Этот метод количественно оценивает микробное изобилие с использованием 96-луночного формата пластины для пластинчатых колониеобразующих единиц (КОЕ) и применяется к микробиому дрозофилы в образцах гомогената цельной мухи. КОЕ подсчитываются с помощью автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений, представленного здесь.
Кишечник животных колонизирован комменсальными микробами, которые влияют на развитие, здоровье и поведение хозяина. Точная количественная оценка колонизации имеет важное значение для изучения сложных взаимодействий между хозяином и микробом как для проверки микробного состава, так и для изучения его эффектов. Drosophila melanogaster, которая имеет низкое нативное микробное разнообразие и экономична для выращивания с определенным микробным составом, появилась в качестве модельного организма для изучения кишечного микробиома. Анализ микробиома отдельного организма требует определения того, какие микробные виды присутствуют, и количественной оценки их абсолютного изобилия. В данной статье представлен метод анализа большого количества отдельных микробиомов мух. Мухи готовятся в 96-луночных пластинах, что позволяет обрабатывать большое количество образцов одновременно. Микробное изобилие измеряется путем покрытия до 96 целых гомогенатов мух на одной агаровой пластине в массиве пятен, а затем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ), которые растут в каждом месте. Эта система покрытия работает в паре с автоматизированной платформой количественной оценки КОЕ, которая включает в себя фотографирование пластин, дифференциацию флуоресцентных колоний и автоматизированный подсчет колоний с использованием плагина ImageJ. Преимущества заключаются в том, что (i) этот метод достаточно чувствителен для обнаружения различий между обработками, (ii) метод точечного покрытия так же точен, как и традиционные методы гальванического покрытия, и (iii) автоматизированный процесс подсчета является точным и быстрым, чем ручной подсчет. Рабочий процесс, представленный здесь, позволяет высокопроизводительную количественную оценку КОЕ в большом количестве реплик и может быть применен к другим системам микробиологических исследований, включая in vitro и другие модели мелких животных.
Связь между кишечной микробиотой и их животным-хозяином все чаще находится на переднем крае биологических исследований1, которые показывают, что штаммовый состав микробиома важен для физиологии хозяина 2,3,4. Темпы открытия были ограничены смешанными факторами, такими как высокая естественная межиндивидуальная изменчивость и высокое разнообразиеколонизирующих бактерий 5,6,7. Плодовая муха, Drosophila melanogaster, стала многообещающей моделью из-за ее естественного микробиома с низким разнообразием, простоты обращения и надежной генетики хозяина 8,9,10,11. Мухи могут быть сделаны свободными от микробов и повторно ассоциироваться с определенной микробиотой12, и было показано, что флора влияет на физиологические чертымухи 13,14. Врожденная флора состоит из ограниченного набора бактерий, которые все культивируемы, и близкие родственники их также эндогенны для кишечника млекопитающих, включая лактобациллы, протеобактерии и энтерококки15.
Изучение влияния микробиома на признаки хозяина требует количественной оценки микробиома с точки зрения как того, какие виды присутствуют, так и их абсолютного изобилия16. Преобладающими способами анализа микробиома мухи являются колониеобразующая единица (КОЕ)17, секвенирование ампликона гена рРНК16S 9 и qPCR гена 16S рРНК18. Количество КОЕ можно получить без дорогостоящих реагентов, и они подтверждают жизнеспособность бактериальных клеток19. Методы 16S, включая qPCR, имеют преимущества в том, что таксономические идентичности микробов могут быть установлены без учета их требований к росту или морфологии колоний20.
В случае, когда в экспериментах используются мухи с определенным микробиомом известных бактерий (гнотобиотических мух), количество КОЕ имеет особые преимущества по сравнению с секвенированием21. Секвенирование является дорогостоящим и требует экстракции ДНК, подготовки библиотеки на основе ПЦР и высокопроизводительного секвенирования для получения относительного изобилия22. Из-за высокой стоимости высокопроизводительные методы секвенирования обычно необходимо выполнять оптом, чтобы снизить цену за образец23. Дальнейшие методы, такие как qPCR, необходимы для получения абсолютных количеств16. Напротив, подсчет КОЕ быстрый и дешевый и дает абсолютное количество жизнеспособных клеток. Drosophila8 и другие модели24 малого микробиома, включая червя Caenorhabditis elegans25,26 и личинку рыбки данио, Danio rerio, выращенные гнотобиотически27, имеют ограниченный спектр бактерий, которые имеют известные характеристики роста28. В этих случаях, особенно у гнотобиотических животных, подсчет КОЕ может дифференцировать все виды бактерий в многовидовых кишечных сообществах 21,27,29. Высокопроизводительные методы подсчета КОЕ еще больше повысят экономическую эффективность и скорость измерения состава микробиома и могут быть применены ко многим другим микробиологическим экспериментам.
Подсчет КОЕ путем последовательного разбавления бактериальной суспензии на питательных средах на основе агара является стандартным методом в области микробиологии. Колонии, которые растут на пластинах, затем подсчитываются вручную. Разведения позволяют исследователю выбрать плотность колоний, которая поддается подсчету (например, ~ 100 КОЕ на пластину), что означает, что колонии не растут друг в друга и могут быть подсчитаны за разумное количество времени. Большинство микробиологов используют по сути тот же метод подсчета КОЕ, разработанный 140 лет назад в лаборатории Роберта Коха, и для многих применений этот метод до сих пор адекватен. Однако возникает проблема при попытке количественно оценить большое количество образцов. Для одного образца может потребоваться нанесение от 1 до 10 последовательных разбавлений образца для получения поддающихся подсчету КОЕ, поэтому эксперименты с участием более нескольких десятков образцов становятся обременительными. Для повышения эффективности перечисления КОЕ разработаны различные методы. Автоматизированное спиральное покрытие устраняет необходимость в последовательных разведениях30, делая только одну пластину необходимой для подсчета КОЕ, но увеличивая время на заполнение образца. Однодисковое последовательное пятнистое разбавление (SP-SDS) позволяет оценивать КОЕ с меньшим количеством пластин на образец31. Эти методы являются улучшением традиционного метода нанесения покрытий, но по-прежнему требуют обработки и покрытия бактериальных образцов по отдельности и, таким образом, не идеальны для высокой пропускной способности. Обработка образцов в 96-луночных пластинах и точечное покрытие этих 96 образцов на прямоугольных агаровых пластинах значительно улучшает пропускную способность образцов19.
Микробиомы обычно состоят из нескольких штаммов и видов. В то время как виды часто можно отличить по морфологии колоний или питательным средам, флуоресценция может быть использована для дальнейшего различения различных типов бактерий и их признаков роста32. Например, различные генотипы одного и того же вида могут быть помечены различными генетически закодированными флуоресцентными белками. Методы визуализации пластин, которые включают флуоресценцию, позволяют исследователям использовать эти генетические методы в анализах на основе КОЕ32. Включение флуоресценции в высокопроизводительные методы подсчета КОЕ еще больше повысит их полезность.
Подсчет КОЕ вручную становится громоздким при наличии большого количества образцов. Автоматизированный подсчет КОУ может проводиться путем фотографирования пластины и обработки изображения с использованием специализированного программного обеспечения33. Sieuwerts et al. объединили улучшенную эффективность покрытия пятнистого покрытия с автоматизированным подсчетом колоний с использованием обычной цифровой фотографии и программного обеспечения ImageJ19.
Высокопроизводительный метод скрининга фенотипов конкретных микробов и ассоциаций хозяев поможет исследованиям сборки сообщества микробиома и влияния на здоровье и приспособленность хозяина. Для исследований микробиома дрозофилы высокопроизводительная микробиологическая платформа будет включать обработку образцов мух в формате пластины с 96 лунками, лизис мухи без бактериального лизиса, эффективность точечного покрытия, возможность использовать флуоресценцию и различать несколько флуорофоров, контролируемую световую среду для воспроизводимой визуализации пластин КОЕ и надежное автоматизированное программное обеспечение для подсчета колоний. В этой статье описывается метод, оптимизированный для анализа КОЕ у гнотобиотических мух, который является простым, быстрым и автоматизированным. Этот протокол описывает новый рабочий процесс, сочетающий в себе лучшие из ранее опубликованных методов и оптимизированный для изучения кишечного микробиома у дрозофилы.
Подробные методы, представленные здесь, позволяют увеличить >100 раз количество образцов, которые могут быть оценены в эксперименте по подсчету КОЕ. Этот метод продвигает существующие методы экспериментов с микробиомом в Drosophila 12,35,36 с использованием формата пластины с 96 лунками для анализа отдельных мух. Кроме того, он применяет более эффективный метод точечного покрытия19,31 и автоматизированный рабочий процесс с платформой для фотографии и подсчета колоний. Значение этого метода для дрозофилы заключается в стандартизации экспериментов в формате пластины с 96 лунками, что позволяет одновременно обрабатывать большое количество биологических реплик с автоматизацией для достижения высокопроизводительной количественной оценки КОЕ.
96-луночная платформа показывает, что увеличение частоты передачи и «очистки» переходных бактерий вызывает значительное снижение как среднего изобилия, так и вариаций между образцами (рисунок 1B, C), демонстрируя строгость этого улучшенного протокола. Одним из ограничений совместного содержания мух является горизонтальный перенос бактерий между мухами. Предлагаемое решение состоит в том, чтобы держать мух по отдельности в формате пластины с 96 лунками, таких как Whole Animal Feeding Flat38.
Хотя значительного снижения бактериальной нагрузки не наблюдалось при промывке мух этанолом, эти мухи содержались только в присутствии внешних бактерий в течение 3 дней. Жилье в течение более длительных периодов времени может позволить большей бактериальной нагрузке накапливать39. Поэтому промывка в этаноле все же рекомендуется.
Перенос мух в пластину с 96 скважинами является критически важным первым шагом для настройки рабочего процесса (рисунок 1A). Как только мухи вымываются, они распределяются по колодцам по одной. Пластинчатая диаграмма полезна на этом этапе, чтобы отметить, какие условия присутствуют в каждой скважине, и добавить любые заметки, такие как «муха была потеряна». Гомогенизация является еще одним критическим шагом с некоторыми важными оговорками. Бактерии выживают в процессе гомогенизации в присутствии мухи (рисунок 1D, E), и, по-видимому, этот принцип также верен, когда бактерии находятся внутри кишечника мухи. Тем не менее, бактерии также погибают, когда они гомогенизируются только в пластинах бисерного битера, демонстрируя, что гомогенизация может убивать бактериальные клетки при определенных обстоятельствах, ограничение, которое может быть важным, например, если гомогенизировать рассеченные кишки. Примечательно, что потери КОЕ при гомогенизации зависят от количества КОЕ в образце, а потери минимальны при использовании ~105 КОЕ на скважину. Дальнейшее сохранение КОЕ может быть достигнуто путем прекращения гомогенизации на полпути и охлаждения пластины на льду.
Гомогенизацию проводили в течение 5 минут в этом протоколе на основе контрольных экспериментов, где известное количество КОЕ было смешано с мухой без микробов, и это эмпирически сработало для бактерий мух. Меньшее биение приводило к присутствию более крупных частей мухи, что мешало пипетке, в то время как значительно более длительное время гомогенизации ~ 10 мин делало количество КОЕ более изменчивым. Наблюдалось, что меньший объем и угловая форма конических пластинчатых колодцев снижают эффективность биения шариков по сравнению с цилиндрическими трубками объемом 2 мл. Возможны многие вариации этого общего подхода, в том числе какие бактериальные штаммы, какие шарики бьют контейнер, какие бусины и какой генотип мухи используются. Отдельные пользовательские случаи должны использовать положительные элементы управления для установления своего подхода.
Метод точечного покрытия был использован специфическим образом: 1:2 разведения L. plantarum WF в PBS были обнаружены на пластинах MRS и инкубированы при 30 °C в течение 2 дней (более короткое время инкубации может быть реализовано для получения меньших размеров колонии). Этот метод требует некоторых первоначальных инвестиций в оборудование, в первую очередь в бисерный битер и 96-канальный пипетчер (рисунок 2А), который необходим как для серии разбавления, так и для точечного покрытия. Тем не менее, доступны менее дорогие варианты, в том числе 96-луночный пластинчатый репликатор с щелевыми штифтами. Серия разбавления является критическим этапом, который влияет на точность результатов подсчета КОЕ. С точки зрения режимов отказа, можно засорить наконечники пипеток деталями мухи или стеклянными шариками, а наконечники пипеток не запечатаны должным образом на пипетке или выйти из строя по какой-либо другой причине. Все эти проблемы приводят к недоучету пострадавших скважин и должны контролироваться. Адекватное смешивание на каждом этапе серии разбавления также имеет решающее значение. Каждое разведение следует тщательно перемешать либо путем помещения тарелки на шейкер пластины, либо путем пипетки вверх и вниз 15-20 раз, что также служит для промывки кончиков. При пятнистости от наиболее разбавленной до наименее разбавленной пластины наконечники могут быть повторно использованы для всей серии разбавления. При разведении 1:2 подсчет является точным в диапазоне 2-25 колоний, охватывающих порядок величины (рисунок 2C). Поэтому разбавления 1:10 экономят время и материалы. Другой переменной, которой можно воспользоваться, является время инкубации, которое может быть скорректировано для получения меньших колоний и, таким образом, увеличения диапазона счетных пятен, предотвращая слияние соседних колоний.
Качественная фотография пластины имеет важное значение, поскольку она становится исходными данными, из которых анализируются КОЕ, и может быть архивирована на неопределенный срок. FluoroBox предназначен для получения фотографий пластин с равномерной интенсивностью света, что сводит к минимуму блики на поверхности агара. Кроме того, конструкция способна выборочно фотографировать флуоресцентные колонии с использованием одноцветных светодиодных фонарей и цветных фотофильтров (рисунок 3A). Конструкция такой установки, как FluoroBox, с контролируемым освещением и настройками камеры, может значительно повысить воспроизводимость изображений КОЕ, что важно для автоматизированного анализа. Морфология колоний, интенсивность флуоресценции и влияние времени или плотности на рост колонии — это лишь некоторые из свойств, которые можно проанализировать с помощью фотографий. Фотобокс может быть построен без цветных фильтров и одноцветных ламп, если не используются флуоресцентные бактерии, что снижает стоимость и сложность. Различные лампы возбуждения и эмиссионные фильтры могут быть заменены на те, которые рекомендуются здесь, если лаборатория использует другой флуорофор. Камера, подключенная к планшету через Wi-Fi с помощью приложения, полезна как для функции автоматического затвора для предотвращения тряски, так и для простоты передачи данных. Изображения могут быть переданы на планшет, а затем на ноутбук с помощью программного обеспечения для беспроводной передачи файлов. Рекомендуемые камеры с такими возможностями указаны в Таблице материалов.
Count-On-It – это плагин, написанный на ImageJ. Автоматизированное программное обеспечение для подсчета КОЕ сегментирует изображение пластины в единую сетку из 96 скважин, подсчитывает колонии в каждой ячейке сетки и пакетирует результаты в простую электронную таблицу. Поскольку положение точечной сетки на пластине и на фотографии всегда меняется, пользователь должен вручную сопоставить сетку с фотографией с помощью плагина Croptacular. Это также помогает исключить области вблизи края пластины, которые имеют блики. Установка порогового значения является ключом к получению наиболее точного подсчета КОЕ из изображения. Если порог установлен слишком высоким, колонии сольются; если порог установлен слишком низко, колонии будут исключены. После установки порогового значения макрос применяет размытие Гаусса для смягчения краев и уменьшения сглаживания, фильтр водораздела разделяет перекрывающиеся колонии, а большие двоичные объекты подсчитываются с помощью анализируемых частиц.
Иногда плотность колоний слишком высока в определенном месте. Count-On-It предоставляет способ справиться с этим. Чтобы оценить количество колоний в ячейке сетки с частично слитыми колониями, сначала среднюю площадь круглого сгустка со всей пластины берут за Cavg. Затем площадь большого двоичного объекта A1 делится на среднюю площадь круглого большого двоичного объекта A1/Cavg. Это число округляется до ближайшего целого числа, и это оценка того, сколько колоний находится в большом двоичном объекте. Эта функция является одной из причин, по которой пороговое значение может влиять на результаты подсчета: относительная средняя площадь колонии по сравнению с объединенной областью большого двоичного объекта будет отличаться в зависимости от того, как пороговое значение повлияло на объединенные большие двоичные объекты.
Представленные методы имеют ряд ограничений. К ним относится необходимость в оборудовании для точного дозирования жидких сред из 96-луночных плит. Это оборудование, будь то 96-канальный пипетатор или щелевой штифт репликатора, может стоить тысячи долларов. Более дешевые альтернативы существуют, но менее точны. Автоматизированный подсчет с помощью Count-On-It также имеет некоторые ограничения. Например, если бы два типа колоний в смешанной популяции были разделены только на основе размера, подсчет больших двоичных объектов не смог бы отнести колонии к правильному типу. В этом случае пятна с каплями должны быть исключены из подсчетов. Дальнейшая дифференциация колоний на основе морфологии была бы ценным расширением метода, который в настоящее время не реализован. Использование селективных сред, включая специфические для штамма питательные вещества и антибиотики, упрощает необходимость комплексного анализа изображений.
Проведение экспериментов с плодовой мухой в 96-луночных пластинах умножает количество образцов и условий, которые могут быть проверены в одном эксперименте, и может способствовать высокопроизводительным скринингам в фенотипах ассоциации дрозофила-бактерии. Мы предполагаем, что этот метод может быть расширен за счет использования селективных сред для дифференциации многих бактериальных штаммов в сложных смесях. Метод не ограничивается изучением микробиома мухи. Количественная оценка КОЕ распространена во многих приложениях микробиологии, от количества кишечной палочки в питьевой воде до идентификации патогенов. Представленная здесь система покрытия КОЕ обеспечивает высокую пропускную способность экранов, а также автоматизированное получение, обработку, хранение и доставку результатов.
The authors have nothing to disclose.
Д-р Кервин Кейси Хуанг, д-р Андрес Аранда-Диас, Тед Купер и члены лаборатории Лудингтона внесли ценный вклад в разработку этого протокола. Финансирование было предоставлено грантом NSF IOS 2032985, грантом NIH DP5OD017851, грантом Института Карнеги Канады и Фондом Института науки Карнеги.
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |