Denne metode kvantificerer mikrobiel overflod ved hjælp af et 96-brønds pladeformat til pladekolonidannende enheder (CFU’er) og anvendes på Drosophila-mikrobiomet i hele fluehomogenatprøver. CFU’er tælles med en automatiseret billedanalysesoftware, der leveres her.
Tarmene hos dyr koloniseres af kommensale mikrober, som påvirker værtsudvikling, sundhed og adfærd. Præcis kvantificering af kolonisering er afgørende for at studere de komplekse interaktioner mellem vært og mikrobe både for at validere den mikrobielle sammensætning og studere dens virkninger. Drosophila melanogaster, som har en lav indfødt mikrobiel mangfoldighed og er økonomisk at opdrætte med defineret mikrobiel sammensætning, er opstået som en modelorganisme til undersøgelse af tarmmikrobiomet. Analyse af mikrobiomet af en individuel organisme kræver identifikation af hvilke mikrobielle arter der er til stede og kvantificering af deres absolutte overflod. Denne artikel præsenterer en metode til analyse af et stort antal individuelle fluemikrobiomer. Fluerne fremstilles i 96-brøndsplader, hvilket muliggør håndtering af et stort antal prøver på én gang. Mikrobiel overflod kvantificeres ved at platte op til 96 hele fluehomogenater på en enkelt agarplade i en række pletter og derefter tælle de kolonidannende enheder (CFU’er), der vokser på hvert sted. Dette pletteringssystem er parret med en automatiseret CFU-kvantificeringsplatform, der inkorporerer fotografering af pladerne, differentiering af fluorescerende kolonier og automatiseret tælling af kolonierne ved hjælp af et ImageJ-plugin. Fordelene er, at (i) denne metode er følsom nok til at opdage forskelle mellem behandlinger, (ii) pletpletteringsmetoden er lige så nøjagtig som traditionelle pletteringsmetoder, og (iii) den automatiserede optællingsproces er nøjagtig og hurtigere end manuel tælling. Arbejdsgangen, der præsenteres her, muliggør kvantificering af CFU’er med høj kapacitet i et stort antal replikater og kan anvendes på andre mikrobiologiske studiesystemer, herunder in vitro og andre smådyrsmodeller.
Forholdet mellem tarmmikrobiota og deres dyrevært er i stigende grad i spidsen for biologiske undersøgelser1, som viser, at mikrobiomets stammesammensætning er vigtig for værtsfysiologi 2,3,4. Opdagelsestempoet har været begrænset af forvirrende faktorer som høj naturlig interindividuel variation og høj mangfoldighed af koloniserende bakterier 5,6,7. Bananfluen, Drosophila melanogaster, er opstået som en lovende model på grund af dens naturligt lavdiversitetsmikrobiom, lette håndtering og robuste værtsgenetik 8,9,10,11. Fluer kan gøres bakteriefri og re-associeres med en defineret mikrobiota12, og det har vist sig, at floraen påvirker fluens fysiologiske træk13,14. Den medfødte flora består af et begrænset sæt bakterier, der alle er dyrkbare, og nære slægtninge til disse er også endogene til pattedyrets tarm, herunder lactobaciller, proteobakterier og enterokokker15.
At studere mikrobiomets indflydelse på værtsegenskaber kræver kvantificering af mikrobiomet med hensyn til både hvilke arter der er til stede og deres absolutte overflod16. De fremherskende måder at analysere fluemikrobiomet på er kolonidannende enhed (CFU) tæller17, 16S rRNA-genampliconsekventering9 og qPCR af 16S rRNA-genet18. CFU-tællinger kan opnås uden dyre reagenser, og de bekræfter bakteriecellernes levedygtighed19. 16S-teknikkerne, herunder qPCR, har fordele, idet mikrobernes taksonomiske identiteter kan fastslås uden hensyntagen til deres vækstbehov eller kolonimorfologier20.
