Questo metodo quantifica l’abbondanza microbica utilizzando un formato di piastra a 96 pozzetti per le unità formanti colonie di placca (CFU) e viene applicato al microbioma di Drosophila in campioni di omogenato di mosca interi. I CFU vengono conteggiati con un software di analisi delle immagini automatizzato fornito qui.
L’intestino degli animali è colonizzato da microbi commensali, che influiscono sullo sviluppo, sulla salute e sul comportamento dell’ospite. La quantificazione precisa della colonizzazione è essenziale per studiare le complesse interazioni tra ospite e microbo sia per validare la composizione microbica che per studiarne gli effetti. Drosophila melanogaster, che ha una bassa diversità microbica nativa ed è economico da allevare con una composizione microbica definita, è emerso come organismo modello per lo studio del microbioma intestinale. L’analisi del microbioma di un singolo organismo richiede l’identificazione di quali specie microbiche sono presenti e la quantificazione della loro abbondanza assoluta. Questo articolo presenta un metodo per l’analisi di un gran numero di singoli microbiomi di mosca. Le mosche sono preparate in piastre da 96 pozzetti, consentendo la gestione di un gran numero di campioni contemporaneamente. L’abbondanza microbica viene quantificata placcando fino a 96 omogenati interi di mosca su una singola piastra di agar in una serie di punti e quindi contando le unità formanti colonie (CFU) che crescono in ogni punto. Questo sistema galvanico è abbinato a una piattaforma di quantificazione CFU automatizzata, che incorpora la fotografia delle lastre, la differenziazione delle colonie fluorescenti e il conteggio automatico delle colonie utilizzando un plug-in ImageJ. I vantaggi sono che (i) questo metodo è abbastanza sensibile da rilevare le differenze tra i trattamenti, (ii) il metodo di placcatura a punti è accurato quanto i metodi galvanici tradizionali e (iii) il processo di conteggio automatizzato è accurato e più veloce del conteggio manuale. Il flusso di lavoro qui presentato consente la quantificazione ad alta produttività delle CFU in un gran numero di repliche e può essere applicato ad altri sistemi di studio microbiologico, inclusi modelli in vitro e altri piccoli animali.
La relazione tra il microbiota intestinale e il loro ospite animale è sempre più in prima linea negli studi biologici1, che dimostrano che la composizione del ceppo del microbioma è importante per la fisiologia dell’ospite 2,3,4. Il ritmo della scoperta è stato limitato da fattori confondenti come l’elevata variazione interindividuale naturale e l’elevata diversità dei batteri colonizzatori 5,6,7. Il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è emerso come un modello promettente grazie al suo microbioma naturalmente a bassa diversità, alla facilità di manipolazione e alla robusta genetica dell’ospite 8,9,10,11. Le mosche possono essere rese prive di germi e riassociate a un microbiota definito12, ed è stato dimostrato che la flora influenza i tratti fisiologici della mosca13,14. La flora innata è costituita da un insieme limitato di batteri che sono tutti coltivabili, e parenti stretti di questi sono anche endogeni all’intestino dei mammiferi, tra cui lattobacilli, proteobatteri ed enterococchi15.
Studiare l’influenza del microbioma sui tratti dell’ospite richiede la quantificazione del microbioma in termini sia di quali specie sono presenti che delle loro abbondanze assolute16. I modi predominanti di analizzare il microbioma del moscerino sono la conta17 dell’unità formante colonie (CFU), il sequenziamento dell’amplicone del gene dell’rRNA 16S9 e la qPCR del gene 18 dell’rRNA16S. I conteggi dei CFU possono essere ottenuti senza costosi reagenti e confermano la vitalità delle cellule batteriche19. Le tecniche 16S, inclusa la qPCR, presentano vantaggi in quanto le identità tassonomiche dei microbi possono essere accertate indipendentemente dalle loro esigenze di crescita o dalle morfologie delle colonie20.
Nel caso in cui gli esperimenti utilizzino moscerini con un microbioma definito di batteri noti (mosche gnotobiotiche), i conteggi dei CFU presentano particolari vantaggi rispetto al sequenziamento21. Il sequenziamento è costoso e richiede l’estrazione del DNA, la preparazione della libreria basata sulla PCR e il sequenziamento ad alto rendimento per ottenere abbondanze relative22. A causa del costo elevato, i metodi di sequenziamento ad alta produttività devono in genere essere eseguiti in blocco per ridurre il prezzo per campione23. Ulteriori metodi come la qPCR sono necessari per ottenere abbondanze assolute16. Al contrario, i conteggi dei CFU sono veloci ed economici e forniscono il numero assoluto di cellule vitali. Drosophila8 e altri piccoli modelli di microbioma 24, tra cui il verme, Caenorhabditis elegans 25,26, e il pesce zebra larvale, Danio rerio, cresciuto gnotobioticamente 27, hanno una gamma limitata di batteri, che hanno caratteristiche di crescita note 28. In questi casi, in particolare con gli animali gnotobiotici, il conteggio dei CFU può differenziare tutte le specie di batteri all’interno delle comunità intestinali multispecie21,27,29. Metodi di conteggio CFU a più alto rendimento migliorerebbero ulteriormente l’efficacia in termini di costi e la velocità di misurazione della composizione del microbioma e potrebbero essere applicati a molti altri esperimenti di microbiologia.
Il conteggio dei CFU mediante diluizione seriale di una sospensione batterica su terreni di coltura a base di agar è un metodo standard nel campo della microbiologia. Le colonie che crescono sui piatti vengono quindi contate manualmente. Le diluizioni consentono al ricercatore di selezionare una densità di colonie che è numerabile (ad esempio, ~ 100 CFU per piastra), il che significa che le colonie non stanno crescendo l’una nell’altra e possono essere contate in un ragionevole lasso di tempo. La maggior parte dei microbiologi utilizza essenzialmente lo stesso metodo di conteggio CFU sviluppato 140 anni fa nel laboratorio di Robert Koch e, per molte applicazioni, questo metodo è ancora adeguato. Tuttavia, sorge un problema quando si cerca di quantificare un gran numero di campioni. Un singolo campione può richiedere la placcatura da 1 a 10 diluizioni seriali del campione per ottenere CFU numerabili, quindi gli esperimenti che coinvolgono più di qualche dozzina di campioni diventano gravosi. Sono stati sviluppati vari metodi per aumentare l’efficienza dell’enumerazione CFU. La placcatura a spirale automatizzata elimina la necessità di diluizioni seriali30, rendendo necessaria una sola piastra per il conteggio dei CFU, ma aumentando il tempo di placcatura del campione. SP-SDS (Single Plate-Serial Dilution Spotting) consente stime CFU da un minor numero di piastre per campione31. Questi metodi sono un miglioramento rispetto al tradizionale metodo di spalmatura, ma richiedono ancora la manipolazione e la placcatura di campioni batterici singolarmente e non sono, quindi, ideali per un’elevata produttività. La manipolazione dei campioni in piastre a 96 pozzetti e la placcatura a punti di quei 96 campioni su piastre rettangolari di agar migliorano notevolmente la produttività dei campioni19.
I microbiomi sono tipicamente composti da più ceppi e specie. Mentre le specie possono spesso essere distinte dalla morfologia della colonia o dai mezzi di crescita, la fluorescenza può essere impiegata per distinguere ulteriormente diversi tipi di batteri e i loro tratti di crescita32. Ad esempio, diversi genotipi della stessa specie possono essere etichettati con diverse proteine fluorescenti codificate geneticamente. I metodi di imaging delle piastre che incorporano la fluorescenza consentono ai ricercatori di sfruttare queste tecniche genetiche nei saggi basati su CFU32. L’incorporazione della fluorescenza nei metodi di conteggio dei CFU ad alta produttività migliorerebbe ulteriormente la loro utilità.
Il conteggio manuale dei CFU diventa complicato quando c’è un gran numero di campioni. Il conteggio automatico dei CFU può essere condotto fotografando la lastra ed elaborando l’immagine utilizzando un software specializzato33. Sieuwerts et al. hanno combinato la migliore efficienza galvanica della placcatura spot con il conteggio automatico delle colonie utilizzando la fotografia digitale convenzionale e il software ImageJ19.
Un metodo ad alto rendimento per lo screening dei fenotipi di specifici microbi e associazioni di ospiti aiuterebbe gli studi sull’assemblaggio della comunità del microbioma e l’impatto sulla salute e sulla forma fisica dell’ospite. Per gli studi sul microbioma della Drosophila , una piattaforma microbiologica ad alto rendimento includerebbe la gestione di campioni di mosca in formato piastra a 96 pozzetti, la lisi del moscerino senza lisi batterica, l’efficienza della placcatura spot, la capacità di utilizzare la fluorescenza e distinguere più fluorofori, un ambiente luminoso controllato per l’imaging riproducibile di piastre CFU e un affidabile software automatizzato di conteggio delle colonie. Questo articolo descrive un metodo ottimizzato per il dosaggio delle CFU nelle mosche gnotobiotiche, che è semplice, veloce e automatizzato. Questo protocollo delinea un nuovo flusso di lavoro che combina il meglio dei metodi precedentemente pubblicati e ottimizzato per esplorare il microbioma intestinale in Drosophila.
Le tecniche dettagliate qui presentate consentono un aumento di >100 volte del numero di campioni che possono essere valutati in un esperimento di conteggio CFU. Questa tecnica fa progredire i metodi esistenti per gli esperimenti sul microbioma in Drosophila 12,35,36 utilizzando il formato a piastra a 96 pozzetti per saggiare le singole mosche. Inoltre, applica un metodo di placcatura spot più efficiente 19,31 e un flusso di lavoro automatizzato con una piattaforma di fotografia e conteggio delle colonie. Il significato di questo metodo per Drosophila è quello di standardizzare gli esperimenti al formato a piastra a 96 pozzetti, che consente la gestione simultanea di un gran numero di repliche biologiche con l’automazione per ottenere una quantificazione ad alto rendimento delle CFU.
La piattaforma a 96 pozzetti mostra che l’aumento della frequenza di trasferimento e la “pulizia” dei batteri transitori provoca una significativa riduzione sia dell’abbondanza media che della variazione tra i campioni (Figura 1B, C), dimostrando il rigore di questo protocollo migliorato. Una limitazione delle mosche co-housing è il trasferimento orizzontale di batteri tra le mosche. Una soluzione proposta è quella di tenere le mosche individualmente in un formato a piastra a 96 pozzetti, come l’intero Animal Feeding Flat38.
Sebbene non sia stata osservata una significativa riduzione della carica batterica quando le mosche sono state lavate in etanolo, queste mosche sono state tenute in presenza di batteri esterni solo per 3 giorni. L’alloggiamento per periodi di tempo più lunghi potrebbe consentire a una maggiore carica batterica diaccumulare 39. Pertanto, il lavaggio in etanolo è ancora raccomandato.
Il trasferimento delle mosche nella piastra a 96 pozzetti è il primo passo fondamentale per impostare il flusso di lavoro (Figura 1A). Una volta lavate, le mosche vengono distribuite nei pozzetti una alla volta. Un grafico a piastre è utile in questa fase per annotare quali condizioni sono presenti in ogni pozzo e aggiungere eventuali note come “la mosca è stata persa”. L’omogeneizzazione è un altro passo critico con alcuni importanti avvertimenti. I batteri sopravvivono al processo di omogeneizzazione quando sono in presenza di una mosca (Figura 1D, E), e presumibilmente, questo principio è vero anche quando i batteri sono all’interno dell’intestino della mosca. Tuttavia, i batteri vengono uccisi anche quando vengono omogeneizzati solo nelle piastre battiperline, dimostrando che l’omogeneizzazione può uccidere le cellule batteriche in determinate circostanze, una limitazione che può essere importante se si omogeneizzano budella sezionate, per esempio. In particolare, la perdita di CFU durante l’omogeneizzazione dipende dal numero di CFU nel campione e la perdita è minima quando vengono utilizzati ~ 105 CFU per pozzo. Un’ulteriore conservazione dei CFU può essere ottenuta fermando l’omogeneizzazione a metà e raffreddando la piastra su ghiaccio.
L’omogeneizzazione è stata eseguita per 5 minuti in questo protocollo sulla base di esperimenti di controllo in cui un numero noto di CFU è stato miscelato con una mosca priva di germi, e questo ha funzionato empiricamente per i batteri della mosca. Meno battiti hanno causato la presenza di parti di mosca più grandi, che interferiscono con il pipettaggio, mentre tempi di omogeneizzazione significativamente più lunghi di ~ 10 minuti hanno reso i conteggi dei CFU più variabili. Il volume più piccolo e la forma angolata dei pozzetti conici a piastre sono stati osservati per ridurre l’efficienza del battito delle perline rispetto ai tubi cilindrici da 2 ml. Sono possibili molte varianti di questo approccio generale, tra cui quali ceppi batterici, quale contenitore di battitura delle perline, quali perline e quale genotipo di mosca vengono utilizzati. I singoli casi utente devono utilizzare controlli positivi per stabilire il loro approccio.
Il metodo di placcatura spot è stato impiegato in un modo specifico: diluizioni 1:2 di L. plantarum WF in PBS sono state individuate su piastre MRS e incubate a 30 °C per 2 giorni (tempi di incubazione più brevi possono essere implementati per generare colonie più piccole). Il metodo richiede alcuni investimenti iniziali in attrezzature, principalmente il batticordone e il pipettor a 96 canali (Figura 2A), necessari sia per la serie di diluizione che per la placcatura spot. Tuttavia, sono disponibili opzioni meno costose, tra cui un replicatore di piastre a 96 pozzetti con perni scanalati. La serie di diluizione è un passaggio critico che influisce sull’accuratezza dei risultati del conteggio dei CFU. In termini di modalità di guasto, è possibile ostruire le punte delle pipette con parti di mosca o perline di vetro e che le punte delle pipette non si chiudano correttamente sul pipettatore o si guastino per qualche altro motivo. Tutti questi problemi comportano una sottostima dei pozzi interessati e dovrebbero essere monitorati. Anche una miscelazione adeguata in ogni fase della serie di diluizione è fondamentale. Ogni diluizione deve essere miscelata accuratamente mettendo la piastra su uno scuotitore di piastre o pipettando su e giù 15-20 volte, che serve anche a risciacquare le punte. Individuando dalla piastra più diluita a quella meno diluita, le punte possono essere riutilizzate per l’intera serie di diluizione. Con diluizioni 1:2, il conteggio è accurato su un intervallo di 2-25 colonie, che copre un ordine di grandezza (Figura 2C). Pertanto, le diluizioni 1:10 consentono di risparmiare tempo e materiali. Un’altra variabile che può essere sfruttata è il tempo di incubazione, che può essere regolato per produrre colonie più piccole e, quindi, aumentare la gamma di punti numerabili impedendo la fusione di colonie adiacenti.
Una foto di qualità della lastra è essenziale in quanto diventa la fonte grezza dei dati da cui vengono analizzati i CFU e possono essere archiviati indefinitamente. Il FluoroBox è progettato per produrre foto delle lastre con intensità luminosa uniforme, che riduce al minimo l’abbagliamento sulla superficie dell’agar. Inoltre, il design è in grado di fotografare selettivamente colonie fluorescenti utilizzando luci LED monocolore e filtri fotografici colorati (Figura 3A). La costruzione di una configurazione come il FluoroBox, con illuminazione controllata e impostazioni della telecamera, può aumentare notevolmente la riproducibilità delle immagini CFU, che è importante per l’analisi automatizzata. Le morfologie delle colonie, l’intensità della fluorescenza e gli effetti del tempo o della densità sulla crescita delle colonie sono solo alcune delle proprietà che possono essere analizzate utilizzando le fotografie. La scatola fotografica può essere costruita senza i filtri colorati e le luci monocolore se non vengono utilizzati batteri fluorescenti, riducendo i costi e la complessità. Diverse luci di eccitazione e filtri di emissione potrebbero essere sostituiti a quelli raccomandati qui se un fluoroforo diverso viene utilizzato da un laboratorio. Una fotocamera collegata a un tablet tramite WiFi tramite un’app è utile sia per la funzione di otturatore automatico per prevenire l’agitazione che per facilitare il trasferimento dei dati. Le immagini possono essere trasferite sul tablet e quindi su un laptop utilizzando il software di trasferimento file wireless. Le fotocamere consigliate con queste funzionalità sono indicate nella tabella dei materiali.
Count-On-It è un plug-in scritto in ImageJ. Il software di conteggio CFU automatizzato segmenta l’immagine della lastra in una griglia uniforme a 96 pozzetti, conta le colonie in ogni cella della griglia e raggruppa i risultati in un semplice foglio di calcolo. Poiché vi è sempre una variazione nella posizione della griglia spot sulla lastra e nella foto, l’utente deve conformare manualmente la griglia alla foto utilizzando il plug-in Croptacular. Questo aiuta anche a escludere le aree vicino al bordo della piastra, che hanno abbagliamento. L’impostazione della soglia è fondamentale per ottenere il conteggio CFU più accurato dall’immagine. Se la soglia è impostata troppo alta, le colonie si uniranno; Se la soglia è impostata troppo bassa, le colonie saranno escluse. Una volta impostata la soglia, la macro applica la sfocatura gaussiana per ammorbidire i bordi e ridurre l’aliasing, il filtro spartiacque divide le colonie sovrapposte e i blob vengono conteggiati utilizzando le particelle di analisi.
A volte, la densità delle colonie è troppo alta in un punto particolare. Count-On-It fornisce un modo per affrontare questo. Per stimare il numero di colonie in una cella della griglia con colonie parzialmente unite, prima l’area media di un blob circolare dall’intera piastra viene presa come Cavg. Quindi, l’area del BLOB A 1 viene divisa per l’area media di un BLOB circolare A1/Cavg. Questo numero viene arrotondato al numero intero più vicino e questa è la stima di quante colonie sono presenti in un BLOB. Questa funzione è uno dei motivi per cui la soglia può influenzare i risultati del conteggio: l’area media relativa della colonia rispetto a un’area BLOB unita sarà diversa a seconda di come la soglia ha influenzato i BLOB uniti.
I metodi presentati hanno diverse limitazioni. Questi includono la necessità di attrezzature per erogare con precisione fluidi liquidi da piastre a 96 pozzetti. Questa apparecchiatura, un pipettor a 96 canali o uno strumento a perno replicatore a fessura, può costare migliaia di dollari per ottenere. Esistono alternative più economiche, ma sono meno accurate. Il conteggio automatico tramite Count-On-It presenta anche alcune limitazioni. Ad esempio, se due tipi di colonie in una popolazione mista fossero delimitati solo in base alle dimensioni, il conteggio dei blob non sarebbe in grado di assegnare colonie al tipo corretto. In questo caso, le macchie con macchie dovrebbero essere eliminate dai conteggi. Un’ulteriore differenziazione delle colonie in base alla morfologia sarebbe una preziosa estensione del metodo che non è attualmente implementato. L’uso di mezzi selettivi, compresi nutrienti specifici per ceppo e antibiotici, semplifica la necessità di analisi complesse delle immagini.
Mantenere esperimenti di moscerini della frutta in piastre a 96 pozzetti moltiplica il numero di campioni e condizioni che possono essere testati in un singolo esperimento e può facilitare screening ad alto rendimento nei fenotipi di associazione Drosophila-batteri. Prevediamo che questo metodo possa essere esteso utilizzando mezzi selettivi per differenziare molti ceppi batterici in miscele complesse. Il metodo non si limita allo studio del microbioma della mosca. La quantificazione dei CFU è comune in molte applicazioni della microbiologia, dalla conta dei coliformi nell’acqua potabile all’identificazione di agenti patogeni. Il sistema galvanico CFU qui presentato consente schermi ad alta produttività, nonché acquisizione, elaborazione, archiviazione e consegna automatizzate dei risultati.
The authors have nothing to disclose.
Il Dr. Kerwyn Casey Huang, il Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper e i membri del laboratorio di Ludington hanno dato un prezioso contributo allo sviluppo di questo protocollo. Il finanziamento è stato fornito da NSF IOS grant 2032985, NIH grant DP5OD017851, una sovvenzione della Carnegie Institution of Canada e dal Carnegie Institute for Science’s Endowment.
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |