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Biology

Conteggio rapido delle unità formanti colonie in formato piastra a 96 pozzetti applicato al microbioma Drosophila

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64298
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Embryology, Carnegie Institution for Science, 2Department of Biology, Johns Hopkins University

Summary

Questo metodo quantifica l'abbondanza microbica utilizzando un formato di piastra a 96 pozzetti per le unità formanti colonie di placca (CFU) e viene applicato al microbioma di Drosophila in campioni di omogenato di mosca interi. I CFU vengono conteggiati con un software di analisi delle immagini automatizzato fornito qui.

Abstract

L'intestino degli animali è colonizzato da microbi commensali, che influiscono sullo sviluppo, sulla salute e sul comportamento dell'ospite. La quantificazione precisa della colonizzazione è essenziale per studiare le complesse interazioni tra ospite e microbo sia per validare la composizione microbica che per studiarne gli effetti. Drosophila melanogaster, che ha una bassa diversità microbica nativa ed è economico da allevare con una composizione microbica definita, è emerso come organismo modello per lo studio del microbioma intestinale. L'analisi del microbioma di un singolo organismo richiede l'identificazione di quali specie microbiche sono presenti e la quantificazione della loro abbondanza assoluta. Questo articolo presenta un metodo per l'analisi di un gran numero di singoli microbiomi di mosca. Le mosche sono preparate in piastre da 96 pozzetti, consentendo la gestione di un gran numero di campioni contemporaneamente. L'abbondanza microbica viene quantificata placcando fino a 96 omogenati interi di mosca su una singola piastra di agar in una serie di punti e quindi contando le unità formanti colonie (CFU) che crescono in ogni punto. Questo sistema galvanico è abbinato a una piattaforma di quantificazione CFU automatizzata, che incorpora la fotografia delle lastre, la differenziazione delle colonie fluorescenti e il conteggio automatico delle colonie utilizzando un plug-in ImageJ. I vantaggi sono che (i) questo metodo è abbastanza sensibile da rilevare le differenze tra i trattamenti, (ii) il metodo di placcatura a punti è accurato quanto i metodi galvanici tradizionali e (iii) il processo di conteggio automatizzato è accurato e più veloce del conteggio manuale. Il flusso di lavoro qui presentato consente la quantificazione ad alta produttività delle CFU in un gran numero di repliche e può essere applicato ad altri sistemi di studio microbiologico, inclusi modelli in vitro e altri piccoli animali.

Introduction

La relazione tra il microbiota intestinale e il loro ospite animale è sempre più in prima linea negli studi biologici1, che dimostrano che la composizione del ceppo del microbioma è importante per la fisiologia dell'ospite 2,3,4. Il ritmo della scoperta è stato limitato da fattori confondenti come l'elevata variazione interindividuale naturale e l'elevata diversità dei batteri colonizzatori 5,6,7. Il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è emerso come un modello promettente grazie al suo microbioma naturalmente a bassa diversità, alla facilità di manipolazione e alla robusta genetica dell'ospite 8,9,10,11. Le mosche possono essere rese prive di germi e riassociate a un microbiota definito12, ed è stato dimostrato che la flora influenza i tratti fisiologici della mosca13,14. La flora innata è costituita da un insieme limitato di batteri che sono tutti coltivabili, e parenti stretti di questi sono anche endogeni all'intestino dei mammiferi, tra cui lattobacilli, proteobatteri ed enterococchi15.

Studiare l'influenza del microbioma sui tratti dell'ospite richiede la quantificazione del microbioma in termini sia di quali specie sono presenti che delle loro abbondanze assolute16. I modi predominanti di analizzare il microbioma del moscerino sono la conta17 dell'unità formante colonie (CFU), il sequenziamento dell'amplicone del gene dell'rRNA 16S9 e la qPCR del gene 18 dell'rRNA16S. I conteggi dei CFU possono essere ottenuti senza costosi reagenti e confermano la vitalità delle cellule batteriche19. Le tecniche 16S, inclusa la qPCR, presentano vantaggi in quanto le identità tassonomiche dei microbi possono essere accertate indipendentemente dalle loro esigenze di crescita o dalle morfologie delle colonie20.

Nel caso in cui gli esperimenti utilizzino moscerini con un microbioma definito di batteri noti (mosche gnotobiotiche), i conteggi dei CFU presentano particolari vantaggi rispetto al sequenziamento21. Il sequenziamento è costoso e richiede l'estrazione del DNA, la preparazione della libreria basata sulla PCR e il sequenziamento ad alto rendimento per ottenere abbondanze relative22. A causa del costo elevato, i metodi di sequenziamento ad alta produttività devono in genere essere eseguiti in blocco per ridurre il prezzo per campione23. Ulteriori metodi come la qPCR sono necessari per ottenere abbondanze assolute16. Al contrario, i conteggi dei CFU sono veloci ed economici e forniscono il numero assoluto di cellule vitali. Drosophila8 e altri piccoli modelli di microbioma 24, tra cui il verme, Caenorhabditis elegans 25,26, e il pesce zebra larvale, Danio rerio, cresciuto gnotobioticamente 27, hanno una gamma limitata di batteri, che hanno caratteristiche di crescita note 28. In questi casi, in particolare con gli animali gnotobiotici, il conteggio dei CFU può differenziare tutte le specie di batteri all'interno delle comunità intestinali multispecie21,27,29. Metodi di conteggio CFU a più alto rendimento migliorerebbero ulteriormente l'efficacia in termini di costi e la velocità di misurazione della composizione del microbioma e potrebbero essere applicati a molti altri esperimenti di microbiologia.

Il conteggio dei CFU mediante diluizione seriale di una sospensione batterica su terreni di coltura a base di agar è un metodo standard nel campo della microbiologia. Le colonie che crescono sui piatti vengono quindi contate manualmente. Le diluizioni consentono al ricercatore di selezionare una densità di colonie che è numerabile (ad esempio, ~ 100 CFU per piastra), il che significa che le colonie non stanno crescendo l'una nell'altra e possono essere contate in un ragionevole lasso di tempo. La maggior parte dei microbiologi utilizza essenzialmente lo stesso metodo di conteggio CFU sviluppato 140 anni fa nel laboratorio di Robert Koch e, per molte applicazioni, questo metodo è ancora adeguato. Tuttavia, sorge un problema quando si cerca di quantificare un gran numero di campioni. Un singolo campione può richiedere la placcatura da 1 a 10 diluizioni seriali del campione per ottenere CFU numerabili, quindi gli esperimenti che coinvolgono più di qualche dozzina di campioni diventano gravosi. Sono stati sviluppati vari metodi per aumentare l'efficienza dell'enumerazione CFU. La placcatura a spirale automatizzata elimina la necessità di diluizioni seriali30, rendendo necessaria una sola piastra per il conteggio dei CFU, ma aumentando il tempo di placcatura del campione. SP-SDS (Single Plate-Serial Dilution Spotting) consente stime CFU da un minor numero di piastre per campione31. Questi metodi sono un miglioramento rispetto al tradizionale metodo di spalmatura, ma richiedono ancora la manipolazione e la placcatura di campioni batterici singolarmente e non sono, quindi, ideali per un'elevata produttività. La manipolazione dei campioni in piastre a 96 pozzetti e la placcatura a punti di quei 96 campioni su piastre rettangolari di agar migliorano notevolmente la produttività dei campioni19.

I microbiomi sono tipicamente composti da più ceppi e specie. Mentre le specie possono spesso essere distinte dalla morfologia della colonia o dai mezzi di crescita, la fluorescenza può essere impiegata per distinguere ulteriormente diversi tipi di batteri e i loro tratti di crescita32. Ad esempio, diversi genotipi della stessa specie possono essere etichettati con diverse proteine fluorescenti codificate geneticamente. I metodi di imaging delle piastre che incorporano la fluorescenza consentono ai ricercatori di sfruttare queste tecniche genetiche nei saggi basati su CFU32. L'incorporazione della fluorescenza nei metodi di conteggio dei CFU ad alta produttività migliorerebbe ulteriormente la loro utilità.

Il conteggio manuale dei CFU diventa complicato quando c'è un gran numero di campioni. Il conteggio automatico dei CFU può essere condotto fotografando la lastra ed elaborando l'immagine utilizzando un software specializzato33. Sieuwerts et al. hanno combinato la migliore efficienza galvanica della placcatura spot con il conteggio automatico delle colonie utilizzando la fotografia digitale convenzionale e il software ImageJ19.

Un metodo ad alto rendimento per lo screening dei fenotipi di specifici microbi e associazioni di ospiti aiuterebbe gli studi sull'assemblaggio della comunità del microbioma e l'impatto sulla salute e sulla forma fisica dell'ospite. Per gli studi sul microbioma della Drosophila , una piattaforma microbiologica ad alto rendimento includerebbe la gestione di campioni di mosca in formato piastra a 96 pozzetti, la lisi del moscerino senza lisi batterica, l'efficienza della placcatura spot, la capacità di utilizzare la fluorescenza e distinguere più fluorofori, un ambiente luminoso controllato per l'imaging riproducibile di piastre CFU e un affidabile software automatizzato di conteggio delle colonie. Questo articolo descrive un metodo ottimizzato per il dosaggio delle CFU nelle mosche gnotobiotiche, che è semplice, veloce e automatizzato. Questo protocollo delinea un nuovo flusso di lavoro che combina il meglio dei metodi precedentemente pubblicati e ottimizzato per esplorare il microbioma intestinale in Drosophila.

Protocol

1. Colonizzazione delle mosche

NOTA: Questo metodo è adatto per l'analisi quantitativa di mosche con un microbioma intestinale coltivabile mediante placcatura di crescita di CFU. Un protocollo dettagliato per l'allevamento di mosche gnotobiotiche è stato precedentemente pubblicato12.

  1. Stabilire una colonizzazione stabile da parte di una specie batterica commensale.
    1. Preparare una coltura batterica fresca, pellet mediante centrifugazione a 400 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e risospendere il pellet cellulare in PBS a un OD600 di 1,0. Per questo protocollo, Lactiplantibacillus plantarum (precedentemente noto come Lactobacillus plantarum) è stato coltivato durante la notte a un OD600 di 2.0.
    2. Pipettare 100 μL sul cibo in un flaconcino volante (vedere Tabella dei materiali). Distribuire uniformemente e lasciare assorbire il liquido per 15-30 minuti.
    3. Trasferire 20 moscerini privi di germi in questo flaconcino utilizzando la tecnica standard di capovolgimento da flaconcino a flaconcino34. Ogni mosca mangerà una quantità approssimativamente uguale della dose batterica35. In alternativa, è possibile aggiungere uova prive di germi.
    4. Trasferire le mosche al cibo fresco sterile ogni giorno per 3 giorni. Fai tutto questo in un armadio di biosicurezza e usa la tecnica sterile (Figura 1A-1).
  2. Prima di misurare il carico CFU, trasferire le mosche in una fiala contenente acqua di agar sterile per 4 ore per eliminare i batteri transitori dall'intestino. Le fiale di acqua di agar forniscono una fonte di umidità per la mosca, ma nessun nutrimento per la mosca o batteri sulla superficie. Sono preparati nelle stesse fiale sterili di mosca come con il cibo standard, ma contengono solo acqua deionizzata e l'1,5% di agar.

2. Omogeneizzazione delle mosche individualmente in una piastra PCR a 96 pozzetti

  1. Preparare in anticipo i piatti del battiperline.
    1. Versare perle di vetro da 0,5 μm (vedi Tabella dei materiali) sul vassoio di misurazione delle perline (stampato in 3D con l'aiuto del file di codifica supplementare 1 S1-bead-measurer.stl). Stendere le perline sul vassoio in modo che tutti i pozzetti siano pieni e livellati, quindi spazzolare via le perline in eccesso in un tubo conico per recuperarle.
    2. Posizionare una piastra PCR semi-bordata (vedere Tabella dei materiali) capovolta sul vassoio di misurazione e allinearla con i pozzetti inserendola nella rientranza sul vassoio di misurazione. Quindi, capovolgilo rapidamente per trasferire le perline.
    3. Rimuovere le perle in eccesso dalla superficie della piastra PCR e coprirla con un foglio. Ispezionare la piastra PCR per assicurarsi che tutti i pozzetti contengano perline. Utilizzare un misurino di pesatura se necessario per aggiungere perline a un singolo pozzetto. Se l'elettricità statica provoca l'adesione di perline sulle superfici delle piastre, pulire o spruzzare il retro del vassoio di misurazione e della piastra PCR con etanolo al 70%.
    4. Coprire con un foglio di alluminio. Molte piastre possono essere preparate in questo modo e quindi autoclavate e conservate per un uso successivo. Quando è pronto per l'uso, aggiungere 100 μL di PBS a ciascun pozzetto utilizzando il pipettatore a 96 canali (vedere Tabella dei materiali).
  2. Sterilizzare in superficie le mosche colonizzate da microbi (vedi fase 1) con etanolo al 70% prima dell'omogeneizzazione.
    1. Anestetizzare le mosche con CO 2 al 100% per 5 s. Trasferire i moscerini anestetizzati dalla fiala in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando un piccolo imbuto (Figura 1A-2). In questo studio, 25 mosche sono state tipicamente aggiunte per tubo.
    2. Spruzzare immediatamente ~ 1 mL di etanolo al 70% nel tubo, chiudere il tubo e mescolare per inversione per 10 s. Quindi, aspirare l'etanolo con una pipetta P1000, facendo attenzione a non aspirare mosche. Ripetere ancora una volta con etanolo, poi due volte con PBS sterile (Figura 1A-3).
  3. Dopo il lavaggio finale PBS, chiudere il tubo e, con il tappo rivolto verso il basso, picchiettarlo con forza alcune volte sulla panca in modo che le mosche entrino nel tappo.
  4. Aprire il tubo ed erogare le mosche nei pozzetti usando una pinza (Figura 1A-4). Posizionare una mosca in ciascun pozzetto (Figura 1A-5). Tenere la piastra sul ghiaccio durante il caricamento per mantenere le mosche anestetizzati.
  5. Sigillare la piastra utilizzando la pellicola termosaldante Thermal Bond (vedere la tabella dei materiali).
    1. Innanzitutto, rimuovere eventuali perline vaganti vicine ai pozzetti in quanto possono causare perdite nella guarnizione della lamina. Assicurarsi che il lato opaco della pellicola sia orientato verso il basso sulla piastra e il lato lucido verso l'alto verso il termosaldatore. Premere saldamente la termosaldatrice (vedi tabella dei materiali) per 5 s (figura 1A-6). Brunitura con l'applicatore manuale (vedi Tabella dei materiali) per fissare la pellicola.
      NOTA: una scarsa tenuta è una causa di perdita di campione.
  6. Fissare la piastra nello scuotipi. Omogeneizzare per 5 minuti (Figura 1A-7). Ruotare la piastra del tallone per 30 s in un mini-filatore a piastre (vedi tabella dei materiali) a 350 x g per rimuovere il liquido dalla pellicola di tenuta.
  7. Rimuovere la pellicola tenendo la piastra in modo da non spruzzare goccioline di omogenato di mosca fuori dai pozzi.

3. Diluizione seriale dell'omogenato di mosca e spotting su piastre CFU

  1. Collocare quattro piastre rettangolari di crescita dell'agar MRS (vedi Tabella dei materiali) nell'armadio di biosicurezza e rimuovere i coperchi. In questo protocollo, l'agar MRS è stato utilizzato per la crescita di L. plantarum. Lasciare asciugare questi piatti per almeno 10 minuti (20 minuti se sono appena versati o freddi dalla conservazione).
    NOTA: Se le piastre sono bagnate, le goccioline della piastra a 96 pozzetti scorreranno insieme e rovineranno i conteggi.
  2. Preparare tre piastre di diluizione aggiungendo 100 μL di PBS a ciascun pozzetto di una piastra sterile a 96 pozzetti utilizzando un pipettatore a 96 canali. Caricare un rack di punte P20 sul pipettor a 96 canali.
  3. Effettuare una diluizione 1:10 aspirando 11,1 μL di omogenato dalla piastra campione preparata nella sezione 2 (figura 1A-8). Assicurati di disegnare dal centro dei pozzetti piuttosto che dal fondo dei pozzetti perché l'omogenato di mosca e le perle di vetro ostruiranno le pipette. Le perline affondano e il particolato di mosca galleggia, lasciando lo strato intermedio per lo più chiaro.
  4. Erogare 11,1 μL nella prima piastra di diluizione, che contiene già 100 μL di PBS sterile per pozzetto. Mantenere la piastra di diluizione sullo scuotitore per 10 s a 600 giri/min. Mescolare nuovamente pipettando su e giù per cinque cicli. Trasferire 11,1 μL dalla prima piastra di diluizione alla seconda piastra di diluizione e ripetere le fasi di miscelazione per le due piastre di diluizione successive.
  5. Eseguire la placcatura in serie di diluizione come descritto di seguito.
    1. Recuperare le piastre di crescita dall'armadio di biosicurezza.
    2. Partendo dalla piastra più diluita, individuare 2 μL da ciascun pozzetto sulle piastre di agar usando il pipettor a 96 pozzetti (Figura 1A-9).
      1. Abbassare lentamente la testa del pipettor sulla piastra, facendo attenzione a non pugnalare l'agar. Esaminare attentamente la piastra e assicurarsi che tutte le macchie siano state erogate; in caso contrario, aggiungere manualmente 2 μL nella posizione appropriata. Controllare che le macchie liquide si impregnino rapidamente nell'agar e non corrano insieme.
      2. Se le macchie corrono insieme, asciugare un nuovo set di piastre di agar fresche per un periodo più lungo e rifare la macchia. Se ci sono più tipi di piastre (ad esempio, mezzi diversi o con antibiotici), individua anche quelli. Erogare nuovamente la soluzione rimanente nella piastra di diluizione e procedere alla concentrazione successiva più elevata.
        NOTA: quando si individuano le diluizioni, miscelare la diluizione successiva cinque volte per assicurarsi che il contenuto delle punte delle pipette sia stato eliminato dalla diluizione precedente. Le piastre di diluizione possono essere conservate >8 h a 4 °C senza influire sulla conta delle colonie35.
  6. Ripetere il processo di placcatura come descritto al punto 3.5 per le piastre di diluizione rimanenti, progredendo dalla più diluita alla più concentrata fino alla piastra con l'omogenato originale.
  7. Quando tutto il liquido è stato assorbito nell'agar, capovolgere le piastre e metterle nell'incubatrice (Figura 1A-10). Per Lactiplantibacillus e Acetobacter di Drosophila, la temperatura ottimale è di 30 °C su supporti MRS. Incubare fino a quando le colonie hanno raggiunto la dimensione ottimale: le colonie sono abbastanza grandi da vederle chiaramente ma non così grandi da fondersi o interferire con la crescita l'una dell'altra (vedere i risultati rappresentativi per la quantificazione della dimensione ottimale).
    NOTA: Le condizioni di crescita ottimali dipendono dalla deformazione e devono essere determinate empiricamente. Per Lactiplantibacillus da Drosophila, il tempo ottimale di incubazione è di 26 ore a 30 ore su agar MRS. Per Acetobacter da Drosophila, il tempo ottimale di incubazione è da 30 h a 48 h su MRS a seconda del ceppo.
  8. Dopo l'incubazione, conservare le piastre a 4 °C, se necessario, fino al momento del conteggio.

4. Quantificazione dei CFU

  1. Quantificare le CFU fotografando le lastre e quindi contando le colonie utilizzando un software automatizzato, come descritto di seguito. Se le piastre sono state conservate a 4 °C, prima lasciarle raggiungere la temperatura ambiente in modo che non ci sia condensa sulle piastre, che produce abbagliamento.
  2. Organizza le lastre in una sequenza logica e tienile in quell'ordine mentre fotografi: rende più facile dare un nome ai file. Orientare tutte le piastre in modo che A1 si trovi nell'angolo superiore sinistro per tutte le piastre. Si consiglia di etichettare l'angolo A1 con un ID univoco per garantire che non si confondano le foto. Impilare ogni serie di diluizione in ordine.
  3. Rimuovere il coperchio della piastra e posizionare la piastra sul palco con A1 orientato nell'angolo corretto. I disegni sono inclusi per la scatola fotografica della lastra (file supplementare 1, file supplementare 2), che è ottimizzata per fotografare queste piastre del vassoio e include opzioni di illuminazione e filtro per l'immagine di colonie fluorescenti.
  4. Immagina le tavole. Utilizzare la fotocamera (vedere Tabella dei materiali) con le impostazioni manuali per ottenere un livello di esposizione uniforme tra le lastre. Si consiglia di impostare una lunghezza focale lunga per ridurre al minimo la distorsione prospettica. Cattura la foto utilizzando un otturatore remoto per ridurre al minimo la sfocatura dovuta alle vibrazioni della fotocamera.
  5. Trasferisci le immagini su un computer e rinominale, incluso il nome dell'esperimento, il tipo di supporto, il fattore di diluizione e qualsiasi altro dettaglio pertinente. Alcuni sistemi operativi (vedere Tabella dei materiali) hanno un'utile funzione di ridenominazione batch nel Finder facendo clic con il pulsante destro del mouse su una selezione di file.

5. Conteggio automatico delle colonie utilizzando la suite Count-On-It (file supplementare 3)

  1. Ritaglia le immagini utilizzando il plug-in Croptacular fornito (Supplemental Coding File 2) per ImageJ. Questo plugin aiuta a dividere l'immagine in una serie ordinata di sottoregioni (ad esempio, 8 x 12 per una piastra da 96 pozzetti). Le sottoregioni saranno conteggiate singolarmente.
    Nota : un plugin separato per il conteggio di piastre circolari chiamato Circus è descritto nel Supplemental Coding File 3 Circus_.ijm.
    1. Organizzare le immagini da elaborare per la quantificazione in una cartella. Scegliete i nomi di file che distinguono le piastre, poiché questi nomi di file diventano titoli di colonna per ogni set di conteggi. All'interno di questa cartella, crea sottocartelle denominate "ritagliato" e "ricevute" .
    2. Avviare Croptacular e fare clic su OK per avviare il ritaglio.
      NOTA: le impostazioni predefinite vengono visualizzate e in genere sono sufficienti. A seconda della risoluzione dell'immagine, dell'illuminazione, della dimensione dello spot, ecc., Può essere utile regolare i parametri di base.
    3. Se l'immagine è già diritta, premi semplicemente la barra spaziatrice. In caso contrario, raddrizzare l'immagine disegnando una linea lungo un bordo che dovrebbe diventare orizzontale. Ridisegna la linea tutte le volte che è necessario se l'immagine non appare ancora raddrizzata.
    4. Quindi, disegna una casella di confine dell'area per la quale deve essere eseguito il conteggio. Regola le dimensioni e le proporzioni fino a quando tutti i punti sono all'interno delle loro celle. Trascinare il cursore all'esterno della casella del limite per aggiornare la griglia. Quando la griglia sembra buona, premere Spazio.
    5. Assicurati che l'immagine successiva ruoti automaticamente con la stessa angolazione della prima; Il plugin presuppone che tutte le foto siano allineate allo stesso modo. Se questo è corretto, premere la barra spaziatrice per continuare. Altrimenti, raddrizzare l'immagine come prima. La griglia richiama anche la stessa posizione dell'immagine precedente; regolare se necessario, quindi premere la barra spaziatrice.
  2. Enumerare le colonie sulle piastre utilizzando il plug-in Count-On-It: Gridiron fornito per ImageJ (Supplemental Coding File 4). Istruzioni dettagliate per l'installazione e l'utilizzo del plugin sono incluse nel file supplementare 3.
    1. Avvia Count-On-It > Gridiron. Utilizzare le stesse impostazioni della griglia di Croptacular. Gli utenti possono raggruppare un'intera cartella, analizzare una singola immagine o iniziare dall'immagine corrente.
    2. Imposta la soglia in base a un valore di intensità dei pixel superiore e inferiore. Rendi la soglia il più rigorosa possibile pur selezionando tutte le colonie. Idealmente, ci sarà un po 'di spazio tra le colonie selezionate, ma il software è in grado di segmentare i blob in una certa misura. Fare clic su OK nella finestra di dialogo "Azione richiesta" quando la soglia è soddisfacente.
    3. Per ispezionare i risultati, ingrandisci e guarda più da vicino i conteggi delle colonie. Facendo clic su Annulla il plug-in verrà interrotto. Fare clic su OK per continuare.
    4. Nella prima immagine, assicurarsi che sia data l'opzione per procedere o tornare al menu di configurazione, ad esempio, per modificare la dimensione minima della colonia. Per procedere con il processo batch, fare clic su OK. Quindi, selezionare una cartella per conservare la tabella delle ricevute e dei risultati. Utilizzare la cartella "ricevute" o creare una nuova cartella.
    5. Dopo la prima immagine, le immagini successive verranno impostate per impostazione predefinita sulla stessa soglia delle impostazioni precedenti. Fare clic su OK per utilizzare queste impostazioni o modificare le impostazioni. Se le foto sono coerenti e l'impostazione è accurata, fare clic su OK nella finestra di dialogo "Azione richiesta".
      NOTA: una volta completate tutte le immagini del batch, la tabella dei risultati viene salvata automaticamente nella stessa cartella delle ricevute.
    6. Esaminare le ricevute di conteggio prodotte dal software e correggere manualmente eventuali errori di conteggio. Il plug-in ImageJ è statisticamente accurato, ma si verificano errori. Prova le ricevute per esaminare i valori anomali e identificare i conteggi errati. Il software salva i dati CFU come file .csv nella stessa cartella delle ricevute.
  3. Analizza i dati utilizzando il software preferito dall'utente.

Representative Results

Enumerazione di CFU in centinaia di singole mosche in formato piastra a 96 pozzetti utilizzando il saggio di colonizzazione
Per comprendere la composizione di molti singoli microbiomi di mosca, i CFU sono stati misurati utilizzando il protocollo di accompagnamento, che ha permesso l'identificazione delle specie presenti, la percentuale di mosche colonizzate e l'abbondanza assoluta di batteri in ogni mosca. Le ragioni della grande variazione osservata da individuo a individuo nella composizione del microbioma sono poco conosciute e quantificare la distribuzione statistica della colonizzazione può aiutare a studiare questa variazione36,37. Per ottenere un numero significativo di repliche biologiche, è stata sviluppata una pipeline ad alto rendimento per la quantificazione dell'abbondanza microbica in molte singole mosche utilizzando conteggi CFU (Figura 1A).

La quantificazione finale delle CFU può essere influenzata dal modo in cui le mosche vengono gestite prima dell'analisi, ad esempio fattori quali la sterilizzazione superficiale, il tempo trascorso dal consumo di batteri e l'eliminazione dei batteri transitori dall'intestino. In primo luogo, concentrandosi sulla specie batterica commensale Drosophila L. plantarum (Lp; vedi Lp ceppo WF in Obadia et al.36), le mosche sono state alimentate con una dose di ~ 105 CFU di Lp e tenute in gruppi di 25 mosche per fiala. Questi moscerini sono stati tenuti nella stessa fiala per 3 giorni o trasferiti giornalmente (trasferiti) in alimenti freschi e sterili (Figura 1B). Le mosche non trasferite sono state quindi lavate in etanolo per rimuovere i batteri superficiali (lavate) o non lavate (non lavate). Il lavaggio ha prodotto una riduzione non significativa dei CFU totali misurati (Figura 1B), indicando che in queste condizioni di inoculazione altamente controllate, la superficie della mosca non viene colonizzata in modo significativo dai batteri in 3 giorni. Gli altri gruppi di mosche sono stati trasferiti ogni giorno per ridurre l'accumulo di batteri dalla crescita sul cibo (Transferred); inoltre, un gruppo è stato trasferito al cibo fresco per 4 ore prima del campionamento (post-trasferito), oppure sono stati messi in fiale con solo acqua di agar sterile per 4 ore (eliminata) per consentire ai microbi ingeriti transitoriamente di eliminare dall'intestino. Ognuno di questi passaggi per fornire una misurazione della colonizzazione più rigorosa ha prodotto una riduzione statisticamente significativa dell'abbondanza di CFU nelle mosche, ad eccezione del lavaggio superficiale in etanolo. Il trasferimento in alimenti sterili (post-trasferimento) o acqua di agar (eliminato) per 4 ore prima della misurazione ha prodotto effetti indistinguibili, indicando che il trasferimento a condizioni sterili 4 ore prima della misurazione riduce la carica batterica. Questo risultato è coerente con l'interpretazione che alcuni batteri intestinali nell'intestino del moscerino sono transitori, mentre altri sono più stabilmente associati35. L'abbondanza di Lp variava da 1 x 10 4,3 CFU/mosca nelle mosche cancellate a 1 x 104,9 CFU nelle mosche non lavate (n = 724 mosche).

Successivamente, lo stesso test è stato condotto utilizzando Acetobacter indonesiensis (Ai), un batterio gram-negativo che colonizza l'intestino della mosca (Figura 1C; vedi ceppo Ai SB003 in Obadia et al.36). Come per le mosche colonizzate da Lp, la sterilizzazione superficiale ha prodotto una riduzione non significativa delle CFU. Allo stesso modo, il trasferimento giornaliero al cibo sterile ha ridotto significativamente la carica batterica e il trasferimento a condizioni sterili per 4 ore prima dell'omogeneizzazione ha prodotto un'ulteriore riduzione della carica batterica. L'abbondanza di Ai variava da 1 x 104,7 CFU / mosca nelle mosche eliminate a 1 x 105,0 CFU nelle mosche non lavate (n = 528 mosche). Pertanto, una quantificazione accurata dei batteri intestinali dipende dalla frequenza del trasferimento, incluso il giorno del trasferimento. La rimozione della carica batterica esterna mediante lavaggio in etanolo ha avuto un effetto non significativo, ma effetti più significativi possono essere osservati per diversi ceppi di batteri o diverse condizioni di coltura. Questi fattori dovrebbero essere controllati sperimentalmente.

È stato inoltre testato il potenziale effetto del metodo di omogeneizzazione sulla conta dei CFU. Le mosche sono state omogeneizzate usando un battiperline con perle di vetro da 0,5 μm in 100 μL di PBS, che potrebbe ridurre la vitalità delle cellule batteriche. In primo luogo, una sospensione di batteri Lp dalla coltura è stata preparata in PBS e quindi placcata per contare le CFU come controllo positivo. La stessa coltura è stata posta nella piastra del battiperline e (i) omogeneizzata con perline, (ii) omogeneizzata con perline e una mosca priva di germi, o (iii) omogeneizzata in PBS senza perline (Figura 1D). L'omogeneizzazione nelle perle quando era presente una mosca non ha avuto un impatto significativo sull'abbondanza di cellule vitali in soluzione, mentre l'omogeneizzazione dei batteri in assenza di una mosca ha ucciso un numero significativo di cellule batteriche. L'omogeneizzazione in PBS senza perline ha anche ridotto significativamente il numero di cellule vitali. Allo stesso modo, la vitalità dell'Ai è stata preservata quando omogeneizzata in presenza di una mosca, mentre l'omogeneizzazione senza una mosca ha ridotto il numero di cellule vitali in soluzione (Figura 1E). Questi risultati indicano che il tessuto della mosca protegge i batteri dall'essere distrutti dalle perline durante l'omogeneizzazione. Tuttavia, gli esperimenti in Figura 1D e Figura 1E sono stati eseguiti con più di 10 8 CFU per pozzetto. In pratica, i pozzetti con ~ 106 cellule per pozzo o meno sono stati trovati per mostrare poca perdita di cellule quando le perle sono state utilizzate senza mosca. Il raffreddamento della piastra sul ghiaccio a metà della battitura delle perline migliora anche la vitalità delle cellule. L'importanza di questi risultati è che i lettori dovrebbero essere consapevoli di questi potenziali problemi e progettare controlli appropriati per il loro caso d'uso specifico.

Accuratezza delle piastre di placcatura spot a 96 pozzetti per la quantificazione CFU ad alta produttività
Poiché l'obiettivo è misurare l'abbondanza di CFU per centinaia di migliaia di singole mosche, i metodi tradizionali di placcatura diffusa richiedono tempo e materiale proibitivi. La placcatura spot è un metodo efficace ed efficiente per la crescita e l'enumerazione dei CFU19,31. Il metodo di placcatura spot utilizza un pipettor a 96 canali per erogare 2 μL di sospensione batterica su supporti preparati in piastre rettangolari (Figura 2A). Ogni punto rappresenta la carica batterica di un singolo campione, quindi 96 mosche possono essere analizzate con una singola piastra (Figura 2B). L'accuratezza della placcatura spot è stata confrontata con la placcatura tradizionale inoculando piastre di crescita utilizzando esattamente la stessa sospensione di Lp 0,0001 OD per entrambi i metodi. La sospensione è stata diluita due volte in serie cinque volte in PBS. Come confronto testa a testa, 50 μL dell'inoculo sono stati distribuiti su singole piastre rotonde, oppure 2 punti μL sono stati fatti su piastre MRS rettangolari. Le piastre sono state poi incubate a 30 °C fino a quando le colonie sono state contabili. I conteggi dei CFU risultanti per ciascuna diluizione sono stati utilizzati per calcolare la concentrazione originale della sospensione e confrontati (Figura 2C). Le piastre rotonde con 50-500 CFU sono state contate come controllo. Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra i metodi di placcatura rotonda ad alta produttività e quelli tradizionali.

Poiché la densità delle colonie può influenzare la loro crescita e quantificazione, è stato testato l'effetto della densità dei CFU sui conteggi finali. Gli spot con da 2 a 25 colonie per punto non hanno mostrato alcuna differenza nel conteggio finale rispetto al tradizionale metodo a piastre rotonde (Figura 2C). Le macchie con una media di 35 colonie hanno prodotto risultati leggermente inclinati rispetto alle piastre di diffusione di controllo (Figura 2C; p = 0,0017). Un attento esame delle fotografie dei singoli punti ha indicato che questa inclinazione era dovuta alla sovrapposizione di colonie in punti densi. Le misurazioni basate su punti con una media di 11 colonie per punto hanno portato a concentrazioni più vicine a quelle basate sulle placche diffuse (Figura 2C; Piastre di diffusione: media = 1 x 104,4 CFU; SD = 0,086 vs. macchie con 11 colonie medie: media = 1 x 104,4 CFU; SD = 0,12, p = 0,42, test t di Welch).

Generazione di immagini di alta qualità per la quantificazione utilizzando una piattaforma fotografica specializzata con luce bianca o fluorescenza
La placcatura spot ad alta produttività genera naturalmente un gran numero di aree target, che devono essere contate con precisione. Fotografie di qualità possono essere utilizzate per documentare i dati e per facilitare il conteggio dei CFU. È stata sviluppata una piattaforma fotografica robusta e semplice utilizzando materiali disponibili in commercio (Figura 3A). Una fotocamera digitale era attaccata a una staffa sulla parte superiore di una scatola luminosa costruita su misura, chiamata FluoroBox, ed era puntata direttamente verso il basso, perpendicolarmente al centro della piastra. Un filtro di emissione colorato è stato posizionato opzionalmente davanti all'obiettivo utilizzando un cursore del filtro. Uno schermo luminoso ha impedito il riflesso dell'obiettivo bloccando la luce diretta dalle strisce LED sottostanti. Le strisce LED illuminavano la piastra dai lati, piuttosto che dall'alto, per evitare l'abbagliamento sulla piastra. Oltre alla luce bianca, sono stati utilizzati LED blu e verdi monocolore per eccitare rispettivamente le proteine fluorescenti verdi e rosse. La piastra era tenuta in posizione da un portapiatti sul cassetto e il cassetto era dotato di cursori del cassetto per facilitare l'inserimento della piastra. I progetti completi sono disponibili nel file supplementare 1 e nel file supplementare 2.

Una foto di una piastra spot di colonie di Lp è stata scattata utilizzando LED a luce bianca e una fotocamera digitale per aiutare a contare le colonie e distinguere diversi colori e morfologie (Figura 3B). Per verificare che l'intensità luminosa fosse uniforme, l'intensità di fondo dell'agar è stata misurata in diverse regioni di una fotografia su lastra (Figura 3C). Per dimostrare che le colonie possono essere chiaramente distinte dallo sfondo, è stata misurata l'intensità attraverso il diametro di 10 diverse colonie su diverse parti della piastra e si è scoperto che è circa ~ 300% superiore allo sfondo (Figura 3C). La piastra è stata inoculata con Lp con un plasmide fluorescente che esprime proteine mCherry, così come alcuni Lp che non contenevano il plasmide, quindi le colonie erano mCherry-positive o mCherry-negative. Per distinguere questi due tipi di colonie, la lastra è stata fotografata utilizzando la stessa fotocamera con luce LED verde (515-525 nm) e un filtro rosso (Tiffen #29), causando la fluorescenza delle colonie mCherry-positive (Figura 3D). La differenza di intensità tra mCherry-positivo e mCherry-negativo è stata quantificata misurando l'intensità su un campione di colonie (n = 10 colonie). Le colonie mCherry-positive avevano un'intensità ~ 1.000% più alta rispetto a mCherry-negative (Figura 3E). Le colonie di Ai che esprimono GFP e le colonie di Ai che non esprimono fluorescenza sono state fotografate utilizzando luci LED blu (465-475 nm) e un filtro verde (Tiffen #58) (Figura 3F). Le colonie GFP-positive hanno mostrato un'intensità superiore del 200% rispetto alla GFP-negativa (Figura 3G).

Conteggio automatico dei CFU su piastre spot utilizzando il plug-in personalizzato ImageJ Count-On-It
Le foto da sole aiutano a contare le colonie (ad esempio, memorizzando i dati, condividendo i dati, ingrandendo, contrassegnando una sovrapposizione, separando i colori, ecc.). Tuttavia, l'atto di contare e organizzare manualmente i risultati di centinaia di punti può essere noioso, richiedere molto tempo e soggetto a differenze da uomo a uomo nei conteggi finali. Per accelerare il processo di conteggio e standardizzare la riproducibilità dei conteggi, è stato sviluppato un plug-in ImageJ specializzato chiamato Count-On-It (Figura 4A). Questo plug-in consente un conteggio semi-automatico accurato dei CFU su piastre agar. L'utente prepara le immagini per il conteggio ritagliandole e raddrizzandole utilizzando il plug-in Croptacular aggiuntivo. Le foto possono essere opzionalmente elaborate in batch e la soglia può essere regolata per ogni lastra. Diverse altre opzioni consentono all'utente di aumentare la precisione del conteggio delle piastre, tra cui la regolazione delle lunghezze d'onda della luce (immagini RGB), l'impostazione di un intervallo di dimensioni della colonia (in pixel), la modifica delle proporzioni massime e la personalizzazione delle dimensioni della griglia di selezione attiva. Count-On-It genera una tabella di risultati con ogni piastra rappresentata come una colonna di conteggi CFU. Genera inoltre una ricevuta fotografica che mostra una sovrapposizione per documentare visivamente i risultati del conteggio e aiutare nella correzione manuale degli errori (Figura 4B). Sebbene si verifichino errori, quando il numero di colonie contate manualmente è stato confrontato con il numero di colonie contate utilizzando questo plug-in (Figura 4C), la relazione era generalmente equivalente, con una regressione lineare tra i conteggi manuali e automatici che mostrava una pendenza di 0,95 con una precisione superiore al 90% (R2 = 0,93), sebbene l'errore aumentasse quando il numero di colonie superava 20.

Count-On-It può anche essere utilizzato per contare separatamente le colonie fluorescenti utilizzando la funzione di fluorescenza del FluoroBox. I conteggi delle colonie mCherry-positive (Figura 4D) per plug-in software rispetto al manuale avevano un R2 di 0,92 (Figura 4E). Allo stesso modo, le colonie GFP-positive (Figura 4F) conteggiate con plug-in software rispetto al manuale avevano un R2 di 0,90 (Figura 4G). Le colonie fluorescenti e non fluorescenti possono essere distinte all'interno di un singolo campione e le dimensioni e la forma della colonia possono essere utilizzate per distinguere sottopopolazioni separate (Figura 4H-K). Le ricevute fotografiche forniscono un record che consente all'utente di verificare rapidamente l'accuratezza dei conteggi e correggere manualmente gli errori. Nella Figura 4C,E,G,I,K, le ricevute fotografiche non sono state utilizzate per migliorare l'accuratezza del conteggio in modo che i lettori possano vedere l'output grezzo del metodo. Casi come nella Figura 4G, in cui un conteggio manuale di 1 ha prodotto un conteggio automatico di 21, possono essere rilevati rapidamente utilizzando le ricevute fotografiche. In questo caso, l'abbagliamento sul bordo della piastra ha creato macchie che sono state contate come colonie. Per ogni caso d'uso, le impostazioni ottimali per il plug-in software devono essere determinate prima del conteggio della velocità effettiva elevata.

Figure 1
Figura 1: Il saggio di colonizzazione misura i CFU in centinaia di singole mosche utilizzando un formato a piastra a 96 pozzetti. (A) Panoramica pittorica del saggio di colonizzazione e del metodo di quantificazione ad alto rendimento utilizzato come descritto nella sezione del protocollo. (B) L'abbondanza di Lactiplantibacillus plantarum (Lp) nei moscerini dopo il test di colonizzazione è stata misurata in condizioni variabili utilizzando il metodo di quantificazione CFU ad alto rendimento. Le mosche sono state tenute nella stessa fiala per 3 giorni e poi omogeneizzate e placcate (non lavate), lavate in etanolo prima della placcatura (lavate), lavate e trasferite ogni giorno (trasferite), trasferite giornalmente e poi tenute su cibo sterile prima della placcatura (post-trasferita), o conservate in flaconcini con solo acqua per 4 ore (eliminato) (n = 724 mosche in totale, 3 repliche biologiche e ~ 72 mosche totali per trattamento). (C) Lo stesso test di cui al punto (B) è stato condotto utilizzando Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 mosche). (D) La sospensione batterica di Lp è stata preparata in PBS e poi placcata per contare i CFU o prima omogeneizzata mediante battitura di perline, battuta a perline in combinazione con una mosca priva di germi (GF) o scossa sul battiperline senza perline o una mosca (n = 236 pozzetti campione). (E) La vitalità dell'IA dopo l'omogeneizzazione è stata testata nello stesso modo di cui al punto (D) (n = 282 pozzetti campione). La significatività statistica per i pannelli (B-E) è stata calcolata utilizzando un test di Kruskal-Wallis seguito da test a coppie di Wilcoxon con correzione dei confronti multipli di Bonferroni. Box fornisce un intervallo interquartile. La linea indica la mediana. I baffi danno una gamma totale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Accuratezza delle piastre di placcatura spot a 96 pozzetti per la quantificazione di CFU ad alta produttività. (A) Placcatura a punti con un pipettor a 96 canali per erogare 2 μL su supporti preparati in piastre rettangolari. (B) Piastra di crescita MRS-agar con 96 macchie di colonie di Lp . (C) Concentrazione della sospensione di Lp basata sulla conta dei CFU delle piastre rotonde tradizionali (n = 24 piastre) rispetto alla concentrazione basata sulla conta dei CFU delle piastre spot (n = 680 punti) diluiti in serie e disposti in base alla conta media delle colonie per spot (sono stati contati ~48 punti per ogni singolo fattore di diluizione per tre piastre replicate). Ogni punto dati rappresenta le colonie esatte per punto, mentre ogni colonna rappresenta le colonie medie per quella diluizione. La linea tratteggiata orizzontale indica il conteggio CFU calcolato della coltura placcata. I punti delimitati in verde evidenziano il tradizionale conteggio delle piastre rotonde. I punti riempiti di rosso evidenziano la densità ottimale della colonia di 11 CFU per 2 μL spot. La significatività statistica è stata calcolata utilizzando l'ordinario ANOVA unidirezionale confrontando la media di ciascuna colonna con la media della colonna di controllo della piastra di diffusione con la correzione dei confronti multipli di Bonferroni. Box fornisce un intervallo interquartile. La linea indica la mediana. I baffi danno una gamma totale. **p < 0,01. ns = non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Una piattaforma fotografica produce immagini quantificabili di lastre utilizzando luce bianca o fluorescenza . (A) Panoramica del design del FluoroBox. (B) Foto di una lastra spot di colonie di Lp usando luce bianca. (C) Profilo di intensità delle singole colonie sotto luce bianca rispetto all'intensità dello sfondo (BKG) (n = 10 colonie, la linea tratteggiata rappresenta la deviazione standard). (D) Foto della stessa piastra spot di (B), utilizzando luci verdi monocolore e il filtro rosso per selezionare le colonie di Lp mCherry-positive. (E) Profilo di intensità delle singole colonie che illustra la differenza tra colonie con e senza emissione di mCherry. (F) Foto di una piastra spot contenente colonie di Ai , alcune delle quali hanno un'etichetta GFP. (G) Profilo di intensità delle singole colonie che illustra la differenza tra colonie GFP-negative e GFP-positive. E, F, G: n = 10 colonie per ogni appezzamento. I diametri delle colonie sono di circa 1,5 mm. La linea tratteggiata è SD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Conteggio accurato delle piastre spot mediante il plug-in Count-On-It ImageJ. (A) Screenshot della finestra di configurazione del plug-in. (B) Il plug-in genera una ricevuta per documentare il conteggio e aiutare nella correzione degli errori. Inserire: Sovrapposizione con il numero di colonie contate per ogni regione spot; Il contorno giallo indica che è stata contata una singola colonia e rosso che sono state contate più colonie. (C) Grafico che mostra il numero di colonie contate manualmente rispetto al numero di colonie contate utilizzando il plug-in (automatizzato) quando è stata utilizzata un'immagine a luce bianca, dove ogni punto sul grafico rappresenta un singolo punto conteggiato manualmente o automaticamente (pendenza di adattamento = 0,95, linea ciano; la linea 1:1 è punteggiata in rosso; R2 = 0,93, coefficiente di correlazione di Pearson, p < 0,0001). (D) Immagine della ricevuta fotografica dal plug-in quando sono state selezionate le colonie mCherry-positive utilizzando la funzione di fluorescenza della scatola fotografica. (E) Grafico che mostra il numero di colonie mCherry-positive contate usando manualmente rispetto al metodo automatizzato quando è stata utilizzata la fluorescenza rossa (pendenza di adattamento = 1,1, linea ciano; la linea 1:1 è tratteggiata in rosso; R2 = 0,92, coefficiente di correlazione di Pearson, p < 0,0001). Si noti che i valori anomali e gli errori non sono stati corretti utilizzando le ricevute di analisi per E,G,I,K. (F) Immagine della ricevuta fotografica dal plug-in quando sono state selezionate colonie GFP-positive utilizzando la funzione di fluorescenza verde della scatola fotografica e selezionando il canale verde con il plug-in. (G) Grafico che mostra il numero di colonie GFP-positive contate utilizzando manualmente rispetto al metodo automatizzato quando è stata utilizzata l'illuminazione a fluorescenza verde (pendenza di adattamento = 1,1, linea ciano; la linea 1:1 è tratteggiata in rosso; R2 = 0,90, coefficiente di correlazione di Pearson, p < 0,0001). (H) colonie mCherry-positive selezionate da morfologie di colonie miste utilizzando un'elevata soglia di fluorescenza nel plug-in. (I) Grafico che mostra il numero di colonie mCherry-positive contate utilizzando manualmente rispetto al metodo automatizzato quando è stata utilizzata l'illuminazione a fluorescenza rossa (pendenza di adattamento = 0,99; R2 = 0,91, coefficiente di correlazione di Pearson, p < 0,0001). (J) colonie mCherry-negative selezionate da morfologie di colonie miste utilizzando una bassa soglia di fluorescenza. (K) Grafico che mostra il numero di colonie mCherry-negative contate utilizzando manualmente rispetto al metodo automatizzato quando la soglia di intensità è stata impostata per selezionare colonie non fluorescenti (pendenza di adattamento = 1,1; R2 = 0,85, coefficiente di correlazione di Pearson, p < 0,0001). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: istruzioni di montaggio FluoroBox. Questo file guida il lettore passo dopo passo attraverso la costruzione della scatola di illuminazione controllata utilizzata nel video. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: FluoroBox acrilico tagliato al laser. Questo file fornisce un modello di taglio per tagliare al laser i pezzi acrilici per la scatola di illuminazione controllata. Il file può essere inviato a un fornitore di acrilico tagliato al laser. Vedere la tabella dei materiali per il fornitore utilizzato in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 3: istruzioni software. Questo file guida il lettore passo dopo passo attraverso l'installazione e l'utilizzo del software Croptacular e Count-On-It fornito con questo protocollo. Clicca qui per scaricare questo file.

Supplemental Coding File 1: codice di stampa 3D per vassoio di misurazione delle perline (S1-bead-measurer.stl). Clicca qui per scaricare questo file.

Supplemental Coding File 2: Rectangular plate photo cropper ImageJ plugin (Croptacular_.ijm). Clicca qui per scaricare questo file.

Supplemental Coding File 3: Round plate photo cropper plugin (Circus_.ijm). Clicca qui per scaricare questo file.

Supplemental Coding File 4: Rectangular plate 96 spot counter plugin (Gridiron_.ijm). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Le tecniche dettagliate qui presentate consentono un aumento di >100 volte del numero di campioni che possono essere valutati in un esperimento di conteggio CFU. Questa tecnica fa progredire i metodi esistenti per gli esperimenti sul microbioma in Drosophila 12,35,36 utilizzando il formato a piastra a 96 pozzetti per saggiare le singole mosche. Inoltre, applica un metodo di placcatura spot più efficiente 19,31 e un flusso di lavoro automatizzato con una piattaforma di fotografia e conteggio delle colonie. Il significato di questo metodo per Drosophila è quello di standardizzare gli esperimenti al formato a piastra a 96 pozzetti, che consente la gestione simultanea di un gran numero di repliche biologiche con l'automazione per ottenere una quantificazione ad alto rendimento delle CFU.

La piattaforma a 96 pozzetti mostra che l'aumento della frequenza di trasferimento e la "pulizia" dei batteri transitori provoca una significativa riduzione sia dell'abbondanza media che della variazione tra i campioni (Figura 1B, C), dimostrando il rigore di questo protocollo migliorato. Una limitazione delle mosche co-housing è il trasferimento orizzontale di batteri tra le mosche. Una soluzione proposta è quella di tenere le mosche individualmente in un formato a piastra a 96 pozzetti, come l'intero Animal Feeding Flat38.

Sebbene non sia stata osservata una significativa riduzione della carica batterica quando le mosche sono state lavate in etanolo, queste mosche sono state tenute in presenza di batteri esterni solo per 3 giorni. L'alloggiamento per periodi di tempo più lunghi potrebbe consentire a una maggiore carica batterica diaccumulare 39. Pertanto, il lavaggio in etanolo è ancora raccomandato.

Il trasferimento delle mosche nella piastra a 96 pozzetti è il primo passo fondamentale per impostare il flusso di lavoro (Figura 1A). Una volta lavate, le mosche vengono distribuite nei pozzetti una alla volta. Un grafico a piastre è utile in questa fase per annotare quali condizioni sono presenti in ogni pozzo e aggiungere eventuali note come "la mosca è stata persa". L'omogeneizzazione è un altro passo critico con alcuni importanti avvertimenti. I batteri sopravvivono al processo di omogeneizzazione quando sono in presenza di una mosca (Figura 1D, E), e presumibilmente, questo principio è vero anche quando i batteri sono all'interno dell'intestino della mosca. Tuttavia, i batteri vengono uccisi anche quando vengono omogeneizzati solo nelle piastre battiperline, dimostrando che l'omogeneizzazione può uccidere le cellule batteriche in determinate circostanze, una limitazione che può essere importante se si omogeneizzano budella sezionate, per esempio. In particolare, la perdita di CFU durante l'omogeneizzazione dipende dal numero di CFU nel campione e la perdita è minima quando vengono utilizzati ~ 105 CFU per pozzo. Un'ulteriore conservazione dei CFU può essere ottenuta fermando l'omogeneizzazione a metà e raffreddando la piastra su ghiaccio.

L'omogeneizzazione è stata eseguita per 5 minuti in questo protocollo sulla base di esperimenti di controllo in cui un numero noto di CFU è stato miscelato con una mosca priva di germi, e questo ha funzionato empiricamente per i batteri della mosca. Meno battiti hanno causato la presenza di parti di mosca più grandi, che interferiscono con il pipettaggio, mentre tempi di omogeneizzazione significativamente più lunghi di ~ 10 minuti hanno reso i conteggi dei CFU più variabili. Il volume più piccolo e la forma angolata dei pozzetti conici a piastre sono stati osservati per ridurre l'efficienza del battito delle perline rispetto ai tubi cilindrici da 2 ml. Sono possibili molte varianti di questo approccio generale, tra cui quali ceppi batterici, quale contenitore di battitura delle perline, quali perline e quale genotipo di mosca vengono utilizzati. I singoli casi utente devono utilizzare controlli positivi per stabilire il loro approccio.

Il metodo di placcatura spot è stato impiegato in un modo specifico: diluizioni 1:2 di L. plantarum WF in PBS sono state individuate su piastre MRS e incubate a 30 °C per 2 giorni (tempi di incubazione più brevi possono essere implementati per generare colonie più piccole). Il metodo richiede alcuni investimenti iniziali in attrezzature, principalmente il batticordone e il pipettor a 96 canali (Figura 2A), necessari sia per la serie di diluizione che per la placcatura spot. Tuttavia, sono disponibili opzioni meno costose, tra cui un replicatore di piastre a 96 pozzetti con perni scanalati. La serie di diluizione è un passaggio critico che influisce sull'accuratezza dei risultati del conteggio dei CFU. In termini di modalità di guasto, è possibile ostruire le punte delle pipette con parti di mosca o perline di vetro e che le punte delle pipette non si chiudano correttamente sul pipettatore o si guastino per qualche altro motivo. Tutti questi problemi comportano una sottostima dei pozzi interessati e dovrebbero essere monitorati. Anche una miscelazione adeguata in ogni fase della serie di diluizione è fondamentale. Ogni diluizione deve essere miscelata accuratamente mettendo la piastra su uno scuotitore di piastre o pipettando su e giù 15-20 volte, che serve anche a risciacquare le punte. Individuando dalla piastra più diluita a quella meno diluita, le punte possono essere riutilizzate per l'intera serie di diluizione. Con diluizioni 1:2, il conteggio è accurato su un intervallo di 2-25 colonie, che copre un ordine di grandezza (Figura 2C). Pertanto, le diluizioni 1:10 consentono di risparmiare tempo e materiali. Un'altra variabile che può essere sfruttata è il tempo di incubazione, che può essere regolato per produrre colonie più piccole e, quindi, aumentare la gamma di punti numerabili impedendo la fusione di colonie adiacenti.

Una foto di qualità della lastra è essenziale in quanto diventa la fonte grezza dei dati da cui vengono analizzati i CFU e possono essere archiviati indefinitamente. Il FluoroBox è progettato per produrre foto delle lastre con intensità luminosa uniforme, che riduce al minimo l'abbagliamento sulla superficie dell'agar. Inoltre, il design è in grado di fotografare selettivamente colonie fluorescenti utilizzando luci LED monocolore e filtri fotografici colorati (Figura 3A). La costruzione di una configurazione come il FluoroBox, con illuminazione controllata e impostazioni della telecamera, può aumentare notevolmente la riproducibilità delle immagini CFU, che è importante per l'analisi automatizzata. Le morfologie delle colonie, l'intensità della fluorescenza e gli effetti del tempo o della densità sulla crescita delle colonie sono solo alcune delle proprietà che possono essere analizzate utilizzando le fotografie. La scatola fotografica può essere costruita senza i filtri colorati e le luci monocolore se non vengono utilizzati batteri fluorescenti, riducendo i costi e la complessità. Diverse luci di eccitazione e filtri di emissione potrebbero essere sostituiti a quelli raccomandati qui se un fluoroforo diverso viene utilizzato da un laboratorio. Una fotocamera collegata a un tablet tramite WiFi tramite un'app è utile sia per la funzione di otturatore automatico per prevenire l'agitazione che per facilitare il trasferimento dei dati. Le immagini possono essere trasferite sul tablet e quindi su un laptop utilizzando il software di trasferimento file wireless. Le fotocamere consigliate con queste funzionalità sono indicate nella tabella dei materiali.

Count-On-It è un plug-in scritto in ImageJ. Il software di conteggio CFU automatizzato segmenta l'immagine della lastra in una griglia uniforme a 96 pozzetti, conta le colonie in ogni cella della griglia e raggruppa i risultati in un semplice foglio di calcolo. Poiché vi è sempre una variazione nella posizione della griglia spot sulla lastra e nella foto, l'utente deve conformare manualmente la griglia alla foto utilizzando il plug-in Croptacular. Questo aiuta anche a escludere le aree vicino al bordo della piastra, che hanno abbagliamento. L'impostazione della soglia è fondamentale per ottenere il conteggio CFU più accurato dall'immagine. Se la soglia è impostata troppo alta, le colonie si uniranno; Se la soglia è impostata troppo bassa, le colonie saranno escluse. Una volta impostata la soglia, la macro applica la sfocatura gaussiana per ammorbidire i bordi e ridurre l'aliasing, il filtro spartiacque divide le colonie sovrapposte e i blob vengono conteggiati utilizzando le particelle di analisi.

A volte, la densità delle colonie è troppo alta in un punto particolare. Count-On-It fornisce un modo per affrontare questo. Per stimare il numero di colonie in una cella della griglia con colonie parzialmente unite, prima l'area media di un blob circolare dall'intera piastra viene presa come Cavg. Quindi, l'area del BLOB A 1 viene divisa per l'area media di un BLOB circolare A1/Cavg. Questo numero viene arrotondato al numero intero più vicino e questa è la stima di quante colonie sono presenti in un BLOB. Questa funzione è uno dei motivi per cui la soglia può influenzare i risultati del conteggio: l'area media relativa della colonia rispetto a un'area BLOB unita sarà diversa a seconda di come la soglia ha influenzato i BLOB uniti.

I metodi presentati hanno diverse limitazioni. Questi includono la necessità di attrezzature per erogare con precisione fluidi liquidi da piastre a 96 pozzetti. Questa apparecchiatura, un pipettor a 96 canali o uno strumento a perno replicatore a fessura, può costare migliaia di dollari per ottenere. Esistono alternative più economiche, ma sono meno accurate. Il conteggio automatico tramite Count-On-It presenta anche alcune limitazioni. Ad esempio, se due tipi di colonie in una popolazione mista fossero delimitati solo in base alle dimensioni, il conteggio dei blob non sarebbe in grado di assegnare colonie al tipo corretto. In questo caso, le macchie con macchie dovrebbero essere eliminate dai conteggi. Un'ulteriore differenziazione delle colonie in base alla morfologia sarebbe una preziosa estensione del metodo che non è attualmente implementato. L'uso di mezzi selettivi, compresi nutrienti specifici per ceppo e antibiotici, semplifica la necessità di analisi complesse delle immagini.

Mantenere esperimenti di moscerini della frutta in piastre a 96 pozzetti moltiplica il numero di campioni e condizioni che possono essere testati in un singolo esperimento e può facilitare screening ad alto rendimento nei fenotipi di associazione Drosophila-batteri. Prevediamo che questo metodo possa essere esteso utilizzando mezzi selettivi per differenziare molti ceppi batterici in miscele complesse. Il metodo non si limita allo studio del microbioma della mosca. La quantificazione dei CFU è comune in molte applicazioni della microbiologia, dalla conta dei coliformi nell'acqua potabile all'identificazione di agenti patogeni. Il sistema galvanico CFU qui presentato consente schermi ad alta produttività, nonché acquisizione, elaborazione, archiviazione e consegna automatizzate dei risultati.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Il Dr. Kerwyn Casey Huang, il Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper e i membri del laboratorio di Ludington hanno dato un prezioso contributo allo sviluppo di questo protocollo. Il finanziamento è stato fornito da NSF IOS grant 2032985, NIH grant DP5OD017851, una sovvenzione della Carnegie Institution of Canada e dal Carnegie Institute for Science's Endowment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead beating and spot plating
Fly vials Genesee 32-121 autoclavable
Fly vial stoppers Genesee 59-201 autoclavable
Hand Applicator 3M 3M PA1
Heat Sealer Eppendorf 5390
Mini-Beadbeater 96 BioSpec 1001
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm BioSpec  11079105
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner Labnet LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor Mettler Toledo 30296705 Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural USA scientific 1402-9220 Must be polypropylene for heat sealer
Thermal Bond Heat Seal Foil 4titude 4ti-0591 Keep sterile
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile SPL Life Sciences 31001 For making rectangular agar plates
Photobox construction
¼”-20 X ½” Bolts (X2) Amazon ASIN: B07BP1WR3H To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works.
¼”-20 x ½” Connector Nut  Amazon UPC: 799862376780 AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important.
¼”-20 x ¾” bolts (X3) Amazon ASIN: B003QZSZY4 For the plate holder. Brand not important.
1/8” x ½” washer Amazon UPC: 611982484599 Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft Superbrightleds.com WP18-2
22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 Superbrightleds.com WN-R2210
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 Superbrightleds.com SCFP-2218
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-2
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 Superbrightleds.com SBL-MA2P-8-1 
6” drawer handle Amazon ASIN: B07Z331P99 Any drawer handle should work.
6” Drawer slides Btibpse UPC: 712243424979 Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders.
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) Amazon ASIN: B00HYLZB98 Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) Amazon ASIN: B07KX9T7NF To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic.
Acrylic Glue SCIGRIP Ean: 7844908489337 SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle
Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long  Superbrightleds.com CT-B04-10
Camera L-Bracket WLPREOE, Vikerer, Unbranded ASIN: B09X46YKQZ The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Canon T series camera for tethering option OR Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. 1894C002 The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model).
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters Superbrightleds.com STN-BBLU-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters Superbrightleds.com STN-BGRE-B6A-08C1M-24V
Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters  Superbrightleds.com STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
Drill with ¼”, 1/8” drill bits Black & Decker ‎BDCDD12PK Brand not important. 
Flat Black Spray Paint,  2X Ultra-Matte Rustoleum 331182 Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important.
Laser Cut Acrylic Walls Big Blue Saw www.bigbluesaw.com Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera 
Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt  Superbrightleds.com LPV-20-24
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. DMC-ZS100K Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good.
Quick Release Plate Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch ASIN: B07417F21D Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example.
Rubber Bands, Assorted sizes BAZIC Products Alliance Rubber 26649 Rubber bands go on the plate holder. Brand not important.
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4 Superbrightleds.com CTMB-20
SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3 Superbrightleds.com RRS-SP
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm  Tiffen 72R29
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm Tiffen 7258
Software
ImageJ64 https://imagej.net/downloads N/A Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSX Apple N/A Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it.
Unix BSD N/A 64 bit
Windows Microsoft N/A 64 bit

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Biologia Numero 191
Conteggio rapido delle unità formanti colonie in formato piastra a 96 pozzetti applicato al microbioma <em>Drosophila</em>
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Dodge, R., Ludington, W. B. Fast… More

Dodge, R., Ludington, W. B. Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome. J. Vis. Exp. (191), e64298, doi:10.3791/64298 (2023).

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