Este método quantifica a abundância microbiana usando um formato de placa de 96 poços para unidades formadoras de colônias de placas (UFCs) e é aplicado ao microbioma Drosophila em amostras inteiras de homogeneização de moscas. As CFUs são contadas com um software automatizado de análise de imagens fornecido aqui.
Os intestinos dos animais são colonizados por micróbios comensais, que afetam o desenvolvimento, a saúde e o comportamento do hospedeiro. A quantificação precisa da colonização é essencial para estudar as complexas interações entre hospedeiro e micróbio, tanto para validar a composição microbiana quanto para estudar seus efeitos. Drosophila melanogaster, que tem uma baixa diversidade microbiana nativa e é econômica para trás com composição microbiana definida, emergiu como um organismo modelo para o estudo do microbioma intestinal. A análise do microbioma de um organismo individual requer a identificação de quais espécies microbianas estão presentes e a quantificação de sua abundância absoluta. Este artigo apresenta um método para a análise de um grande número de microbiomas individuais de moscas. As moscas são preparadas em placas de 96 poços, permitindo o manuseio de um grande número de amostras de uma só vez. A abundância microbiana é quantificada pelo revestimento de até 96 homogeneizados de moscas inteiras em uma única placa de ágar em uma matriz de pontos e, em seguida, contando as unidades formadoras de colônias (UFCs) que crescem em cada ponto. Este sistema de chapeamento é emparelhado com uma plataforma automatizada de quantificação de UFC, que incorpora fotografia das placas, diferenciação de colônias fluorescentes e contagem automatizada das colônias usando um plugin ImageJ. As vantagens são que (i) este método é sensível o suficiente para detectar diferenças entre os tratamentos, (ii) o método de chapeamento pontual é tão preciso quanto os métodos tradicionais de chapeamento e (iii) o processo de contagem automatizado é preciso e mais rápido do que a contagem manual. O fluxo de trabalho apresentado aqui permite a quantificação de CFUs de alto rendimento em um grande número de replicações e pode ser aplicado a outros sistemas de estudo de microbiologia, incluindo modelos in vitro e outros modelos de pequenos animais.
A relação entre a microbiota intestinal e seu hospedeiro animal está cada vez mais na vanguarda dos estudos biológicos1, que mostram que a composição da cepa do microbioma é importante para a fisiologia do hospedeiro 2,3,4. O ritmo de descoberta tem sido limitado por fatores de confusão, como alta variação natural interindividual e alta diversidade de bactérias colonizadoras 5,6,7. A mosca-da-fruta, Drosophila melanogaster, emergiu como um modelo promissor devido ao seu microbioma naturalmente de baixa diversidade, facilidade de manuseio e genética robusta do hospedeiro 8,9,10,11. As moscas podem ser livres de germes e reassociadas a uma microbiota definida12, e tem sido demonstrado que a flora influencia características fisiológicas da mosca13,14. A flora inata consiste em um conjunto limitado de bactérias que são todas cultiváveis, e parentes próximos delas também são endógenos ao intestino dos mamíferos, incluindo lactobacilos, proteobactérias e enterococos15.
Estudar a influência do microbioma nas características do hospedeiro requer a quantificação do microbioma em termos de quais espécies estão presentes e suas abundâncias absolutas16. As formas predominantes de análise do microbioma da mosca são as contagens de unidade formadora de colônias (UFC)17, o sequenciamento do amplificador do gene rRNA 16S9 e a qPCR do gene 16S rRNA18. As contagens de UFC podem ser obtidas sem reagentes caros, e confirmam a viabilidade das células bacterianas19. As técnicas 16S, incluindo a qPCR, têm vantagens na medida em que as identidades taxonômicas dos micróbios podem ser determinadas sem levar em conta suas necessidades de crescimento ou morfologias das colônias20.
No caso em que os experimentos usam moscas com um microbioma definido de bactérias conhecidas (moscas gnotobióticas), as contagens de UFC têm vantagens particulares sobre o sequenciamento21. O sequenciamento é caro, exigindo extração de DNA, preparação de biblioteca baseada em PCR e sequenciamento de alto rendimento para obter abundâncias relativas22. Devido ao alto custo, os métodos de sequenciamento de alto rendimento normalmente precisam ser executados em massa para reduzir o preço por amostra23. Outros métodos, como qPCR, são necessários para obter abundâncias absolutas16. Em contraste, as contagens de UFC são rápidas e baratas e fornecem o número absoluto de células viáveis. Drosophila8 e outros pequenos modelos de microbioma24, incluindo o verme, Caenorhabditis elegans 25,26, e o peixe-zebra larval, Danio rerio, cultivado gnotobioticamente27, têm uma gama limitada de bactérias, que têm características de crescimento conhecidas 28. Nesses casos, particularmente com animais gnotobióticos, a contagem de UFC pode diferenciar todas as espécies de bactérias dentro das comunidades intestinais multiespécies21,27,29. Métodos de contagem de UFC de maior rendimento melhorariam ainda mais a relação custo-benefício e a velocidade de medir a composição do microbioma e poderiam ser aplicados a muitos outros experimentos de microbiologia.
A contagem de UFCs por revestimento por diluição em série de uma suspensão bacteriana em meios de crescimento à base de ágar é um método padrão em todo o campo da microbiologia. As colônias que crescem nas placas são então contadas manualmente. As diluições permitem que o pesquisador selecione uma densidade de colônias que seja contável (por exemplo, ~ 100 UFCs por placa), o que significa que as colônias não estão crescendo umas nas outras e podem ser contadas em um período razoável de tempo. A maioria dos microbiologistas usa essencialmente o mesmo método de contagem de UFC desenvolvido há 140 anos no laboratório de Robert Koch e, para muitas aplicações, esse método ainda é adequado. No entanto, surge um problema quando se procura quantificar um grande número de amostras. Uma única amostra pode exigir o chapeamento de 1 a 10 diluições seriais da amostra para obter UFCs contáveis, de modo que experimentos envolvendo mais de algumas dúzias de amostras se tornam desgastantes. Vários métodos foram desenvolvidos para aumentar a eficiência da enumeração de UFC. O revestimento espiral automatizado elimina a necessidade de diluições em série30, tornando necessária apenas uma placa para a contagem de UFC, mas aumentando o tempo para chapear a amostra. A mancha de diluição em série de placa única (SP-SDS) permite estimativas de UFC a partir de menos placas por amostra31. Esses métodos são uma melhoria em relação ao método tradicional de espalhamento, mas ainda exigem manuseio e revestimento de amostras bacterianas isoladamente e, portanto, não são ideais para alto rendimento. O manuseio de amostras em placas de 96 poços e o revestimento pontual dessas 96 amostras em placas de ágar retangulares melhoram muito o rendimento das amostras19.
Os microbiomas são tipicamente compostos de múltiplas cepas e espécies. Embora as espécies possam muitas vezes ser distinguidas pela morfologia da colônia ou meios de crescimento, a fluorescência pode ser empregada para distinguir ainda mais diferentes tipos de bactérias e suas características de crescimento32. Por exemplo, diferentes genótipos da mesma espécie podem ser marcados com diferentes proteínas fluorescentes codificadas geneticamente. Métodos de imagem de placas que incorporam fluorescência permitem que os pesquisadores aproveitem essas técnicas genéticas em ensaios baseados em UFC32. A incorporação de fluorescência em métodos de contagem de CFU de alto rendimento aumentaria ainda mais sua utilidade.
Contar CFUs manualmente torna-se complicado quando há um grande número de amostras. A contagem automatizada de UFCs pode ser realizada fotografando a placa e processando a imagem usando um software especializado33. Sieuwerts et al. combinaram a eficiência aprimorada de chapeamento de pontos com a contagem automatizada de colônias usando fotografia digital convencional e o software ImageJ19.
Um método de alto rendimento para rastrear os fenótipos de associações específicas de micróbios e hospedeiros ajudaria a estudar a montagem da comunidade do microbioma e o impacto na saúde e aptidão do hospedeiro. Para estudos do microbioma Drosophila, uma plataforma de microbiologia de alto rendimento incorporaria o manuseio de amostras de moscas no formato de placa de 96 poços, lise de mosca sem lise bacteriana, a eficiência do spot-plating, a capacidade de usar fluorescência e distinguir múltiplos fluoróforos, um ambiente de luz controlada para imagens reprodutíveis de placas de UFC e um software confiável de contagem automatizada de colônias. Este artigo descreve um método otimizado para o ensaio de UFCs em moscas gnotobióticas, que é simples, rápido e automatizado. Este protocolo descreve um novo fluxo de trabalho que combina o melhor dos métodos publicados anteriormente e otimizado para explorar o microbioma intestinal em Drosophila.
As técnicas detalhadas aqui apresentadas permitem um aumento de > 100 vezes no número de amostras que podem ser avaliadas em um experimento de contagem de UFC. Esta técnica avança os métodos existentes para experimentos de microbioma em Drosophila 12,35,36 usando o formato de placa de 96 poços para testar moscas individuais. Além disso, aplica um método de spotping mais eficiente 19,31 e um fluxo de trabalho automatizado com uma plataforma de fotografia e contagem de colônias. A importância deste método para a Drosophila é padronizar os experimentos para o formato de placa de 96 poços, o que permite o manuseio simultâneo de um grande número de replicações biológicas com automação para alcançar a quantificação de alto rendimento das UFCs.
A plataforma de 96 poços mostra que o aumento da frequência de transferência e o “clareamento” de bactérias transitórias provocam uma redução significativa tanto na abundância média quanto na variação entre as amostras (Figura 1B,C), demonstrando o rigor desse protocolo aprimorado. Uma limitação das moscas de co-alojamento é a transferência horizontal de bactérias entre moscas. Uma solução proposta é manter as moscas individualmente em um formato de placa de 96 poços, como o Whole Animal Feeding Flat38.
Embora uma redução significativa na carga bacteriana não tenha sido observada quando as moscas foram lavadas em etanol, essas moscas só foram mantidas na presença de bactérias externas por 3 dias. O alojamento por períodos de tempo mais longos poderia permitir que uma maior carga bacteriana se acumulasse39. Portanto, a lavagem em etanol ainda é recomendada.
A transferência de moscas para a placa de 96 poços é a primeira etapa crítica para configurar o fluxo de trabalho (Figura 1A). Uma vez que as moscas são lavadas, elas são distribuídas nos poços, uma de cada vez. Um gráfico de placas é útil nesta fase para observar quais condições estão presentes em cada poço e adicionar quaisquer notas, como “a mosca foi perdida”. A homogeneização é outro passo crítico com algumas ressalvas importantes. As bactérias sobrevivem ao processo de homogeneização quando na presença de uma mosca (Figura 1D,E) e, presumivelmente, esse princípio também é verdadeiro quando as bactérias estão dentro do intestino da mosca. No entanto, as bactérias também são mortas quando são homogeneizadas apenas em placas batedoras de contas, demonstrando que a homogeneização pode matar as células bacterianas em determinadas circunstâncias, uma limitação que pode ser importante se estiver homogeneizando intestinos dissecados, por exemplo. Notavelmente, a perda de UFCs ao homogeneizar depende do número de UFCs na amostra, e a perda é mínima quando ~105 UFCs por poço são usadas. Uma maior preservação das UFCs pode ser alcançada interrompendo a homogeneização no meio do caminho e resfriando a placa no gelo.
A homogeneização foi realizada por 5 min neste protocolo com base em experimentos de controle onde um número conhecido de UFCs foi misturado com uma mosca livre de germes, e isso funcionou empiricamente para bactérias moscas. Menos batidas fizeram com que partes maiores de moscas estivessem presentes, o que interfere na pipetagem, enquanto tempos de homogeneização significativamente mais longos, de ~ 10 minutos, tornaram as contagens de UFC mais variáveis. Observou-se que o menor volume e a forma angular dos poços de placa cônica reduzem a eficiência do batimento do talão em comparação com os tubos cilíndricos de 2 mL. Muitas variações nessa abordagem geral são possíveis, incluindo quais cepas bacterianas, quais contas batem no recipiente, quais contas e qual genótipo de mosca são usadas. Casos de usuários individuais precisam usar controles positivos para estabelecer sua abordagem.
O método de plaqueamento pontual foi empregado de forma específica: diluições 1:2 de L. plantarum WF em PBS foram manchadas em placas MRS e incubadas a 30 °C por 2 dias (tempos de incubação mais curtos podem ser implementados para gerar menores tamanhos de colônias). O método requer algum investimento inicial em equipamentos, principalmente o batedor de contas e o pipetador de 96 canais (Figura 2A), que é necessário tanto para a série de diluição quanto para o revestimento pontual. No entanto, opções mais baratas estão disponíveis, incluindo um replicador de placas de 96 poços com pinos ranhurados. A série de diluição é uma etapa crítica que afeta a precisão dos resultados da contagem de UFC. Em termos de modos de falha, é possível entupir as pontas da pipeta com peças de mosca ou contas de vidro e para as pontas da pipeta não selar corretamente no pipetador ou falhar por algum outro motivo. Todos esses problemas resultam em subcontagem dos poços afetados e devem ser monitorados. A mistura adequada em cada etapa da série de diluição também é crucial. Cada diluição deve ser misturada completamente colocando a placa em um agitador de placas ou pipetando para cima e para baixo 15-20 vezes, o que também serve para enxaguar as pontas. Ao detectar da placa mais diluída para a menos diluída, as pontas podem ser reutilizadas para toda a série de diluição. Com diluições de 1:2, a contagem é precisa em uma faixa de 2-25 colônias, abrangendo uma ordem de magnitude (Figura 2C). Portanto, diluições 1:10 economizam tempo e materiais. Outra variável que pode ser aproveitada é o tempo de incubação, que pode ser ajustado para produzir colônias menores e, assim, aumentar a gama de pontos contáveis, impedindo a fusão de colônias adjacentes.
Uma foto de qualidade da placa é essencial, pois ela se torna a fonte bruta de dados a partir da qual as UFCs são analisadas e podem ser arquivadas indefinidamente. A FluoroBox foi projetada para produzir fotos das placas com intensidade de luz uniforme, o que minimiza o brilho na superfície do ágar. Além disso, o projeto é capaz de fotografar seletivamente colônias fluorescentes usando luzes LED de cor única e filtros de fotos coloridas (Figura 3A). A construção de uma configuração como a FluoroBox, com iluminação controlada e configurações de câmera, pode aumentar muito a reprodutibilidade das imagens CFU, o que é importante para a análise automatizada. As morfologias das colônias, a intensidade da fluorescência e os efeitos do tempo ou da densidade no crescimento da colônia são apenas algumas das propriedades que podem ser analisadas usando as fotografias. A caixa de fotos pode ser construída sem os filtros de cor e luzes de cor única se nenhuma bactéria fluorescente for usada, reduzindo o custo e a complexidade. Diferentes luzes de excitação e filtros de emissão podem ser substituídos pelos recomendados aqui se um fluoróforo diferente for usado por um laboratório. Uma câmera conectada a um tablet via Wi-Fi usando um aplicativo é útil tanto para o recurso de obturador automatizado para evitar tremores quanto para facilitar a transferência de dados. As imagens podem ser transferidas para o tablet e, em seguida, para um laptop usando o software de transferência de arquivos sem fio. As câmeras recomendadas com esses recursos são indicadas na Tabela de Materiais.
Count-On-It é um plug-in escrito no ImageJ. O software automatizado de contagem de UFC segmenta a imagem da placa em uma grade uniforme de 96 poços, conta as colônias em cada célula de grade e agrupa os resultados em uma planilha simples. Como sempre há variação na posição da grade pontual na placa e na foto, o usuário deve conformar manualmente a grade à foto usando o plug-in Croptacular. Isso também ajuda a excluir áreas próximas à borda da placa, que têm brilho. Definir o limite é fundamental para obter a contagem de UFC mais precisa da imagem. Se o limiar for definido muito alto, as colônias se fundirão; se o limiar for fixado demasiado baixo, as colónias serão excluídas. Uma vez que o limite é definido, a macro aplica desfoque gaussiano para suavizar as bordas e reduzir o aliasing, o filtro da bacia hidrográfica divide colônias sobrepostas e as bolhas são contadas usando partículas de análise.
Às vezes, a densidade de colônias é muito alta em um determinado local. Count-On-It fornece uma maneira de lidar com isso. Para estimar o número de colônias em uma célula de grade com colônias parcialmente fundidas, primeiro a área média de uma bolha circular de toda a placa é tomada como Cavg. Em seguida, a área da bolha A 1 é dividida pela área média de uma bolha circular A1/Cavg. Esse número é arredondado para o inteiro mais próximo, e essa é a estimativa de quantas colônias estão em uma bolha. Essa função é uma das razões pelas quais o limite pode influenciar os resultados da contagem: a área média relativa da colônia versus uma área de blob mesclada será diferente dependendo de como o limite afetou as bolhas mescladas.
Os métodos apresentados apresentam várias limitações. Isso inclui a necessidade de equipamentos para dispensar meios líquidos com precisão a partir de placas de 96 poços. Este equipamento, seja um pipetador de 96 canais ou uma ferramenta de pino replicador ranhurado, pode custar milhares de dólares para obter. Alternativas mais baratas existem, mas são menos precisas. A contagem automatizada via Count-On-It também apresenta algumas limitações. Por exemplo, se dois tipos de colônias em uma população mista fossem delimitados com base apenas no tamanho, a contagem de blobos não seria capaz de atribuir colônias ao tipo correto. Nesse caso, manchas com bolhas precisariam ser eliminadas das contagens. Uma maior diferenciação das colônias com base na morfologia seria uma extensão valiosa do método que não está implementado atualmente. O uso de meios seletivos, incluindo nutrientes específicos da cepa e antibióticos, simplifica a necessidade de análise complexa de imagens.
A manutenção de experimentos com moscas da fruta em placas de 96 poços multiplica o número de amostras e condições que podem ser testadas em um único experimento e pode facilitar telas de alto rendimento em fenótipos de associação Drosophila-bactéria. Imaginamos que este método pode ser estendido usando meios seletivos para diferenciar muitas cepas bacterianas em misturas complexas. O método não se limita ao estudo do microbioma da mosca. A quantificação de UFCs é comum em muitas aplicações da microbiologia, desde a contagem de coliformes na água potável até a identificação de patógenos. O sistema de chapeamento CFU apresentado aqui permite telas de alto rendimento, bem como aquisição, processamento, armazenamento e entrega automatizados de resultados.
The authors have nothing to disclose.
O Dr. Kerwyn Casey Huang, o Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper e membros do laboratório de Ludington deram informações valiosas sobre o desenvolvimento deste protocolo. O financiamento foi fornecido pela subvenção NSF IOS 2032985, pela subvenção do NIH DP5OD017851, por uma subvenção da Carnegie Institution of Canada e pelo Carnegie Institute for Science’s Endowment.
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |