्टीन (Cys) और मेथिओनिन (Met) के साथ ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण का लाभ उठाकर संश्लेषित किया गया था। इसके अलावा, चक्रीय पेप्टाइड्स को मेट और साइस के बीच बाइसल्काइलेशन के माध्यम से एक असमर्थ टीथर और एक ऑन-टेथर सल्फोनियम केंद्र का उपयोग करके संश्लेषित किया गया था। पूरे सिंथेटिक मार्ग को तीन प्रमुख प्रक्रियाओं में विभाजित किया जा सकता है: राल पर साइस का विघटन, लिंकर का युग्मन, और ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) दरार समाधान में साइस और मेट के बीच साइक्लाइजेशन। इसके अलावा, सल्फोनियम केंद्र की प्रतिक्रिया से प्रेरित होकर, एक प्रोपरगिल समूह को थिओल-यिन जोड़ को ट्रिगर करने और चक्रीय पेप्टाइड बनाने के लिए मेट से जोड़ा गया था। उसके बाद, कच्चे पेप्टाइड्स को सुखाया गया और एसिटोनिट्राइल में भंग कर दिया गया, अलग किया गया, और फिर उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा शुद्ध किया गया। चक्रीय पेप्टाइड के आणविक भार की पुष्टि तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) द्वारा की गई थी, और एचपीएलसी का उपयोग करके रिडक्टेंट के साथ चक्रीय पेप्टाइड संयोजन की स्थिरता की पुष्टि की गई थी। इसके अलावा, चक्रीय पेप्टाइड में रासायनिक बदलाव का विश्लेषण 1एच परमाणु चुंबकीय अनुनाद (1एच एनएमआर) स्पेक्ट्रा द्वारा किया गया था। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य चक्रीय पेप्टाइड्स को संश्लेषित करने के लिए एक प्रभावी रणनीति स्थापित करना था।
Introduction
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) 1 दवा अनुसंधान और विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। रासायनिक साधनों द्वारा एक निश्चित रचना के साथ स्थिर पेप्टाइड्स का निर्माण पीपीआई 2 के मिमेटिक रूपांकनोंको विकसित करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण तरीकों में से एक है। आज तक, पीपीआई को लक्षित करने वाले कई चक्रीय पेप्टाइड्सनैदानिक उपयोग के लिए विकसित किए गए हैं। अधिकांश पेप्टाइड्स को विरूपण एन्ट्रॉपी को कम करने और चयापचय स्थिरता, लक्ष्य-बाध्यकारी आत्मीयता और सेल पारगम्यता 4,5 में सुधार करने के लिए एक α-हेलिक्स रचनाके लिए विवश किया जाता है। पिछले 2 दशकों में, साइस 6,7, लाइसिन 8,9, ट्रिप्टोफैन 10, आर्जिनिन11 और मेट12,13 की साइड चेन को अप्राकृतिक अमीनो एसिड में डाला गया है ताकि पेप्टाइड को चक्रीय रचना में ठीक किया जा सके। इस तरह के चक्रीय पेप्टाइड्स एक अद्वितीय रासायनिक स्थान या विशेष साइटों को लक्षित कर सकते हैं, जिससे प्रोटीन-पेप्टाइड सहसंयोजक बंधन 14,15,16,17 बनाने के लिए सहसंयोजक प्रतिक्रिया शुरू होती है। यू एट अल की एक हालिया रिपोर्ट में, एक क्लोरोएसेटामाइड को पेप्टाइड लिगेंड के डोमेन पर लंगर डाला गया था, जो उत्कृष्ट प्रोटीन विशिष्टता18 के साथ सहसंयोजक संयुग्मन प्रतिक्रिया सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, इलेक्ट्रोफिलिक वारहेड, जैसे कि एक्रिलामाइड और एरिल सल्फोनिल फ्लोराइड (एआरएसओ2एफ), को स्थिर पेप्टाइड सहसंयोजक अवरोधक बनाने और पेप्टाइड अवरोधकों के एंटी-ट्यूमर प्रभाव में सुधार करने के लिए वालेंस्की एट अल .19 द्वारा पेप्टाइड्स में शामिल किया गया था। इसलिए, प्रोटीन-पेप्टाइड लिगेंड20 को सहसंयोजक रूप से संशोधित करने के लिए एक अतिरिक्त कार्यात्मक समूह पेश करना बहुत महत्वपूर्ण है। ये समूह न केवल साइड चेन पर प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, बल्कि पेप्टाइड21 की द्वितीयक संरचना को भी स्थिर करते हैं। हालांकि, पेप्टाइड लिगेंड द्वारा प्रेरित सहसंयोजक रूप से संशोधित प्रोटीन का अनुप्रयोग जटिल सिंथेटिक मार्ग और रासायनिक समूहों के गैर-विशिष्ट बंधन22,23 के कारण सीमित है। इसलिए, चक्रीय पेप्टाइड्स के संश्लेषण के लिए प्रभावी रणनीतियों की तत्काल आवश्यकता है।
चक्रीय पेप्टाइड्स 2,24,25,26 की बहुआयामी रणनीतियों से प्रेरित, यह प्रोटोकॉल पेप्टाइड्स को स्थिर करने के लिए एक सरल और कुशल विधि विकसित करने का प्रयास करता है। इसके अलावा, हमने नोट किया कि एक स्थिर पेप्टाइड का साइड चेन समूह एक लक्ष्य प्रोटीन के साथ सहसंयोजक रूप से प्रतिक्रिया कर सकता है जब यह पेप्टाइड लिगेंड के स्थानिक रूप से करीब था। रासायनिक रूप से संशोधित मेट की कमी को 2013 में डेमिंग समूह द्वारा चुनिंदा रूप से संशोधित पेप्टाइड मेथिओनिन27 के उत्पादन के लिए एक नई विधि विकसित करके पूरा किया गया था। इस पृष्ठभूमि के आधार पर, शी एट अल ने सल्फोनियम नमक केंद्र बनाने के लिए साइड चेन के रिंग बंद होने के विकास पर ध्यान केंद्रित किया। जब पेप्टाइड लिगैंड लक्ष्य प्रोटीन के साथ गठबंधन करता है, तो सल्फोनियम नमक समूह स्थानिक रूप से बंद साइस प्रोटीन के साथ सहसंयोजक रूप से प्रतिक्रिया करता है। हाल के वर्षों में, शी एट अल ने चक्रीय पेप्टाइड28 को स्थिर करने के लिए एक नई विधि तैयार की है। चक्रीय पेप्टाइड पर सल्फोनियम नमक को सल्फहाइड्रील समूह के साथ कम करने वाले एजेंट द्वारा कम किया गया था जिसे विपरीत रूप से मेट में कम कर दिया गया था। हालांकि, प्रतिक्रिया में कम दक्षता थी, जो बाद के जैविक अनुप्रयोग अध्ययनों के लिए हानिकारक थी। वर्तमान अध्ययन में, एक मेट-साइस और प्रोपरगिल ब्रोमाइड-साइस रिंग-क्लोजर प्रतिक्रिया को डिजाइन किया गया था, जिसमें चक्रीय पेप्टाइड की साइड चेन पर एक एकल सल्फोनियम नमक शेष था। सल्फोनियम नमक ने एक नए वारहेड के रूप में काम किया जो स्थानिक निकटता के तहत प्रोटीन साइस के साथ सहसंयोजक रूप से प्रतिक्रिया करता था। संक्षेप में, एक साइस और मेट उत्परिवर्तित पेप्टाइड को इंट्रामोलेक्यूलर अल्काइलेशन द्वारा साइक्लाइज्ड किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक ऑन-टेथर सल्फोनियम केंद्र का उत्पादन हुआ। इस प्रक्रिया में, चक्रीय पेप्टाइड्स के लिए एक साइड चेन ब्रिज का गठन महत्वपूर्ण था। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एक विस्तृत सल्फोनियम-आधारित पेप्टाइड साइक्लाइजेशन का वर्णन करता है जो सरल प्रतिक्रिया स्थितियों और संचालन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। इसका उद्देश्य आगे व्यापक जैविक अनुप्रयोगों के लिए एक संभावित विधि विकसित करना है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. उपकरण तैयार करना
चेतावनी: मोर्फोलिन, एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड (डीएमएफ), डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम), एन, एन-डाइसोप्रोपिलेथिलमाइन (डीआईपीईए), टीएफए, मोर्फोलिन, पिपेरिडीन, डायथाइल ईथर, और मेथनॉल विषाक्त, वाष्पशील और संक्षारक हैं। ये अभिकर्मक साँस लेना, अंतर्ग्रहण, या त्वचा के संपर्क के माध्यम से मानव शरीर को नुकसान पहुंचा सकते हैं। सभी रासायनिक प्रयोगों के लिए, डिस्पोजेबल दस्ताने, प्रयोगात्मक कोट और सुरक्षात्मक चश्मा सहित सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग करें।
- मानक मैनुअल एफएमओसी-आधारित ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण (एसपीपीएस) 29 द्वारा रिंक-एमाइड 4-मिथाइलबेंजिड्रोलमाइन (एमबीएएचए) राल पर सभी पेप्टाइड सब्सट्रेट्स का निर्माण करें, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है।
- रैखिक पेप्टाइड्स के निर्माण के लिए दो विकल्पों में से किसी एक का उपयोग करें: एक, संघनित एजेंट 2-(7-एज़ेबेंजोट्रिज़ोल-1-वाईएल)-एन, एन, एन,एन-टेट्रामेथिल्यूरोनियम हेक्साफ्लोरोफॉस्फेट (एचएटीयू) और डीआईपीईए के अभिकर्मक का उपयोग करके पेप्टाइड को संश्लेषित करें; या दो, एमाइड संक्षेपण अभिकर्मक के रूप में 1-हाइड्रॉक्सीबेंजोट्रिज़ोल (एचओबीटी) और एन, एन-डायसोप्रोपिल कार्बोडिमाइड (डीआईसी) का उपयोग करके संश्लेषित करें। पेप्टाइड के अनुक्रम के अनुसार पेप्टाइड संश्लेषण के लिए एक उपयुक्त प्रोटोकॉल का चयन करें।
- एक मैनुअल पेप्टाइड-संश्लेषण उपकरण स्थापित करने के लिए, एक फ्यूम हुड में संशोधित वैक्यूम ठोस चरण निष्कर्षण उपकरण स्थापित करें और इसे तीन-तरफा स्टॉपकॉक से कनेक्ट करें। इसके बाद, नाइट्रोजन (एन2) गैस से जुड़े होने के दौरान उपकरण पर एक पॉलीप्रोपाइलीन फिल्टर कारतूस या ग्लास रिएक्टर रखें।
नोट: वैक्यूम ठोस चरण निष्कर्षण उपकरण को संशोधित करने के लिए, निष्कर्षण ट्यूब को हटा दें और वैक्यूम-सील सिस्टम रखें। - राल से भरे स्तंभों में एमबीएएचए राल लोड करें और इसे डीएमएफ में भंग करें। एन2 बुदबुदाहट के लिए तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक के स्विच को समायोजित करें, और फिर वैक्यूम सिस्टम से जुड़े एक कामकाजी पंप का उपयोग करके कॉलम में विलायक को हटा दें। निम्न सूत्र का उपयोग करके आवश्यक अमीनो एसिड या संघनित एजेंट की मात्रा की गणना करें:
अमीनो एसिड (जी) और संघनित एजेंट (जी) = राल पैमाने (जी) × राल लोडिंग क्षमता (एमएम / जी) × आणविक भार (जी / एम) × समकक्ष (5 ईक्यू)
नोट: युग्मन पेप्टाइड की लंबाई के अनुसार लोड किए गए राल की मात्रा चुनें। अमीनो एसिड के कई समकक्ष (ईक्यू) का उपयोग अधिक पूरी तरह से प्रतिक्रिया करने के लिए किया जाता है। तरल सॉल्वैंट्स को घनत्व द्वारा मात्रा में परिवर्तित करने की आवश्यकता होती है। 5 eq से पता चलता है कि गणना किए गए यौगिक की इनपुट राशि पांच के कारक से प्रवर्धित होती है।
2. राल की तैयारी
नोट: युग्मन पेप्टाइड की लंबाई के अनुसार लोड किए गए राल की मात्रा चुनें।
- एक स्तंभ (20 एमएल जलाशय) में 302 मिलीग्राम रिंक-एमाइड एमबीएआर राल (0.331 एमएम / जी लोड) का वजन करें। 30 मिनट के लिए एन2 बुदबुदाहट के तहत राल को सूजने के लिए कॉलम में 5-10 एमएल डीसीएम या डीएमएफ जोड़ें।
- इसके बाद, एन2 स्विच को बंद करें, और फिर विलायक को हटाने के लिए वैक्यूम पंप सक्शन स्विच चालू करें। फिर, रेजिन को क्रमिक रूप से डीसीएम (5-10 एमएल) और डीएमएफ (5-10 एमएल) 5 एक्स के साथ धोएं।
3. एन-टर्मिनल एफएमओसी डीप्रोटेक्शन
नोट: मोर्फोलिन द्वारा डीप्रोटेक्शन के लिए 30 मिनट की आवश्यकता होती है, और पिपेरिडीन द्वारा डीप्रोटेक्शन में 5 मिनट लगते हैं।
- एन-टर्मिनल 9-फ्लोरेनिलमिथाइलऑक्सीकार्बोनिल (एफएमओसी) डीप्रोटेक्शन समाधान तैयार करें: एफएमओसी समूह डीप्रोटेक्शन के लिए एक ग्लास कंटेनर में डीएमएफ में 20% (वी / वी) पिपरिडीन या 50% (वी / वी) मॉर्फोलिन की पर्याप्त मात्रा (500 एमएल) तैयार करें।
- कॉलम में डीप्रोटेक्शन समाधान के 10 एमएल जोड़ें, 30 मिनट या 5 मिनट2 एक्स के लिए समाधान में बुलबुला एन 2 जोड़ें, और डीप्रोटेक्शन प्रक्रियाओं 2x को दोहराएं।
- एक वैक्यूम पंप द्वारा घोल को छानलें और राल को डीसीएम (5-10 एमएल) और डीएमएफ (5-10 एमएल) 5 एक्स के साथ क्रमिक रूप से धोएं।
- युग्मन चरण से पहले एफएमओसी समूह की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक डीप्रोटेक्शन के बाद 5% निनहाइड्रिन (कैसर परीक्षण) द्वारा गहरे पीले रंग के घोल के रूप में राल का पता लगाएं। विस्तार से, राल की एक छोटी मात्रा में 1 एमएल डीएमएफ जोड़ें और राल के रंग में परिवर्तन का आकलन करने के लिए 3 मिनट के लिए 130 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ग्लास ट्यूब में 5% निनहाइड्रिन के 200 μL जोड़ें।
- एक वैक्यूम पंप द्वारा घोल को छानलें और राल को डीसीएम (5-10 एमएल) और डीएमएफ (5-10 एमएल) 5 एक्स के साथ क्रमिक रूप से धोएं।
4. रैखिक पेप्टाइड को जोड़ना (चित्रा 2)
नोट: जब सिंथेटिक पेप्टाइड अनुक्रमों में दो या दो से अधिक दोहराई जाने वाली इकाइयां होती हैं, तो युग्मन प्रक्रिया सीधे अमीनो एसिड प्रकार का चयन करके की जा सकती है, जैसे कि एफएमओसी-एए-ओएच या एफएमओसी-एएए-ओएच, और इसी तरह। युग्मन के लिए प्रतिक्रिया समय को ठीक से बढ़ाने के लिए स्टेरिक बाधा के साथ कुछ विशेष अमीनो एसिड और लंबे अमीनो एसिड अनुक्रमों के साथ पेप्टाइड्स की आवश्यकता होती है।
- एकल युग्मन चरण के लिए, एक उदाहरण के रूप में Cys अवशेषों के युग्मन को लें (300 मिलीग्राम राल तराजू को संश्लेषित करें)। एक पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में Fmoc-Cys (Trt)-OH (5 eq, 292 mg) और HATU (5 eq, 206 mg) या Fmoc-Cys (Trt)-OH (5 eq, 292 mg) और HOBT (5 eq, 106 mg) सहित मिश्रण घोल तैयार करें और इसे 3 mL DMF में घोलें।
- अमीनो एसिड को सक्रिय करने के लिए Cys के घोल में DIPEA (10 eq) या DIC (10 eq) के 154 μL जोड़ें। मिश्रण को 1 मिनट के लिए पूर्व-सक्रिय होने दें। मिश्रण को राल के साथ कॉलम में जोड़ें, और इसे 2 घंटे के लिए एन2 के साथ बुलबुला करें।
नोट: 5% निनहाइड्रिन का पता लगाने के लिए आवश्यक विशिष्ट प्रतिक्रिया समय को मानकीकृत किया जाना चाहिए। - युग्मन के बाद, राल की एक छोटी मात्रा में 1 एमएल डीएमएफ जोड़ें और 3 मिनट के लिए 130 डिग्री सेल्सियस पर गर्म ग्लास ट्यूब में 5% निनहाइड्रिन का 200 μL जोड़ें। डीप्रोटेक्शन चरण से पहले एक मुक्त अमीनो समूह की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए राल परिवर्तन को रंगहीन में देखें।
- वैक्यूम पंप का उपयोग करके घोल को छान लें और राल को डीसीएम (5-10 एमएल) और डीएमएफ (5-10 एमएल) 5 एक्स के साथ क्रमिक रूप से धोएं।
- कॉलम में डीप्रोटेक्शन समाधान के 10 एमएल जोड़ें, 30 मिनट या 5 मिनट2 एक्स के लिए एन 2 के साथ बुलबुला, ताजा समाधान जोड़ें, और डीप्रोटेक्शन प्रक्रियाओं को 2 एक्स दोहराएं।
- निम्नलिखित चरणों को दोहराएं: एफएमओसी समूह की रक्षा; राल की सुरक्षा का पता लगाना; राल धोना; अमीनो एसिड को जोड़ना; युग्मन प्रतिक्रिया का पता लगाना। युग्मन चरण को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी पेप्टाइड्स संश्लेषित न हों।
नोट: यह निगरानी करने के लिए कैसर परीक्षण का उपयोग करें कि क्या डीप्रोटेक्शन का हर चरण पूरा हो गया है या एमिनो एसिड युग्मन का प्रत्येक चरण पूरी तरह से है या नहीं। वैकल्पिक रूप से, पेप्टाइड की एक छोटी मात्रा को राल से निकाला जा सकता है और सफल युग्मन के लिए एलसी-एमएस द्वारा जांच की जा सकती है।
5. मेट और साइस के बीच बिसाल्काइलेशन (चित्रा 3)
- चरण 4.1-4.6 को दोहराकर मेट और साइस के साथ एक रैखिक पेप्टाइड का निर्माण करें। रैखिक पेप्टाइड युग्मन के बाद अगले उपयोग के लिए एन 2 के साथ राल के साथ कॉलम में 10 एमएल निर्जल मेथनॉल जोड़ें और एन2 के साथ सूखाएं (रिपीट 2एक्स)।
- पिछले चरण में प्राप्त राल के 100 मिलीग्राम को एक स्तंभ (20 एमएल जलाशय) में तौलें और युग्मन चरण से पहले राल को डीसीएम (5-10 एमएल) और डीएमएफ (5-10 एमएल) से धोएं।
- Cys trt (triityl) सुरक्षा समूह को हटाने के लिए एक समाधान तैयार करें। प्रोटेक्टिओव समूह को हटाने के लिए एक ग्लास कंटेनर में टीएफए / टीआईएस / डीसीएम (3: 5: 92) मिश्रण की पर्याप्त मात्रा (100 एमएल) तैयार करें।
- 10 मिनट के लिए सुरक्षा समूह को हटाने के लिए कॉलम में टीएफए / टीआईएस / डीसीएम (3: 5: 92) के समाधान का 5-10 एमएल जोड़ें। एन2 बुदबुदाहट के साथ छह बार दोहराएं जब तक कि पीला रंग पूरी तरह से गायब न हो जाए।
- एक वैक्यूम पंप द्वारा घोल को छानलें और राल को डीसीएम (5-10 एमएल) और डीएमएफ (5-10 एमएल) 5 एक्स के साथ क्रमिक रूप से धोएं।
- असुरक्षित Cys के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए एक समाधान तैयार करें। डि-हैलोजेनेटेड लिंकर (2 ईक्यू) और डीआईपीईए (4 ईक्यू) सहित मिश्रण समाधान (डीएमएफ) की पर्याप्त मात्रा (50 एमएल) तैयार करें।
- एन2 बुदबुदाहट के साथ कम से कम 3 घंटे के लिए असुरक्षित साइस के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए कॉलम में प्रतिक्रिया समाधान के 5-10 एमएल जोड़ें। निर्जल मेथनॉल के साथ निर्जलित करें और अगले उपयोग के लिए एन2 के साथ सूखा।
- एक वैक्यूम पंप द्वारा घोल को छानलें और राल को डीसीएम (5-10 एमएल) और डीएमएफ (5-10 एमएल) 5 एक्स के साथ क्रमिक रूप से धोएं।
- पेप्टाइड साइक्लाइजेशन के लिए एक समाधान तैयार करें: पेप्टाइड साइक्लाइजेशन के लिए फ्यूम हुड में एक ग्लास कंटेनर में टीएफए मिश्रण (टीएफए: टीआईएस: एच2ओ = 95: 2.5: 2.5) की पर्याप्त मात्रा (20 एमएल) तैयार करें।
- पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में टीएफए मिश्रण समाधान के 5-10 एमएल जोड़ें और 3 घंटे के लिए टीएफए कॉकटेल के तहत राल छोड़ दें।
चेतावनी: टीएफए अत्यधिक संक्षारक और परेशान करने वाला है; पेप्टाइड क्लीवेज प्रक्रिया को फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए। - रिवर्स-फेज तरल चरण शुद्धिकरण (एचपीएलसी) द्वारा रैखिक पेप्टाइड समाधान प्राप्त करने के लिए चरण 7.1-7.5 निष्पादित करें। अगले उपयोग के लिए समाधान को फ्रीज-ड्राई करें।
6. प्रोपरगिल सल्फोनियम नमक साइक्लाइजेशन (चित्रा 4)
- चरण 4.1-4.6 को दोहराकर मेट और साइस के साथ एक रैखिक पेप्टाइड का निर्माण करें। रैखिक पेप्टाइड युग्मन के बाद अगले उपयोग के लिए एन 2 के साथ राल के साथ कॉलम में 10 एमएल निर्जल मेथनॉल जोड़ें और एन2 के साथ सुखाएं (दो बार दोहराएं)।
- पिछले चरण में प्राप्त राल के 100 मिलीग्राम को एक स्तंभ (20 एमएल जलाशय) में तौलें और युग्मन चरण से पहले राल को डीसीएम (5-10 एमएल) और डीएमएफ (5-10 एमएल) से धोएं।
- एचपीएलसी द्वारा रैखिक पेप्टाइड समाधान प्राप्त करने के लिए चरण 7.1-7.5 निष्पादित करें, और अगले उपयोग के लिए नमूने को फ्रीज-ड्राई करें, जैसा कि उल्लेख किया गया है।
- एक 1% एचसीओओएच जलीय घोल (मात्रा में) और 1.0 एमएम प्रोपरगिल ब्रोमाइड (5 ईक्यू) तैयार करें और मेट पेप्टाइड समाधान (0.2 एमएम, 1 ईक्यू; 0.2 एमएल मीसीएन / एच2ओ [1: 1, वी / वी]) में जोड़ें।
- इसके बाद, 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर मेट और प्रोपरगिल ब्रोमाइड की युग्मन प्रतिक्रिया को हिलाएं।
- प्रतिक्रिया के बाद, एसिटोनिट्राइल में एक पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में उत्पाद को भंग करें और इसे 0.22 μmfilter झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें। फिर, रिवर्स-फेज एचपीएलसी द्वारा समाधान को तुरंत शुद्ध करें और अगले उपयोग के लिए इसे पाउडर में फ्रीज-सुखाएं।
- अंतिम चरण में, पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में प्रोपरगिल ब्रोमाइड के साथ पेप्टाइड जोड़ें, (एनएच 4)2 सीओ3 समाधान जोड़कर प्रतिक्रिया समाधान पीएचको 8.0 पर बनाए रखें, और प्रतिक्रिया मिश्रण को 12घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। यह चरण प्रोपरगिल सल्फोनियम नमक के चक्रीय पेप्टाइड को प्राप्त करता है।
- अंतिम प्रतिक्रिया मिश्रण एकत्र करें: इसे एसिटोनिट्राइल में पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में घोलें और इसे 0.22 μm फ़िल्टर झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें। फिर, रिवर्स-फेज एचपीएलसी द्वारा समाधान को तुरंत शुद्ध करें और अगले उपयोग के लिए इसे पाउडर में फ्रीज-सुखाएं।
7. चक्रीय पेप्टाइड्स का शुद्धिकरण
- चरण 4.1-4.6 को दोहराकर रिंक-एमाइड एमबीएएचए राल पर रैखिक पेप्टाइड सब्सट्रेट्स का निर्माण करें। रैखिक पेप्टाइड युग्मन के बाद अगले उपयोग के लिए एन 2 के साथ राल के साथ कॉलम में 10 एमएल निर्जल मेथनॉल जोड़ें और एन2 के साथ सूखा (दो बार दोहराएं)।
- फ्यूम हुड में क्लीवेज कॉकटेल (टीएफए / एच2ओ / टीआईएस, वी / वी / वी, 95: 2.5: 2.5) की पर्याप्त मात्रा तैयार करें। पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में 1-5 एमएल टीएफए मिश्रण समाधान जोड़ें और 3 घंटे के लिए टीएफए कॉकटेल के तहत राल छोड़ दें।
- इसके बाद, क्रमिक रूप से स्तंभ में एन 2 की भाप केतहत राल को सुखाएं। वैकल्पिक रूप से, राल को फ़िल्टर करने और पेप्टाइड समाधान एकत्र करने के लिए फ़िल्टर डिवाइस का उपयोग करें। फिर, पेप्टाइड को अवक्षेपित करने के लिए पेप्टाइड समाधान में 20 एमएल ईथर जोड़ें, 5 मिनट के लिए 3,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और दो बार दोहराएं। कच्चे पेप्टाइड अवक्षेप को इकट्ठा करें और इसे अगले चरण के लिए एन2 की धारा के नीचे सुखाएं।
- 4 एमएल एसिटोनिट्राइल-पानी के घोल में पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में 200 मिलीग्राम क्रूड पेप्टाइड घोलें और इसे 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। पेप्टाइड को एचपीएलसी शीशी डालने में स्थानांतरित करें। सी 18 5 μm, 4.6 मिमी x 250 मिमी कॉलम और 1 एमएल इंजेक्शन लूप से लैस एक अर्ध-प्रारंभिक रिवर्स-चरण एचपीएलसी सिस्टम के ऑटोसैंपलर में डालें।
- 254 एनएम पर यूवी का उपयोग करके एचपीएलसी स्पेक्ट्रा की निगरानी करते हुए 30 मिनट में 0.1% टीएफए के साथ पानी में 5% -95% एसिटोनिट्राइल के ढाल कार्यक्रम का उपयोग करके पेप्टाइड को शुद्ध और अलग करें। एलसी-एमएस द्वारा पेप्टाइड आणविक भार की पुष्टि करें, पेप्टाइड के समाधान को इकट्ठा करें, और अगले उपयोग के लिए इसे पाउडर में फ्रीज-सुखाएं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
सभी रैखिक पेप्टाइड्स को मानक मैनुअल एफएमओसी ठोस-चरण संश्लेषण द्वारा रिंक-एमाइड एमबीएएचए राल पर संश्लेषित किया गया था। एक मॉडल चक्रीय हेक्सापेप्टाइड (एसी (साइक्लो-आई)-डब्ल्यूएमएएएसी-एनएच2) का निर्माण चित्रा 5 ए में वर्णित के रूप में किया गया था। विशेष रूप से, मेट अल्काइलेशन द्वारा एक नया ऑन-टेथर चिरल केंद्र उत्पन्न किया गया था, जिसमें चक्रीय पेप्टाइड (आईए, आईबी) के दो एपिमर्स रिवर्स-फेज एचपीएलसी द्वारा पुष्टि की गई थी। इसके अलावा, रिवर्स-फेज एचपीएलसी के एकीकरण का उपयोग करके एपिमर्स के रूपांतरण और अनुपात को निर्धारित किया गया था। चक्रीय एसी-(साइक्लो-आई)-डब्ल्यूएमएएएसी-एनएच2 पेप्टाइड्स 1-आईए और 1-आईबी, हेक्सापेप्टाइड एसी-डब्ल्यूएमएएएसी-एनएच2 से उत्पन्न, अलग-अलग अवधारण समय और समान आणविक भार प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 5 बी)। इसके बाद, विभिन्न कार्यात्मक समूहों के लिए चक्रीय पेप्टाइड की सहिष्णुता का आगे परीक्षण किया गया, जैसा कि चित्रा 5 सी में दिखाया गया है। 10 रैखिक पेप्टाइड्स की लूप बंद दक्षता का मूल्यांकन एक डी-हैलोजेनेटेड लिंकर का उपयोग करके किया गया था, जिसके परिणाम दिखाते हैं कि सभी पेप्टाइड्स कुशलतापूर्वक संबंधित चक्रीय पेप्टाइड्स उत्पन्न करते हैं। अन्य चक्रीय पेप्टाइड्स की तुलना में, उच्च रूपांतरण दर वाले एक मॉडल हेक्सासाइक्लिक चक्रीय पेप्टाइड ने एपिमर्स के 1: 1 के अंतर अनुपात का उत्पादन किया और एचपीएलसी द्वारा अलग किया जा सकता है। हालांकि, कुछ मामलों में, पेप्टाइड एपिमर्स को एचपीएलसी स्थितियों के तहत अलग नहीं किया जा सकता है, संभवतः एपिमर के सल्फोनियम चिरल केंद्र के बहुत स्थिर नहीं होने और धीरे-धीरे एपिमर मिश्रण में रेसमाइज्ड होने के कारण। तब एचपीएलसी द्वारा पाइरिडिनर्थिओल्स (पीवाईएस) (10 एमएम) के साथ एपिमर्स (1-आईए) की प्रतिक्रिया दक्षता की जांच की गई थी। चित्रा 5 डी चक्रीय पेप्टाइड (1 एमएम) और इसके संयुग्मित उत्पाद के बीच समय-निर्भर रूपांतरण के एचपीएलसी निशान दिखाता है। निशान स्पष्ट रूप से पीबीएस (पीएच 7.4) में पीआईएस के साथ पेप्टाइड 1-आईए की समय-निर्भर कमी दिखाते हैं।
पेप्टाइड रिंग बंद करने के लिए एक और रणनीति यह थी कि, सबसे पहले, मेट से एक प्रोपरगिल समूह जुड़ा हुआ था, और फिर गठित प्रोपरगिल सल्फोनियम केंद्र ने चक्रीय पेप्टाइड उत्पन्न करने के लिए थिओल-यने प्रतिक्रिया को ट्रिगर किया। इस रणनीति में, रिंग आकार और पेप्टाइड अनुक्रम ने साइक्लाइजेशन प्रतिक्रिया को प्रभावित नहीं किया, जिसमें दो या तीन अमीनो एसिड युक्त पेप्टाइड का उपयोग लूप को बंद करने के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है। इंट्रामोलेक्यूलर पेप्टाइड साइक्लाइजेशन का सिंथेटिक मार्ग चित्रा 6 ए में वर्णित है। इसके अलावा, चित्रा 6 बी में वर्णित के रूप में एक सरलीकृत प्रोपेगिलेटेड मेट मॉडल पेप्टाइड का निर्माण किया गया था। परिणामों से पता चला कि मॉडल पेप्टाइड एमसी की उपज 80% तक हो सकती है जब प्रतिक्रिया समाधान पीएच 8.0 पर सेट किया गया था (एमसी इस मार्ग द्वारा संश्लेषित एक मॉडल चक्रीय पेप्टाइड को संदर्भित करता है; चित्र 6 ए)। इसके अलावा, मॉडल पेप्टाइड एमसी को एचपीएलसी (चित्रा 6 डी) द्वारा अलग और शुद्ध किया गया था, और इसके आणविक भार की पुष्टि एलसी-एमएस (चित्रा 6 सी) द्वारा की गई थी। जैसा कि चित्रा 6 ई में दिखाया गया है, रासायनिक बदलाव को आगे 1एच एनएमआर और हेटरोन्यूक्लियर एकल क्वांटम सुसंगतता (एचएसक्यूसी) द्वारा चित्रित किया गया था। इसके अलावा, एमसी की स्थिरता का पता लगाने के लिए सल्फोनियम रिंग खोलने का प्रयास करने के लिए डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) जोड़ा गया था। परिणामों ने 24 घंटे (चित्रा 6एफ) के बाद कोई अतिरिक्त या रिंग-ओपनिंग उत्पाद नहीं दिखाया।
चित्रा 1: पेप्टाइड्स को संश्लेषित करने के लिए एफएमओसी-आधारित ठोस चरण पेप्टाइड के लिए प्रयोगात्मक सेटअप का आरेख। पेप्टाइड संश्लेषण के दौरान कॉलम के माध्यम से नाइट्रोजन या आर्गन बुदबुदाने के साथ तीन-तरफा स्टॉपकॉक्स के माध्यम से पेप्टाइड कॉलम को ठोस चरण रिएक्टर पर रखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: ऑन-राल इंटरमॉलिक्युलर सिंथेटिक रैखिक सीएम पेप्टाइड्स। सभी रैखिक पेप्टाइड्स को मानक मैनुअल एफएमओसी ठोस-चरण संश्लेषण द्वारा रिंक-एमाइड एमबीएएचए राल पर संश्लेषित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: साइस और मेट बाइसल्काइलेशन के माध्यम से पेप्टाइड साइक्लाइजेशन के लिए सिंथेटिक मार्ग। मेट और साइस युक्त रैखिक पेप्टाइड्स का निर्माण स्थिर चक्रीय पेप्टाइड्स के रूप में किया गया था। सबसे पहले, टीआरटी-संरक्षित साइस को डीसीएम में 3% टीएफए के साथ संरक्षित किया गया था। फिर, 3 घंटे के लिए Cys के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए एक डाइ-हैलोजेनेटेड लिंकर (2 eq) और DIPEA (4 eq) जोड़ा गया। अंत में, साइस और मेट के बीच साइक्लाइजेशन पूरा हो गया था जब राल को टीएफए क्लीवेज समाधान में छोड़ दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: साइस और मेट थिओल-यने के माध्यम से पेप्टाइड साइक्लाइजेशन के लिए सिंथेटिक मार्ग। सबसे पहले, रैखिक पेप्टाइड्स को शुद्ध किया गया और एचपीएलसी और एलसी-एमएस की विशेषता थी। प्रतिक्रिया निम्नलिखित स्थितियों के तहत हुई: 0.2 mM, 1.0 eq) में MeCN/H2O (1:1, v/v), 1% HCOOH जलीय घोल (मात्रा में), और प्रोपार्जिल ब्रोमाइड (1.0 mM, 5.0 eq) सहित एक समाधान 8.0 के pH पर 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिलाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: साइस और मेट के बीच बाइसल्काइलेशन का उपयोग करके चक्रीय पेप्टाइड्स की संश्लेषण योजना। (ए) साइस और मेट द्वारा पेप्टाइड साइक्लाइजेशन का योजनाबद्ध चित्रण। (बी) एपिमर्स (1-आईए और 1-आईबी) के एचपीएलसी और एलसी-एमएस स्पेक्ट्रम। (सी) विभिन्न पेप्टाइड्स की कार्यात्मक अवशेष सहिष्णुता का परीक्षण किया गया था। (डी) एचपीएलसी एपिमर्स (1-आईए; 1 एमएम) और उनके संयुग्मित उत्पादों के बीच समय-निर्भर रूपांतरण के निशान। यह आंकड़ा वांग एट अल.30 द्वारा रिपोर्ट किए गए एक संशोधन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: थिओल-यने प्रकार की प्रतिक्रिया का उपयोग करके चक्रीय पेप्टाइड्स की संश्लेषण योजना। (ए) थिओल-यने प्रतिक्रिया द्वारा पेप्टाइड साइक्लाइजेशन का आसान निर्माण। एमसी मार्ग द्वारा संश्लेषित एक मॉडल चक्रीय पेप्टाइड को संदर्भित करता है। (बी) विभिन्न रैखिक पेप्टाइड्स के इंट्रामोलेक्यूलर पेप्टाइड साइक्लाइजेशन। a = 1 m का 1 mL (NH4)2CO3 जलीय घोल। B = 1% Et3N MeCN/H2O (1:1) के 1 mL में। संक्षेप: Ahx = 6-एमिनोकैप्रोइक एसिड। उपज की गणना वजन द्वारा निर्धारित उत्पाद के प्रतिशत के रूप में की गई थी। रूपांतरण एचपीएलसी द्वारा प्रतिक्रिया की गई प्रारंभिक सामग्री की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) एमसी साइक्लाइजेशन पेप्टाइड का एलसी-एमएस स्पेक्ट्रम( डी) एमसी साइक्लाइजेशन पेप्टाइड का एचपीएलसी स्पेक्ट्रम। (ई) एमसीचक्रीय पेप्टाइड्स के 1 एच एनएमआर और एचएसक्यूसी स्पेक्ट्रा लक्षण वर्णन। (एफ) 3 घंटे, 6 घंटे, 12घंटे और24घंटे के लिए डी 2 ओ में एमसी चक्रीय पेप्टाइड और डीटीटी के बीच समय-निर्भर रूपांतरण का 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा। यह आंकड़ा होउ एट अल.31 द्वारा रिपोर्ट किए गए एक संशोधन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस पेपर में वर्णित सिंथेटिक दृष्टिकोण पेप्टाइड अनुक्रम में साइस और मेट का उपयोग करके चक्रीय पेप्टाइड्स को संश्लेषित करने के लिए एक विधि प्रदान करता है, जिसमें मूल रैखिक पेप्टाइड्स का निर्माण सामान्य ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण तकनीकों द्वारा किया जाता है। Cys और Met के बीच चक्रीय पेप्टाइड्स के द्वि-वर्गीकरण के लिए, पूरे सिंथेटिक मार्ग को तीन प्रमुख प्रक्रियाओं में विभाजित किया जा सकता है: राल पर Cys का विघटन, लिंकर का युग्मन, और एक ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड दरार समाधान में Cys और Met के बीच चक्रण। विशेष रूप से, साइस के सुरक्षात्मक समूह को हटाने को बाद की रिंग-क्लोजर प्रतिक्रिया के लिए एक महत्वपूर्ण कदम पाया गया। इसलिए, टीआरटी-साइस को संरक्षित किया गया था, और यह तब तक किया गया था जब तक कि समाधान में कोई स्पष्ट पीला रंग नहीं था। आगे के अध्ययनों से पता चला है कि साइस और मेट पद्धति के बीच बाइसल्काइलेशन द्वारा विकसित चक्रीय पेप्टाइड्स को विभिन्न प्रकार के पेप्टाइड्स में लूप बंद करने तक बढ़ाया जा सकता है, इस शर्त के साथ कि पेप्टाइड में अमीनो एसिड साइस और मेट होते हैं। इसके अलावा, पेप्टाइड अनुक्रम और लिंकर को प्रयोगात्मक डिजाइन (चित्रा 5) के अनुसार भी समायोजित किया जा सकता है। इसलिए, एलसी-एमएस द्वारा संश्लेषण की निगरानी करना आवश्यक था।
थिओल-यने प्रकार की प्रतिक्रिया में चक्रीय पेप्टाइड्स के लिए, सबसे पहले, रैखिक पेप्टाइड्स का निर्माण राल पर सामान्य ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण तकनीकों द्वारा भी किया गया था, जिसमें तरल चरण समाधान में निम्नलिखित प्रतिक्रियाएं की गई थीं। कच्चे पेप्टाइड्स को तब राल से निकाला गया और रिवर्स-फेज एचपीएलसी द्वारा शुद्ध किया गया। पेप्टाइड्स और प्रोपरगिल ब्रोमाइड का एक समाधान 12 घंटे के लिए प्रतिक्रिया में जोड़ा गया था, साथ ही 0.2 एमएल एमईसीएन / एच2ओ (1: 1, वी / वी) और 1% एचसीओओएच जलीय घोल, और उत्पादों को रिवर्स-फेज एचपीएलसी द्वारा तुरंत शुद्ध किया गया था। आश्चर्यजनक रूप से, रिंग-क्लोजर प्रतिक्रिया तब हुई जब प्रतिक्रिया समाधान का पीएच 8.0 तक बढ़ गया था। इस अध्ययन ने एक विधि विकसित की है जो पेप्टाइड को थिओल-यने प्रकार की प्रतिक्रिया के माध्यम से अच्छी स्थिरता के साथ चक्रीय रचना संरचना में बाधित करती है। इसके अलावा, पेप्टाइड्स की हाइड्रोफिलिसिटी और हाइड्रोफोबिसिटी अलग होने के कारण पेप्टाइड लूप बंद होने के लिए विलायक को समायोजित करना आवश्यक था। उदाहरण के लिए, हाइड्रोफिलिक पेप्टाइड के पीएच को (एनएच4)2सीओ3 द्वारा समायोजित किया गया था, और हाइड्रोफोबिक पेप्टाइड को तब एक मिश्रित विलायक द्वारा समायोजित किया गया था (50% मेकएन / एच 2 ओ में 1%एट3एन समाधान; चित्र 6)।
हाल के वर्षों में, चक्रीय पेप्टाइड्स को संश्लेषित करने के लिए विभिन्न बंधाव प्रौद्योगिकियों का विकास किया गया है, इन प्रौद्योगिकियों के साथ प्राकृतिक पेप्टाइड बांड और अप्राकृतिक बैकबोनलिंकेज उत्पन्न होते हैं। हालांकि, सिंथेटिक चक्रीय पेप्टाइड क्षेत्र में चुनौतियां बनी हुई हैं। सबसे पहले, पेप्टाइड के अमीनो एसिड अनुक्रम में स्टेरिक प्रभाव होता है, और साइक्लाइजेशन साइट के करीब अवशेषों से साइक्लाइजेशन की दक्षता प्रभावित हो सकती है। दूसरे, पेप्टाइड्स की स्थानिक संरचना विविध है, और उसी साइट पर रिंग बंद होने के दौरान कनेक्शन साइट को सावधानीपूर्वक चुनना आवश्यक हो सकता है। अंत में, पेप्टाइड अनुक्रमों में हाइड्रोफिलिक या हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड होते हैं, और इसलिए, प्रतिक्रिया विलायक की घुलनशीलता पर विचार करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, दवा उद्योग में चक्रीय पेप्टाइड अनुप्रयोगों को और विकसित करने के लिए साइट, घुलनशीलता और आइसोमर्स पर साइक्लाइजेशन की पहचान करने में अधिक प्रयास किया जाना चाहिए।
इस शोध में, साइस और मेट के बीच या थिओल-यने प्रकार की प्रतिक्रिया के माध्यम से बाइसल्काइलेशन का उपयोग करके आसान मैक्रोसाइक्लाइजेशन प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला चक्रीय पेप्टाइड्स को संश्लेषित करने की चुनौतियों को हल करने के लिए डिज़ाइन की गई थी। सौभाग्य से, ये प्रतिक्रियाएं आसान, अत्यधिक कुशल और धातु उत्प्रेरक मुक्त थीं। विकसित विधियों को इंटरमॉलिक्युलर और इंट्रामोलेक्यूलर दोनों प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शित किया गया है और कार्यात्मक समूह सहिष्णुता को संतुष्ट करता है। इसके अलावा, इन विधियों को बाधा चक्रीकरण शुरू करने के लिए विकसित किया गया था, यह सुनिश्चित करते हुए कि पेप्टाइड श्रृंखला अधिक संवहन रूप से स्थिर है, जिससे लक्ष्य प्रोटीन बाइंडिंग आत्मीयता में सुधार होता है और निरर्थक प्रोटीन बाइंडिंग कम हो जाती है। इसके अलावा, उचित डिजाइनों का उपयोग करके, प्रतिक्रिया साइट चयनात्मकता को एक संवहन स्थिर साइक्लाइजेशन पेप्टाइड बनाकर भी बढ़ाया जा सकता है। कुल मिलाकर, पेप्टाइड चेन साइक्लाइजेशन ने जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों को उत्पन्न किया, यह दर्शाता है कि चक्रीय पेप्टाइड्स आशाजनक दवा उम्मीदवार हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2021वाईएफसी 2103900) से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं; चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (21778009, और 21977010); गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2022A1515010996 और 2020A1515010521): शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार समिति, (RCJC2020071414433053, JCYJ201805081522131455, और JCYJ2020010914040604047); और शेन्ज़ेन-हांगकांग इंस्टीट्यूट ऑफ ब्रेन साइंस-शेन्ज़ेन मौलिक अनुसंधान संस्थान अनुदान (2019एसएचआईबीएस 0004)। लेखकों ने संदर्भ 30 के लिए केमिकल साइंस, द रॉयल सोसाइटी ऑफ केमिस्ट्री और संदर्भ 31 के लिए द जर्नल ऑफ ऑर्गेनिक केमिस्ट्री, अमेरिकन केमिकल सोसाइटी से जर्नल समर्थन स्वीकार किया है।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,3-bis(bromomethyl)-benzen | Energy | D0215 | |
1,3-Dimethylbarbituric acid | Energy | A46873 | |
1H NMR and HSQC | Bruker | AVANCE-III 400 | |
1-Hydroxybenzotriazole hydrate | Energy | E020543 | |
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | Energy | A1797 | |
2-mercaptopyridine | Energy | Y31130 | |
6-Aminocaproic acid | Energy | A010678 | |
Acetic anhydride | Energy | A01021454 | |
Acetonitrile | Aldrich | 9758 | |
Ammonium carbonate | Energy | 12980 | |
Dichloromethane (DCM) | Energy | W330229 | |
Digital Heating Cooling Drybath | Thermo Scientific | 88880029 | |
Diisopropylethylamine (DIPEA) | Energy | W320014 | |
Dimethyl formamide (DMF) | Energy | B020051 | |
Dithiothreitol | Energy | A10027 | |
Electrospray Ionization Mass | SHIMADZU2020 | LC-MS2020 | |
Fmoc-Ala-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30101 | |
Fmoc-Arg(Pbf)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30201 | |
Fmoc-Cys(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30501 | |
Fmoc-Gln(Trt)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30601 | |
Fmoc-Glu(OtBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30701 | |
Fmoc-His(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R30902 | |
Fmoc-Ile-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31001 | |
Fmoc-Lys(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31201 | |
Fmoc-Met-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31301 | |
Fmoc-Pro-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31501 | |
Fmoc-Ser(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31601 | |
Fmoc-Thr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31701 | |
Fmoc-Trp(Boc)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31801 | |
Fmoc-Tyr(tBu)-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R31901 | |
Fmoc-Val-OH | Nanjing Peptide Biotech Ltd | R32001 | |
Formic acid | Energy | W810042 | |
High Performance Liquid Chromatography |
SHIMADZU | LC-2030 | |
Methanol | Aldrich | 9758 | |
Morpholine | Aldrich | M109062 | |
N,N'-Diisopropylcarbodiimide | Energy | B010023 | |
Ninhydrin Reagent | Energy | N7285 | |
Propargyl bromide | Energy | W320293 | |
Rink Amide MBHA resin | Nanjing Peptide Biotech Ltd. | ||
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates | Thermo Scientific | 60300-403 | |
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium | Energy | T1350 | |
Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
Triethylamine | Energy | B010737 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | J&K | 101398 | |
Triisopropylsilane (TIS) | Energy | T1533 |
References
- Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F.
Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021). - White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
- Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
- Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
- Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
- Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
- Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
- Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
- Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
- Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
- Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
- Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
- Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
- Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
- Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
- Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
- Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
- Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
- Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
- Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
- Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
- Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
- Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
- Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
- Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
- Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
- Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
- Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).