I det tilfælde, hvor eksperimenter bruger fluer med et defineret mikrobiom af kendte bakterier (gnotobiotiske fluer), har CFU-tællinger særlige fordele i forhold til sekventering21. Sekventering er dyr, hvilket kræver DNA-ekstraktion, PCR-baseret biblioteksforberedelse og high-throughput-sekventering for at opnå relative overflod22. På grund af de høje omkostninger skal sekventeringsmetoder med høj kapacitet typisk udføres i bulk for at reducere prisen pr. prøve23. Yderligere metoder såsom qPCR er nødvendige for at opnå absolutte mængder16. I modsætning hertil er CFU-tællinger hurtige og billige og giver det absolutte antal levedygtige celler. Drosophila8 og andre små mikrobiommodeller 24, herunder ormen, Caenorhabditis elegans 25,26, og larvezebrafisken, Danio rerio, dyrket gnotobiotisk27, har et begrænset udvalg af bakterier, som har kendte vækstegenskaber 28. I disse tilfælde, især med gnotobiotiske dyr, kan CFU-tælling differentiere alle bakteriearter inden for de multiartiske tarmsamfund21,27,29. CFU-tællemetoder med højere kapacitet vil yderligere forbedre omkostningseffektiviteten og hastigheden af måling af mikrobiomets sammensætning og kan anvendes på mange andre mikrobiologiske eksperimenter.
Tælling af CFU’er ved seriel fortyndingsbelægning af en bakteriel suspension på agarbaserede vækstmedier er en standardmetode på tværs af mikrobiologiområdet. Kolonierne, der vokser på pladerne, tælles derefter manuelt. Fortyndingerne giver forskeren mulighed for at vælge en tæthed af kolonier, der kan tælles (f.eks. ~ 100 CFU’er pr. Plade), hvilket betyder, at kolonierne ikke vokser ind i hinanden og kan tælles inden for en rimelig tid. De fleste mikrobiologer bruger stort set den samme CFU-tællemetode, der blev udviklet for 140 år siden i Robert Kochs laboratorium, og til mange applikationer er denne metode stadig tilstrækkelig. Der opstår imidlertid et problem, når man søger at kvantificere et stort antal prøver. En enkelt prøve kan kræve plettering af 1 til 10 serielle fortyndinger af prøven for at opnå tællelige CFU’er, så eksperimenter, der involverer mere end et par dusin prøver, bliver beskattende. Der er udviklet forskellige metoder til at øge effektiviteten af CFU-optællingen. Automatiseret spiralbelægning eliminerer behovet for serielle fortyndinger30, hvilket kun gør en plade nødvendig til CFU-tælling, men øger tiden til at plade prøven. Single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) tillader CFU-estimater fra færre plader pr.prøve 31. Disse metoder er en forbedring af den traditionelle spredningsbelægningsmetode, men kræver stadig håndtering og plettering af bakterieprøver enkeltvis og er derfor ikke ideelle til høj gennemstrømning. Håndtering af prøver i 96-brøndsplader og pletbelægning af disse 96 prøver på rektangulære agarplader forbedrer i høj grad gennemstrømningen af prøver19.
Mikrobiomer er typisk sammensat af flere stammer og arter. Mens arter ofte kan skelnes ved kolonimorfologi eller vækstmedier, kan fluorescens anvendes til yderligere at skelne mellem forskellige typer bakterier og deres væksttræk32. For eksempel kan forskellige genotyper af samme art mærkes med forskellige genetisk kodede fluorescerende proteiner. Pladebilleddannelsesmetoder, der inkorporerer fluorescens, giver forskere mulighed for at drage fordel af disse genetiske teknikker i CFU-baserede assays32. Inkorporering af fluorescens i CFU-tællemetoder med høj kapacitet vil yderligere forbedre deres anvendelighed.
Det bliver besværligt at tælle CFU’er manuelt, når der er et stort antal prøver. Automatiseret optælling af CFU’er kan udføres ved at fotografere pladen og behandle billedet ved hjælp af specialiseret software33. Sieuwerts et al. kombinerede den forbedrede pletteringseffektivitet af plettering med automatiseret kolonitælling ved hjælp af konventionel digital fotografering og ImageJ-software19.
En metode med høj kapacitet til at screene fænotyperne af specifikke mikrobe- og værtsforeninger ville hjælpe undersøgelser af mikrobiomsamfundssamling og indvirkningen på værtssundhed og fitness. Til undersøgelser af Drosophila-mikrobiomet ville en mikrobiologisk platform med høj kapacitet omfatte håndtering af flueprøver i 96-brønds pladeformat, fluelyse uden bakteriel lyse, effektiviteten af pletbelægning, evnen til at bruge fluorescens og skelne mellem flere fluorophorer, et kontrolleret lysmiljø til reproducerbar billeddannelse af CFU-plader og en pålidelig automatiseret kolonitællingssoftware. Denne artikel beskriver en metode, der er optimeret til analyse af CFU’er i gnotobiotiske fluer, som er enkel, hurtig og automatiseret. Denne protokol skitserer en ny arbejdsgang, der kombinerer det bedste fra tidligere offentliggjorte metoder og optimeret til at udforske tarmmikrobiomet i Drosophila.
De detaljerede teknikker, der præsenteres her, muliggør en >100-dobling i antallet af prøver, der kan evalueres i et CFU-tælleeksperiment. Denne teknik fremmer eksisterende metoder til mikrobiomeksperimenter i Drosophila 12,35,36 ved at bruge 96-brøndspladeformatet til at analysere individuelle fluer. Desuden anvender den en mere effektiv pletbelægningsmetode19,31 og en automatiseret arbejdsgang med en fotograferings- og kolonitællingsplatform. Betydningen af denne metode for Drosophila er at standardisere eksperimenter til 96-brøndpladeformatet, hvilket muliggør samtidig håndtering af et stort antal biologiske replikater med automatisering for at opnå kvantificering af CFU’er med høj kapacitet.
96-brøndsplatformen viser, at øget overførselsfrekvens og “rydning” af forbigående bakterier forårsager en betydelig reduktion i både den gennemsnitlige overflod og variationen mellem prøver (figur 1B, C), hvilket viser strengheden af denne forbedrede protokol. En begrænsning af co-housing fluer er den vandrette overførsel af bakterier mellem fluer. En foreslået løsning er at holde fluer individuelt i et 96-brønds pladeformat, såsom Whole Animal Feeding Flat38.
Selvom der ikke blev observeret en signifikant reduktion i bakteriebelastningen, når fluer blev vasket i ethanol, var disse fluer kun blevet opbevaret i nærværelse af eksterne bakterier i 3 dage. Boliger i længere perioder kan tillade en større bakteriebelastning at akkumulere39. Derfor anbefales det stadig at vaske i ethanol.
Overførsel af fluer til 96-brøndspladen er det kritiske første trin til opsætning af arbejdsgangen (figur 1A). Når fluerne er vasket, fordeles de i brøndene en ad gangen. Et pladediagram er nyttigt på dette stadium for at notere, hvilke forhold der er til stede i hver brønd og tilføje eventuelle noter som “flue gik tabt”. Homogenisering er et andet kritisk skridt med nogle vigtige forbehold. Bakterier overlever homogeniseringsprocessen, når de er i nærværelse af en flue (figur 1D, E), og formodentlig gælder dette princip også, når bakterierne er inde i fluens tarm. Imidlertid dræbes bakterier også, når de homogeniseres i perleplader alene, hvilket viser, at homogeniseringen kan dræbe bakteriecellerne under visse omstændigheder, en begrænsning, der kan være vigtig, hvis man for eksempel homogeniserer dissekerede tarme. Især er tabet af CFU’er ved homogenisering afhængig af antallet af CFU’er i prøven, og tabet er minimalt, når der anvendes ~ 105 CFU’er pr. Brønd. Yderligere bevarelse af CFU’er kan opnås ved at stoppe homogenisering halvvejs igennem og afkøle pladen på is.
Homogenisering blev udført i 5 minutter i denne protokol baseret på kontrolforsøg, hvor et kendt antal CFU’er blev blandet med en kimfri flue, og dette fungerede empirisk for fluebakterier. Mindre slag medførte, at større fluedele var til stede, hvilket forstyrrer pipetterne, mens betydeligt længere homogeniseringstider på ~10 min gjorde CFU-tællingerne mere variable. Det mindre volumen og vinklede form af koniske pladebrønde blev observeret for at reducere effektiviteten af perleslag sammenlignet med cylindriske 2 ml rør. Mange variationer af denne generelle tilgang er mulige, herunder hvilke bakteriestammer, hvilken perleslagbeholder, hvilke perler og hvilken fluegenotype der anvendes. Individuelle brugercases skal bruge positive kontroller til at etablere deres tilgang.
Pletbelægningsmetoden blev anvendt på en bestemt måde: 1:2 fortyndinger af L. plantarum WF i PBS blev spottet på MRS-plader og inkuberet ved 30 °C i 2 dage (kortere inkubationstider kan implementeres for at generere mindre kolonistørrelser). Metoden kræver en vis forudgående investering i udstyr, primært perlepiskeren og 96-kanals pipettor (figur 2A), som er nødvendig for både fortyndingsserien og spotbelægningen. Imidlertid er billigere muligheder tilgængelige, herunder en 96-brønds pladereplikator med slidsede stifter. Fortyndingsserien er et kritisk trin, der påvirker nøjagtigheden af CFU-optællingsresultaterne. Med hensyn til fejltilstande er det muligt at tilstoppe pipettespidserne med fluedele eller glasperler, og at pipettespidserne ikke forsegles ordentligt på pipettoren eller svigter af en anden grund. Alle disse problemer resulterer i undertælling af de berørte brønde og bør overvåges. Tilstrækkelig blanding ved hvert trin i fortyndingsserien er også afgørende. Hver fortynding skal blandes grundigt enten ved at lægge pladen på en pladeryster eller ved at pipettere op og ned 15-20 gange, hvilket også tjener til at skylle spidserne. Ved at spotte fra den mest fortyndede til mindst fortyndede plade kan spidserne genbruges til hele fortyndingsserien. Med 1:2 fortyndinger er tællingen nøjagtig over et interval på 2-25 kolonier, der spænder over en størrelsesorden (figur 2C). Derfor sparer 1:10 fortyndinger tid og materialer. En anden variabel, der kan udnyttes, er inkubationstid, som kan justeres til at producere mindre kolonier og dermed øge rækkevidden af tællelige pletter ved at forhindre sammensmeltning af tilstødende kolonier.
Et kvalitetsfoto af pladen er afgørende, da det bliver de rå kildedata, hvorfra CFU’erne analyseres og kan arkiveres på ubestemt tid. FluoroBox er designet til at producere fotos af pladerne med ensartet lysintensitet, hvilket minimerer blænding på agaroverfladen. Derudover er designet i stand til selektivt at fotografere fluorescerende kolonier ved hjælp af enkeltfarvede LED-lys og farvede fotofiltre (figur 3A). Konstruktionen af et setup som FluoroBox med kontrolleret belysning og kameraindstillinger kan i høj grad øge reproducerbarheden af CFU-billeder, hvilket er vigtigt for automatiseret analyse. Kolonimorfologier, fluorescensintensitet og virkningerne af tid eller tæthed på kolonivækst er blot nogle få af de egenskaber, der kan analyseres ved hjælp af fotografierne. Fotoboksen kan konstrueres uden farvefiltre og ensfarvede lys, hvis der ikke anvendes fluorescerende bakterier, hvilket reducerer omkostningerne og kompleksiteten. Forskellige excitationslys og emissionsfiltre kan erstattes af dem, der anbefales her, hvis et andet fluorophore bruges af et laboratorium. Et kamera, der er tilsluttet en tablet via WiFi ved hjælp af en app, er nyttigt både til den automatiserede lukkerfunktion for at forhindre rystelser og for at lette dataoverførslen. Billeder kan overføres til tabletten og derefter til en bærbar computer ved hjælp af trådløs filoverførselssoftware. Anbefalede kameraer med disse muligheder er angivet i materialetabellen.
Count-On-It er et plug-in skrevet i ImageJ. Den automatiserede CFU-tællesoftware segmenterer pladebilledet i et ensartet 96-brøndsgitter, tæller kolonierne i hver gittercelle og batcher resultaterne i et simpelt regneark. Da der altid er variation i placeringen af spotgitteret på pladen og på billedet, skal brugeren manuelt tilpasse gitteret til billedet ved hjælp af Croptacular plug-in. Dette hjælper også med at udelukke områder nær pladekanten, som har blænding. Indstilling af tærsklen er nøglen til at få den mest nøjagtige CFU-optælling fra billedet. Hvis tærsklen er sat for højt, vil kolonierne fusionere; Hvis tærsklen er sat for lavt, vil kolonierne blive udelukket. Når tærsklen er indstillet, anvender makroen gaussisk sløring for at blødgøre kanterne og reducere aliasing, vandskelfilteret deler overlappende kolonier, og klatterne tælles ved hjælp af analysepartikler.
Nogle gange er tætheden af kolonier for høj på et bestemt sted. Count-On-It giver en måde at håndtere dette på. For at estimere antallet af kolonier i en gittercelle med delvist fusionerede kolonier tages først det gennemsnitlige areal af en cirkulær klat fra hele pladen som Cavg. Derefter divideres arealet af blob A 1 med det gennemsnitlige areal af en cirkulær blob A1/Cgns. Dette tal afrundes til nærmeste heltal, og det er estimatet for, hvor mange kolonier der er i en klat. Denne funktion er en af grundene til, at tærsklen kan påvirke tælleresultaterne: det relative gennemsnitlige koloniområde versus et flettet klatområde vil være forskelligt afhængigt af, hvordan tærsklen påvirkede flettede klatter.
De præsenterede metoder har flere begrænsninger. Disse omfatter behovet for udstyr til at dispensere flydende medier nøjagtigt fra 96-brøndplader. Dette udstyr, enten en 96-kanals pipettor eller et slidset replikatorstiftværktøj, kan koste tusindvis af dollars at få. Der findes billigere alternativer, men de er mindre præcise. Automatiseret optælling via Count-On-It giver også nogle begrænsninger. For eksempel, hvis to kolonityper i en blandet befolkning blev afgrænset baseret på størrelse alene, ville blobtælling ikke være i stand til at tildele kolonier til den korrekte type. I dette tilfælde skal pletter med klatter fjernes fra tællinger. Yderligere differentiering af kolonier baseret på morfologi ville være en værdifuld forlængelse af metoden, som ikke er implementeret i øjeblikket. Brugen af selektive medier, herunder stammespecifikke næringsstoffer og antibiotika, forenkler behovet for kompleks billedanalyse.
Vedligeholdelse af bananflueforsøg i 96-brøndsplader multiplicerer antallet af prøver og tilstande, der kan testes i et enkelt eksperiment og kan lette skærme med høj kapacitet i Drosophila-bakterieforeningsfænotyper. Vi forestiller os, at denne metode kan udvides ved at bruge selektive medier til at differentiere mange bakteriestammer i komplekse blandinger. Metoden er ikke begrænset til undersøgelsen af fluemikrobiomet. Kvantificering af CFU’er er almindelig i mange anvendelser af mikrobiologi, fra coliforme tal i drikkevand til identifikation af patogener. CFU-platingsystemet, der præsenteres her, muliggør skærme med høj kapacitet samt automatiseret erhvervelse, behandling, opbevaring og levering af resultater.
The authors have nothing to disclose.
Dr. Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper og medlemmer af Ludington-laboratoriet gav værdifulde input til udviklingen af denne protokol. Finansiering blev ydet af NSF IOS-tilskud 2032985, NIH-tilskud DP5OD017851, et Carnegie Institution of Canada-tilskud og Carnegie Institute for Science’s Endowment.
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |