この方法は、96ウェルプレートフォーマットを使用してコロニー形成単位(CFU)をプレート化し、ハエホモジネートサンプル全体の ショウジョウバエ 微生物叢に適用します。CFUは、ここで提供される自動画像解析ソフトウェアでカウントされます。
動物の腸は共生微生物によってコロニー形成され、宿主の発達、健康、行動に影響を与えます。コロニー形成の正確な定量は、微生物組成を検証し、その影響を研究するために、宿主と微生物の間の複雑な相互作用を研究するために不可欠です。 ショウジョウバエメラノガスターは、天然微生物の多様性が低く、定義された微生物組成で飼育するのに経済的であり、腸内細菌叢を研究するためのモデル生物として浮上しています。個々の生物の微生物叢を分析するには、どの微生物種が存在するかを特定し、それらの絶対的な存在量を定量化する必要があります。この記事では、多数の個々のハエの微生物叢を分析する方法を紹介します。ハエは96ウェルプレートで調製され、一度に多数のサンプルを処理することができます。微生物の存在量は、1つの寒天プレート上に最大96個の全フライホモジネートを一連のスポットでメッキし、各スポットで成長するコロニー形成単位(CFU)をカウントすることによって定量化されます。このメッキシステムは、プレートの写真撮影、蛍光コロニーの分化、ImageJプラグインを使用したコロニーの自動カウントを組み込んだ自動CFU定量プラットフォームとペアになっています。利点は、(i)この方法は処理間の違いを検出するのに十分な感度であり、(ii)スポットめっき法は従来のめっき方法と同じくらい正確であり、(iii)自動計数プロセスは手動計数よりも正確で高速です。ここで紹介するワークフローは、多数の反復におけるCFUのハイスループット定量を可能にし、 in vitro やその他の小動物モデルを含む他の微生物学研究システムに適用できます。
腸内細菌叢とその動物宿主との関係は、微生物叢の菌株組成が宿主生理学にとって重要であることを示す生物学的研究1の最前線にますます進んでいます2,3,4。発見のペースは、高い自然の個体間変動やコロニー形成細菌の多様性の高さなどの交絡因子によって制限されてきました5,6,7。ショウジョウバエ、ショウジョウバエメラノガスターは、その自然に多様性の低い微生物叢、取り扱いの容易さ、および堅牢な宿主遺伝学のために有望なモデルとして浮上しています8,9,10,11。ハエは無菌にすることができ、定義された微生物叢12と再関連させることができ、フローラがハエの生理学的形質に影響を与えることが示されています13,14。先天的な細菌叢は、すべて培養可能な限られた細菌のセットで構成されており、これらの近親者も、乳酸菌、プロテオバクテリア、腸球菌などの哺乳類の腸に内因性です15。
宿主形質に対するマイクロバイオームの影響を研究するには、存在する種とその絶対存在量の両方の観点からマイクロバイオームを定量化する必要があります16。ハエマイクロバイオームを分析する主な方法は、コロニー形成単位(CFU)カウント17、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング9、および16S rRNA遺伝子のqPCR18です。CFUカウントは、高価な試薬なしで得ることができ、それらは細菌細胞の生存率を確認する19。qPCRを含む16S技術には、微生物の成長要件やコロニーの形態に関係なく、微生物の分類学的同一性を確認できるという利点があります20。
実験で既知の細菌の定義された微生物叢を持つハエを使用する場合(グノトバイオティックハエ)、CFUカウントはシーケンシング21よりも特に有利です。シーケンシングは高価であり、相対的な存在量を得るためには、DNA抽出、PCRベースのライブラリ調製、およびハイスループットシーケンシングが必要です22。コストが高いため、ハイスループットシーケンシング法は、通常、サンプルあたりの価格を下げるために一括で実行する必要があります23。絶対存在量を得るためには、qPCRなどのさらなる方法が必要です16。対照的に、CFUカウントは迅速かつ安価であり、生細胞の絶対数を示します。ショウジョウバエ8と、ワームを含む他の小さな微生物叢モデル24、Caenorhabditis elegans25,26、および幼虫のゼブラフィッシュ、ダニオレリオは、グノトビオティックに成長しました27、既知の成長特性28を持つ細菌の範囲が限られています。これらの場合、特にグノトバイオティック動物では、CFUカウントは、多種の腸内コミュニティ内のすべての種の細菌を区別することができます21、27、29。ハイスループットCFU計数法は、マイクロバイオームの組成を測定する費用対効果と速度をさらに向上させ、他の多くの微生物学実験に適用できます。
寒天ベースの増殖培地上の細菌懸濁液の段階希釈プレーティングによるCFUの計数は、微生物学の分野全体の標準的な方法です。プレート上で成長するコロニーは、手動でカウントされます。希釈により、研究者はカウント可能なコロニーの密度(例えば、プレートあたり~100CFU)を選択できるため、コロニーは互いに成長せず、妥当な時間でカウントできます。ほとんどの微生物学者は、140年前にRobert Kochの研究室で開発されたのと本質的に同じCFU計数法を使用しており、多くのアプリケーションでは、この方法は依然として適切です。しかしながら、多数のサンプルを定量しようとすると問題が生じる。単一のサンプルでは、カウント可能なCFUを得るためにサンプルの1〜10段階希釈をメッキする必要がある場合があるため、数十を超えるサンプルを含む実験には負担がかかります。CFU列挙の効率を高めるために、さまざまな方法が開発されています。自動スパイラルメッキにより、連続希釈30が不要になり、CFUカウントに必要なプレートは1つだけになりますが、サンプルをプレート化する時間が長くなります。シングルプレートシリアル希釈スポッティング(SP-SDS)は、サンプル31あたりのより少ないプレートからのCFU推定を可能にします。これらの方法は、従来のスプレッドプレーティング法を改良したものですが、細菌サンプルの取り扱いとメッキを単独で行う必要があるため、ハイスループットには理想的ではありません。96ウェルプレートでサンプルを処理し、それらの96サンプルを長方形の寒天プレートにスポットプレーティングすることで、サンプル19のスループットが大幅に向上します。
マイクロバイオームは通常、複数の株と種で構成されています。種はしばしばコロニー形態または成長培地によって区別することができるが、蛍光は、異なるタイプの細菌およびそれらの成長形質をさらに区別するために使用することができる32。例えば、同じ種の異なる遺伝子型は、異なる遺伝的にコードされた蛍光タンパク質で標識することができる。蛍光を組み込んだプレートイメージング法により、研究者はCFUベースのアッセイ32においてこれらの遺伝的手法を利用することができる。蛍光をハイスループットCFU計数法に組み込むことで、その有用性がさらに高まります。
サンプル数が多い場合、CFUを手動でカウントするのは面倒になります。CFUの自動計数は、プレートを撮影し、専用ソフトウェア33を用いて画像を処理することによって行うことができる。Sieuwertsらは、スポットプレーティングの改善されたメッキ効率と、従来のデジタル写真とImageJソフトウェアを使用した自動コロニーカウントを組み合わせました19。
特定の微生物の表現型と宿主の関連をスクリーニングするハイスループット法は、微生物叢のコミュニティアセンブリと宿主の健康とフィットネスへの影響の研究に役立ちます。 ショウジョウバエ の微生物叢の研究には、ハイスループット微生物学プラットフォームには、96ウェルプレートフォーマットでのフライサンプルの取り扱い、細菌溶解なしのフライ溶解、スポットプレーティングの効率、蛍光を使用して複数の蛍光色素を区別する機能、CFUプレートの再現性のあるイメージングのための制御された光環境、および信頼性の高い自動コロニーカウントソフトウェアが組み込まれます。この記事では、グノトバイオティックハエのCFUアッセイに最適化された、シンプル、高速、自動化された方法について説明します。このプロトコルは、以前に発表された最良の方法を組み合わせて、 ショウジョウバエの腸内細菌叢を探索するために最適化された新しいワークフローの概要を示しています。
ここで紹介する詳細な手法により、CFUカウント実験で評価できるサンプル数を>100倍に増やすことができます。この技術は、ショウジョウバエ12,35,36におけるマイクロバイオーム実験の既存の方法を、96ウェルプレートフォーマットを使用して個々のハエをアッセイすることにより進歩させます。さらに、より効率的なスポットプレーティング法19、31および写真およびコロニー計数プラットフォームを備えた自動化されたワークフローを適用する。ショウジョウバエにとってのこの方法の意義は、実験を96ウェルプレートフォーマットに標準化し、CFUのハイスループット定量化を自動化して多数の生物学的複製を同時に処理できるようにすることです。
96ウェルプラットフォームは、移動頻度の増加と一過性細菌の「除去」が、平均存在量とサンプル間の変動の両方を大幅に減少させることを示しており(図1B、C)、この改善されたプロトコルの厳密さを示しています。コハウジングハエの1つの制限は、ハエ間の細菌の水平移動です。提案された解決策は、ハエを96ウェルプレートフォーマット(Whole Animal Feeding Flat38など)に個別に保管することです。
ハエをエタノールで洗浄した場合、細菌量の有意な減少は観察されなかったが、これらのハエは外部細菌の存在下で3日間しか飼育されていなかった。長期間収容すると、より大きな細菌負荷が蓄積する可能性があります39。したがって、エタノールでの洗浄が依然として推奨されます。
ハエを96ウェルプレートに移すことは、ワークフローを設定するための重要な最初のステップです(図1A)。ハエが洗浄されると、それらは一度に1つずつウェルに分配されます。プレートチャートは、この段階で、各ウェルにどの条件が存在するかを記録し、「ハエが失われた」などのメモを追加するのに役立ちます。均質化は、いくつかの重要な注意点があるもう一つの重要なステップです。バクテリアはハエの存在下で均質化プロセスを生き延び(図1D、E)、おそらくこの原理はバクテリアがハエの腸内にいる場合にも当てはまります。しかし、細菌はビーズビータープレートのみで均質化されると死滅し、均質化が特定の状況で細菌細胞を殺すことができることを実証しており、例えば解剖された腸を均質化する場合に重要であり得る制限。特に、均質化時のCFUの損失はサンプル中のCFUの数に依存し、ウェルあたり~105 CFUを使用した場合の損失は最小限に抑えられます。CFUのさらなる保存は、均質化を途中で停止し、氷上でプレートを冷却することによって達成することができる。
このプロトコルでは、既知の数のCFUを無菌ハエと混合した対照実験に基づいて均質化を5分間実行し、これはハエ菌に対して経験的に機能しました。叩解が少ないとフライパーツが大きくなり、ピペッティングが妨げられますが、均質化時間が~10分と大幅に長くなると、CFUカウントの変動が大きくなります。円錐プレートウェルの体積と角度の付いた形状が小さいと、円筒形の2 mLチューブと比較してビーズの叩解効率が低下することが観察されました。この一般的なアプローチには、どの細菌株、どのビーズビート容器、どのビーズ、どのハエ遺伝子型が使用されるかなど、多くのバリエーションが可能です。個々のユーザー ケースでは、ポジティブ コントロールを使用してアプローチを確立する必要があります。
スポットプレーティング法は、PBS中の L. plantarum WFの1:2希釈をMRSプレートにスポットし、30°Cで2日間インキュベートするという特定の方法で採用されました(より小さなコロニーサイズを生成するために、より短いインキュベーション時間を実施できます)。この方法では、主にビーズビーターと96チャンネルピペッター(図2A)などの装置への先行投資が必要であり、希釈シリーズとスポットメッキの両方が必要です。ただし、スロット付きピンを備えた96ウェルプレートリプリケーターなど、より安価なオプションが利用可能です。希釈シリーズは、CFU計数結果の精度に影響を与える重要なステップです。故障モードに関しては、フライ部品やガラスビーズでピペットチップを詰まらせたり、ピペットチップがピペッターに適切にシールされなかったり、その他の理由で故障したりする可能性があります。これらすべての問題は、影響を受ける井戸の過小評価をもたらすため、監視する必要があります。希釈シリーズの各ステップでの適切な混合も重要です。各希釈液は、プレートをプレートシェーカーに置くか、チップをすすぐのにも役立つ15〜20回上下にピペッティングすることによって完全に混合する必要があります。最も希薄なプレートから最も希薄でないプレートまでスポッティングすることで、チップを希釈シリーズ全体に再利用できます。1:2希釈では、2〜25コロニーの範囲でカウントが正確であり、桁違いにまたがります(図2C)。したがって、1:10希釈は時間と材料を節約できます。利用できる別の変数はインキュベーション時間であり、これはより小さなコロニーを生成するように調整することができ、したがって、隣接するコロニーの合流を防ぐことによってカウント可能なスポットの範囲を広げることができる。
プレートの高品質な写真は、CFUが分析され、無期限にアーカイブできる生のソースデータになるため、不可欠です。FluoroBoxは、寒天表面のまぶしさを最小限に抑える均一な光強度でプレートの写真を生成するように設計されています。さらに、この設計は、単色LEDライトとカラーフォトフィルターを使用して蛍光コロニーを選択的に撮影することができます(図3A)。照明とカメラの設定を制御したFluoroBoxのようなセットアップを構築することで、自動分析に重要なCFU画像の再現性を大幅に向上させることができます。コロニーの形態、蛍光強度、コロニーの成長に対する時間または密度の影響は、写真を使用して分析できる特性のほんの一部です。フォトボックスは、蛍光細菌を使用しない場合、カラーフィルターと単色ライトなしで構築できるため、コストと複雑さが軽減されます。ラボで異なる蛍光色素を使用する場合は、ここで推奨されているものの代わりに異なる励起光と発光フィルターを使用できます。アプリを使用してWiFi経由でタブレットに接続されているカメラは、揺れを防ぐための自動シャッター機能とデータ転送の容易さの両方に役立ちます。画像はタブレットに転送してから、ワイヤレスファイル転送ソフトウェアを使用してラップトップに転送できます。これらの機能を備えた推奨カメラは、 材料の表に示されています。
カウントオンイットは、ImageJで書かれたプラグインです。自動CFU計数ソフトウェアは、プレート画像を均一な96ウェルグリッドに分割し、各グリッドセルのコロニーをカウントし、結果を単純なスプレッドシートにバッチ処理します。プレート上と写真内のスポットグリッドの位置は常に変動するため、ユーザーはCroptacularプラグインを使用してグリッドを写真に手動で適合させる必要があります。これは、グレアのあるプレートエッジ近くの領域を除外するのにも役立ちます。しきい値の設定は、画像から最も正確なCFUカウントを取得するための鍵です。しきい値の設定が高すぎると、コロニーがマージされます。しきい値の設定が低すぎると、コロニーは除外されます。閾値が設定されると、マクロはガウスぼかしを適用してエッジを柔らかくし、エイリアシングを減らし、流域フィルターは重なり合うコロニーを分割し、ブロブはパーティクルの分析を使用してカウントされます。
時々、コロニーの密度が特定の場所で高すぎる。Count-On-Itは、これに対処する方法を提供します。部分的に結合したコロニーを有するグリッドセル内のコロニー数を推定するために、最初にプレート全体からの円形ブロブの平均面積をCavgとする。次に、ブロブA1の面積を円形ブロブAの平均面積1 / C平均で割る。 この数値は最も近い整数に丸められ、BLOB 内のコロニー数の推定値になります。この関数は、しきい値がカウント結果に影響を与える可能性がある理由の 1 つです: 相対的な平均コロニー面積とマージされたブロブ面積は、しきい値がマージされたブロブにどのように影響したかによって異なります。
提示されたメソッドにはいくつかの制限があります。これには、96ウェルプレートから液体媒体を正確に分注するための機器の必要性が含まれます。この装置は、96チャンネルのピペッターまたはスロット付きレプリケーターピンツールのいずれかで、入手に数千ドルかかる可能性があります。より安価な代替手段は存在しますが、精度は低くなります。カウントオンイット による 自動カウントには、いくつかの制限もあります。たとえば、混合母集団の 2 つのコロニー タイプがサイズのみに基づいて区切られている場合、BLOB カウントではコロニーを正しいタイプに割り当てることができません。この場合、ブロブのあるスポットはカウントから削除する必要があります。形態学に基づくコロニーのさらなる分化は、現在実施されていない方法の貴重な拡張となるであろう。菌株特異的栄養素や抗生物質などの選択培地を使用することで、複雑な画像解析の必要性が簡素化されます。
ショウジョウバエ実験を96ウェルプレートで維持すると、1回の実験でテストできるサンプル数と条件が増え、 ショウジョウバエと細菌の関連表現型のハイスループットスクリーニングが容易になります。この方法は、選択培地を使用して複雑な混合物中の多くの細菌株を区別することにより拡張できると考えています。この方法は、ハエの微生物叢の研究に限定されない。CFUの定量化は、飲料水中の大腸菌群数から病原体の特定まで、微生物学の多くのアプリケーションで一般的です。ここで紹介するCFUメッキシステムは、ハイスループットスクリーンだけでなく、結果の取得、処理、保存、および配信を自動化します。
The authors have nothing to disclose.
Kerwyn Casey Huang博士、Andrés Aranda-Díaz博士、Ted Cooper、およびLudington Labのメンバーは、このプロトコルの開発に関する貴重な意見を提供しました。資金は、NSF IOS助成金2032985、NIH助成金DP5OD017851、カナダカーネギー研究所助成金、およびカーネギー科学研究所の基金によって提供されました。
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |