यह विधि प्लेट कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) के लिए 96-वेल प्लेट प्रारूप का उपयोग करके माइक्रोबियल बहुतायत को निर्धारित करती है और पूरे फ्लाई होमोजेनेट नमूनों में ड्रोसोफिला माइक्रोबायोम पर लागू होती है। सीएफयू को यहां प्रदान किए गए एक स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ गिना जाता है।
जानवरों की आंतों को कॉमेंसल रोगाणुओं द्वारा उपनिवेशित किया जाता है, जो मेजबान विकास, स्वास्थ्य और व्यवहार को प्रभावित करते हैं। माइक्रोबियल संरचना को मान्य करने और इसके प्रभावों का अध्ययन करने के लिए मेजबान और माइक्रोब दोनों के बीच जटिल बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपनिवेशीकरण का सटीक परिमाणीकरण आवश्यक है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, जिसमें कम देशी माइक्रोबियल विविधता है और परिभाषित माइक्रोबियल संरचना के साथ पालन करने के लिए किफायती है, आंत माइक्रोबायोम का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में उभरा है। एक व्यक्तिगत जीव के माइक्रोबायोम का विश्लेषण करने के लिए यह पहचानने की आवश्यकता होती है कि कौन सी माइक्रोबियल प्रजातियां मौजूद हैं और उनकी पूर्ण बहुतायत का परिमाणीकरण। यह लेख बड़ी संख्या में व्यक्तिगत फ्लाई माइक्रोबायोम के विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। मक्खियों को 96-वेल प्लेटों में तैयार किया जाता है, जिससे एक बार में बड़ी संख्या में नमूने की हैंडलिंग हो सकती है। माइक्रोबियल बहुतायत को स्थानों की एक सरणी में एक ही आगर प्लेट पर 96 पूरे फ्लाई होमोजेनेट्स तक चढ़ाकर और फिर प्रत्येक स्थान में बढ़ने वाली कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गिनती करके निर्धारित किया जाता है। इस प्लेटिंग सिस्टम को एक स्वचालित सीएफयू परिमाणीकरण मंच के साथ जोड़ा गया है, जिसमें प्लेटों की फोटोग्राफी, फ्लोरोसेंट कॉलोनियों के भेदभाव और इमेजजे प्लगइन का उपयोग करके कॉलोनियों की स्वचालित गिनती शामिल है। लाभ यह हैं कि (i) यह विधि उपचार के बीच अंतर का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है, (ii) स्पॉट प्लेटिंग विधि पारंपरिक चढ़ाना विधियों के रूप में सटीक है, और (iii) स्वचालित गिनती प्रक्रिया मैन्युअल गिनती की तुलना में सटीक और तेज है। यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो बड़ी संख्या में प्रतिकृतियों में सीएफयू के उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण को सक्षम बनाता है और इन विट्रो और अन्य छोटे पशु मॉडल सहित अन्य सूक्ष्म जीव विज्ञान अध्ययन प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है।
आंतों के माइक्रोबायोटा और उनके पशु मेजबान के बीच संबंध जैविक अध्ययन1 में सबसे आगे है, जो दिखाता है कि मेजबान शरीर विज्ञान 2,3,4 के लिए माइक्रोबायोम की तनाव संरचना महत्वपूर्ण है। खोज की गति उच्च प्राकृतिक अंतर-व्यक्तिगत भिन्नता और बैक्टीरिया 5,6,7 को उपनिवेशित करने की उच्च विविधता जैसे भ्रामक कारकों से सीमित हो गई है। फ्रूट फ्लाई, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, अपने स्वाभाविक रूप से कम विविधता वाले माइक्रोबायोम, हैंडलिंग में आसानी और मजबूत मेजबान आनुवंशिकी 8,9,10,11 के कारण एक आशाजनक मॉडल के रूप में उभरा है। मक्खियों को रोगाणु मुक्त बनाया जा सकता है और परिभाषित माइक्रोबायोटा12 के साथ फिर से जोड़ा जा सकता है, और यह दिखाया गया है कि वनस्पतियां फ्लाई फिजियोलॉजिकललक्षणों को प्रभावित करती हैं 13,14। जन्मजात वनस्पतियों में बैक्टीरिया का एक सीमित सेट होता है जो सभी खेती योग्य होते हैं, और इनके करीबी रिश्तेदार स्तनधारी आंत के लिए भी अंतर्जात होते हैं, जिनमें लैक्टोबैसिली, प्रोटियोबैक्टीरिया और एंटरोकोकी15 शामिल हैं।
मेजबान लक्षणों पर माइक्रोबायोम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए माइक्रोबायोम की मात्रा का परिमाणीकरण की आवश्यकता होती है, दोनों प्रजातियां मौजूद हैं और उनकी पूर्ण बहुतायत16। फ्लाई माइक्रोबायोम का विश्लेषण करने के प्रमुख तरीके कॉलोनी बनाने वाली इकाई (सीएफयू) गिनती17, 16 एस आरआरएनए जीन एम्प्लिकॉन अनुक्रमण9, और 16 एस आरआरएनए जीन18 के क्यूपीसीआर हैं। सीएफयू गिनती महंगे अभिकर्मकों के बिना प्राप्त की जा सकती है, और वे जीवाणु कोशिकाओं की व्यवहार्यता की पुष्टि करतेहैं। क्यूपीसीआर सहित 16 एस तकनीकों के फायदे हैं कि रोगाणुओं की वर्गीकरण पहचान को उनकी विकास आवश्यकताओं या कॉलोनी आकृति विज्ञानकी परवाह किए बिना पता लगाया जा सकता है।
उस मामले में जहां प्रयोग ज्ञात बैक्टीरिया (जीनोबायोटिक मक्खियों) के परिभाषित माइक्रोबायोम के साथ मक्खियों का उपयोग करते हैं, सीएफयू गणनामें अनुक्रमण 21 पर विशेष फायदे हैं। अनुक्रमण महंगा है, सापेक्ष बहुतायत प्राप्त करने के लिए डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर-आधारित पुस्तकालय तैयारी और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण की आवश्यकताहोती है। उच्च लागत के कारण, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण विधियों को आमतौर पर प्रति-नमूना मूल्य23 को कम करने के लिए थोक में प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है। पूर्ण बहुतायत प्राप्त करने के लिए क्यूपीसीआर जैसे आगे केतरीकों की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, सीएफयू गिनती तेज और सस्ती होती है और व्यवहार्य कोशिकाओं की पूर्ण संख्या देती है। ड्रोसोफिला8 और अन्य छोटे माइक्रोबायोम मॉडल24, जिनमें कीड़ा, केनोरहाब्डिस एलिगेंस25,26, और लार्वा ज़ेब्राफिश, डेनियो रेरियो,जो 27 में उगाया जाता है, में बैक्टीरिया की एक सीमित श्रृंखला होती है, जिसने विकास विशेषताओं को जानाहै। इन मामलों में, विशेष रूप से जीनोबायोटिक जानवरों के साथ, सीएफयू गिनती बहु-प्रजाति आंत समुदायों21,27,29 के भीतर बैक्टीरिया की सभी प्रजातियों को अलग कर सकती है। उच्च-थ्रूपुट सीएफयू गिनती विधियों से माइक्रोबायोम की संरचना को मापने की लागत-प्रभावशीलता और गति में और सुधार होगा और इसे कई अन्य सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगों पर लागू किया जा सकता है।
एगार-आधारित विकास मीडिया पर एक जीवाणु निलंबन के सीरियल तनुकरण चढ़ाना द्वारा सीएफयू की गिनती माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में एक मानक विधि है। प्लेटों पर उगने वाली कॉलोनियों को फिर मैन्युअल रूप से गिना जाता है। कमजोर पड़ने से शोधकर्ता को कॉलोनियों के घनत्व का चयन करने की अनुमति मिलती है जो गणना योग्य है (उदाहरण के लिए, ~ 100 सीएफयू प्रति प्लेट), जिसका अर्थ है कि उपनिवेश एक दूसरे में नहीं बढ़ रहे हैं और उचित समय में गिने जा सकते हैं। अधिकांश माइक्रोबायोलॉजिस्ट रॉबर्ट कोच की प्रयोगशाला में 140 साल पहले विकसित एक ही सीएफयू गिनती विधि का अनिवार्य रूप से उपयोग करते हैं, और कई अनुप्रयोगों के लिए, यह विधि अभी भी पर्याप्त है। हालांकि, बड़ी संख्या में नमूनों की मात्रा निर्धारित करने की मांग करते समय एक समस्या उत्पन्न होती है। एक एकल नमूने को गणना योग्य सीएफयू प्राप्त करने के लिए नमूने के 1 से 10 सीरियल कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है, इसलिए कुछ दर्जन से अधिक नमूनों से जुड़े प्रयोग कर योग्य हो जाते हैं। सीएफयू गणना की दक्षता बढ़ाने के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया गया है। स्वचालित सर्पिल चढ़ाना सीरियल तनुकरण30 की आवश्यकता को समाप्त करता है, जिससे सीएफयू गिनती के लिए केवल एक प्लेट आवश्यक हो जाती है लेकिन नमूने को प्लेट करने का समय बढ़ जाता है। सिंगल प्लेट-सीरियल डाइल्यूशन स्पॉटिंग (एसपी-एसडीएस) प्रति नमूना31 कम प्लेटों से सीएफयू अनुमानों की अनुमति देता है। ये विधियां पारंपरिक स्प्रेड-प्लेटिंग विधि पर एक सुधार हैं, लेकिन अभी भी बैक्टीरिया के नमूनों को अकेले संभालने और चढ़ाने की आवश्यकता होती है और इस प्रकार, उच्च थ्रूपुट के लिए आदर्श नहीं हैं। 96-वेल प्लेटों में नमूने को संभालना और आयताकार आगर प्लेटों पर उन 96 नमूनों को स्पॉट प्लेटिंग करने से नमूने19 के थ्रूपुट में काफी सुधार होता है।
माइक्रोबायोम आमतौर पर कई उपभेदों और प्रजातियों से बने होते हैं। जबकि प्रजातियों को अक्सर कॉलोनी आकृति विज्ञान या विकास मीडिया द्वारा अलग किया जा सकता है, प्रतिदीप्ति को विभिन्न प्रकार के बैक्टीरिया और उनके विकास लक्षणों को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकताहै। उदाहरण के लिए, एक ही प्रजाति के विभिन्न जीनोटाइप को विभिन्न आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किया जा सकता है। प्लेट इमेजिंग विधियां जो प्रतिदीप्ति को शामिल करती हैं, शोधकर्ताओं को सीएफयू-आधारित परख32 में इन आनुवंशिक तकनीकों का लाभ उठाने की अनुमति देती हैं। उच्च-थ्रूपुट सीएफयू गिनती विधियों में प्रतिदीप्ति को शामिल करने से उनकी उपयोगिता में और वृद्धि होगी।
सीएफयू को मैन्युअल रूप से गिनना बोझिल हो जाता है जब बड़ी संख्या में नमूने होते हैं। सीएफयू की स्वचालित गिनती प्लेट की तस्वीर खींचकर और विशेष सॉफ्टवेयर33 का उपयोग करके छवि को संसाधित करके आयोजित की जा सकती है। सियूवर्ट्स एट अल ने पारंपरिक डिजिटल फोटोग्राफी और इमेजजे सॉफ्टवेयर19 का उपयोग करके स्वचालित कॉलोनी गिनती के साथ स्पॉट-प्लेटिंग की बेहतर प्लेटिंग दक्षता को जोड़ा।
विशिष्ट माइक्रोब और मेजबान संघों के फेनोटाइप को स्क्रीन करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि माइक्रोबायोम सामुदायिक असेंबली और मेजबान स्वास्थ्य और फिटनेस पर प्रभाव के अध्ययन में सहायता करेगी। ड्रोसोफिला माइक्रोबायोम के अध्ययन के लिए, एक उच्च-थ्रूपुट माइक्रोबायोलॉजी प्लेटफॉर्म में 96-वेल प्लेट प्रारूप में फ्लाई नमूनों की हैंडलिंग, बैक्टीरियल लाइसिस के बिना फ्लाई लाइसिस, स्पॉट-प्लेटिंग की दक्षता, फ्लोरेसेंस का उपयोग करने और कई फ्लोरोफोरे को अलग करने की क्षमता, सीएफयू प्लेटों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग के लिए एक नियंत्रित प्रकाश वातावरण और एक विश्वसनीय स्वचालित कॉलोनी गिनती सॉफ्टवेयर शामिल होगा। यह लेख जीनोबायोटिक मक्खियों में सीएफयू की परख के लिए अनुकूलित एक विधि का वर्णन करता है, जो सरल, तेज और स्वचालित है। यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला में आंत माइक्रोबायोम की खोज के लिए पहले प्रकाशित तरीकों और अनुकूलित तरीकों के संयोजन वाले एक नए वर्कफ़्लो को रेखांकित करता है।
यहां प्रस्तुत विस्तृत तकनीक सीएफयू गिनती प्रयोग में मूल्यांकन किए जा सकने वाले नमूनों की संख्या में >100 गुना वृद्धि को सक्षम करती है। यह तकनीक अलग-अलग मक्खियों की परख के लिए 96-वेल प्लेट प्रारूप का उपयोग करके ड्रोसोफिला 12,35,36 में माइक्रोबायोम प्रयोगों के लिए मौजूदा तरीकों को आगे बढ़ाती है। इसके अलावा, यह एक अधिक कुशल स्पॉट प्लेटिंग विधि 19,31 और फोटोग्राफी और कॉलोनी गिनती मंच के साथ एक स्वचालित वर्कफ़्लो लागू करता है। ड्रोसोफिला के लिए इस पद्धति का महत्व 96-वेल प्लेट प्रारूप में प्रयोगों को मानकीकृत करना है, जो सीएफयू के उच्च-थ्रूपुट परिमाणीकरण को प्राप्त करने के लिए स्वचालन के साथ बड़ी संख्या में जैविक प्रतिकृतियों के एक साथ हैंडलिंग को सक्षम बनाता है।
96-वेल प्लेटफॉर्म से पता चलता है कि स्थानांतरण की बढ़ती आवृत्ति और क्षणिक बैक्टीरिया की “समाशोधन” औसत बहुतायत और नमूनों के बीच भिन्नता दोनों में महत्वपूर्ण कमी का कारण बनती है (चित्रा 1 बी, सी), इस बेहतर प्रोटोकॉल की कठोरता का प्रदर्शन करता है। सह-आवास मक्खियों की एक सीमा मक्खियों के बीच बैक्टीरिया का क्षैतिज हस्तांतरण है। एक प्रस्तावित समाधान मक्खियों को 96-वेल प्लेट प्रारूप में व्यक्तिगत रूप से रखना है, जैसे कि पूरे पशु आहार फ्लैट38।
हालांकि इथेनॉल में मक्खियों को धोए जाने पर जीवाणु भार में महत्वपूर्ण कमी नहीं देखी गई थी, इन मक्खियों को केवल 3 दिनों के लिए बाहरी बैक्टीरिया की उपस्थिति में रखा गया था। लंबे समय तक आवास एक अधिक जीवाणु भार को जमा करने की अनुमति दे सकताहै। इसलिए, इथेनॉल में धोने की अभी भी सिफारिश की जाती है।
96-वेल प्लेट में मक्खियों को स्थानांतरित करना वर्कफ़्लो (चित्रा 1 ए) स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण पहला कदम है। एक बार जब मक्खियों को धोया जाता है, तो उन्हें एक बार में कुओं में वितरित किया जाता है। इस स्तर पर एक प्लेट चार्ट यह नोट करने के लिए उपयोगी है कि प्रत्येक कुएं में कौन सी स्थितियां मौजूद हैं और “फ्लाई खो गई थी” जैसे किसी भी नोट को जोड़ें। होमोजेनाइजेशन कुछ महत्वपूर्ण चेतावनियों के साथ एक और महत्वपूर्ण कदम है। बैक्टीरिया एक मक्खी (चित्रा 1 डी, ई) की उपस्थिति में होमोजेनाइजेशन प्रक्रिया से बच जाते हैं, और संभवतः, यह सिद्धांत तब भी सच होता है जब बैक्टीरिया मक्खी की आंत के अंदर होते हैं। हालांकि, बैक्टीरिया भी मारे जाते हैं जब उन्हें अकेले बीड बीटर प्लेटों में समरूप किया जाता है, यह दर्शाता है कि होमोजेनाइजेशन कुछ परिस्थितियों में बैक्टीरिया कोशिकाओं को मार सकता है, एक सीमा जो महत्वपूर्ण हो सकती है यदि कोई विच्छेदित आंत को समरूप कर रहा है, उदाहरण के लिए। विशेष रूप से, होमोजेनाइजिंग करते समय सीएफयू का नुकसान नमूने में सीएफयू की संख्या पर निर्भर होता है, और नुकसान न्यूनतम होता है जब ~ 105 सीएफयू प्रति कुएं का उपयोग किया जाता है। सीएफयू के आगे संरक्षण को होमोजेनाइजेशन को आधे रास्ते में रोककर और बर्फ पर प्लेट को ठंडा करके प्राप्त किया जा सकता है।
नियंत्रण प्रयोगों के आधार पर इस प्रोटोकॉल में 5 मिनट के लिए होमोजेनाइजेशन किया गया था जहां सीएफयू की एक ज्ञात संख्या को रोगाणु मुक्त मक्खी के साथ मिलाया गया था, और इसने फ्लाई बैक्टीरिया के लिए अनुभवजन्य रूप से काम किया। कम धड़कन के कारण बड़े फ्लाई पार्ट्स मौजूद होते हैं, जो पिपेटिंग में हस्तक्षेप करते हैं, जबकि ~ 10 मिनट के काफी लंबे होमोजेनाइजेशन समय ने सीएफयू गिनती को अधिक परिवर्तनशील बना दिया। शंक्वाकार प्लेट कुओं की छोटी मात्रा और कोण आकार बेलनाकार 2 एमएल ट्यूबों की तुलना में मोती की धड़कन की दक्षता को कम करने के लिए देखा गया था। इस सामान्य दृष्टिकोण पर कई भिन्नताएं संभव हैं, जिनमें कौन से जीवाणु उपभेद, कौन से मोती बीटिंग कंटेनर, कौन से मोती, और कौन से फ्लाई जीनोटाइप का उपयोग किया जाता है। व्यक्तिगत उपयोगकर्ता मामलों को अपने दृष्टिकोण को स्थापित करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने की आवश्यकता है।
स्पॉट प्लेटिंग विधि को एक विशिष्ट तरीके से नियोजित किया गया था: पीबीएस में एल प्लांटारम डब्ल्यूएफ के 1: 2 कमजोर पड़ने को एमआरएस प्लेटों पर देखा गया था और 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था (छोटे कॉलोनी आकार उत्पन्न करने के लिए कम इनक्यूबेशन बार लागू किया जा सकता है)। विधि को उपकरणों में कुछ अप-फ्रंट निवेश की आवश्यकता होती है, मुख्य रूप से बीड बीटर और 96-चैनल पाइपेटर (चित्रा 2 ए), जो कमजोर पड़ने की श्रृंखला और स्पॉट प्लेटिंग दोनों के लिए आवश्यक है। हालांकि, कम महंगे विकल्प उपलब्ध हैं, जिसमें स्लॉट किए गए पिन के साथ 96-वेल प्लेट रेप्लिकेटर शामिल हैं। कमजोर पड़ने की श्रृंखला एक महत्वपूर्ण कदम है जो सीएफयू गिनती परिणामों की सटीकता को प्रभावित करता है। विफलता मोड के संदर्भ में, पिपेट युक्तियों को फ्लाई पार्ट्स या ग्लास बीड्स के साथ बंद करना संभव है और पिपेट युक्तियों के लिए पिपेटर पर ठीक से सील नहीं करना या किसी अन्य कारण से विफल होना संभव है। इन सभी समस्याओं के परिणामस्वरूप प्रभावित कुओं की संख्या कम हो जाती है और इनकी निगरानी की जानी चाहिए। कमजोर पड़ने की श्रृंखला के प्रत्येक चरण में पर्याप्त मिश्रण भी महत्वपूर्ण है। प्रत्येक तनुकरण को या तो प्लेट शेकर पर प्लेट को डालकर या 15-20 बार ऊपर और नीचे करके अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए, जो युक्तियों को कुल्ला करने का भी कार्य करता है। सबसे पतला से कम पतला प्लेट तक स्पॉट करके, युक्तियों को पूरी कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। 1: 2 कमजोर पड़ने के साथ, गिनती 2-25 कॉलोनियों की सीमा में सटीक होती है, जो परिमाण के क्रम में फैली होती है (चित्रा 2 सी)। इसलिए, 1:10 कमजोर पड़ने से समय और सामग्री की बचत होती है। एक अन्य चर जिसका लाभ उठाया जा सकता है वह है इनक्यूबेशन समय, जिसे छोटी कॉलोनियों का उत्पादन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है और इस प्रकार, आसन्न कॉलोनियों के विलय को रोककर गणना योग्य स्थानों की सीमा में वृद्धि होती है।
प्लेट की एक गुणवत्ता फोटो आवश्यक है क्योंकि यह कच्चा स्रोत डेटा बन जाता है जिसमें से सीएफयू का विश्लेषण किया जाता है और अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है। फ्लोरोबॉक्स को समान प्रकाश तीव्रता के साथ प्लेटों की तस्वीरें बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो आगर की सतह पर चमक को कम करता है। इसके अतिरिक्त, डिजाइन एकल-रंग एलईडी रोशनी और रंगीन फोटो फिल्टर (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके फ्लोरोसेंट कॉलोनियों को चुनिंदा रूप से फोटोग्राफ करने में सक्षम है। नियंत्रित प्रकाश व्यवस्था और कैमरा सेटिंग्स के साथ फ्लोरोबॉक्स जैसे सेटअप का निर्माण, सीएफयू छवियों की प्रजनन क्षमता को बहुत बढ़ा सकता है, जो स्वचालित विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। कॉलोनी आकृति विज्ञान, प्रतिदीप्ति तीव्रता, और कॉलोनी के विकास पर समय या घनत्व के प्रभाव कुछ गुण हैं जिनका विश्लेषण तस्वीरों का उपयोग करके किया जा सकता है। फोटो बॉक्स का निर्माण रंग फिल्टर और एकल-रंग रोशनी के बिना किया जा सकता है यदि कोई फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया का उपयोग नहीं किया जाता है, जिससे लागत और जटिलता कम हो जाती है। यदि प्रयोगशाला द्वारा एक अलग फ्लोरोफोरे का उपयोग किया जाता है तो यहां अनुशंसित लोगों के लिए विभिन्न उत्तेजना रोशनी और उत्सर्जन फिल्टर को प्रतिस्थापित किया जा सकता है। एक कैमरा जो एक ऐप का उपयोग करके वाईफाई पर टैबलेट से जुड़ा होता है, झटकों को रोकने और डेटा ट्रांसफर में आसानी के लिए स्वचालित शटर सुविधा दोनों के लिए उपयोगी होता है। छवियों को वायरलेस फ़ाइल ट्रांसफर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके टैबलेट और फिर लैपटॉप में स्थानांतरित किया जा सकता है। इन क्षमताओं के साथ अनुशंसित कैमरों को सामग्री की तालिका में इंगित किया गया है।
काउंट-ऑन-यह इमेजजे में लिखा गया एक प्लग-इन है। स्वचालित सीएफयू गिनती सॉफ्टवेयर प्लेट छवि को एक समान 96-वेल ग्रिड में विभाजित करता है, प्रत्येक ग्रिड सेल में कॉलोनियों की गणना करता है, और परिणामों को एक साधारण स्प्रेडशीट में बैच करता है। चूंकि प्लेट पर और फोटो में स्पॉट ग्रिड की स्थिति में हमेशा भिन्नता होती है, इसलिए उपयोगकर्ता को क्रॉपटेकुलर प्लग-इन का उपयोग करके ग्रिड को मैन्युअल रूप से फोटो के अनुरूप होना चाहिए। यह प्लेट किनारे के पास के क्षेत्रों को बाहर करने में भी मदद करता है, जिनमें चमक होती है। दहलीज सेट करना छवि से सबसे सटीक सीएफयू गिनती प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि सीमा बहुत अधिक निर्धारित की जाती है, तो उपनिवेश विलय हो जाएंगे; यदि सीमा बहुत कम निर्धारित की जाती है, तो कॉलोनियों को बाहर रखा जाएगा। एक बार दहलीज निर्धारित हो जाने के बाद, मैक्रो किनारों को नरम करने और उपनाम को कम करने के लिए गॉसियन ब्लर लागू करता है, वाटरशेड फिल्टर ओवरलैपिंग कॉलोनियों को विभाजित करता है, और ब्लॉब्स को विश्लेषण कणों का उपयोग करके गिना जाता है।
कभी-कभी, कॉलोनियों का घनत्व किसी विशेष स्थान पर बहुत अधिक होता है। काउंट-ऑन-यह इससे निपटने का एक तरीका प्रदान करता है। आंशिक रूप से विलय की गई कॉलोनियों वाले ग्रिड सेल में कॉलोनियों की संख्या का अनुमान लगाने के लिए, पहले पूरी प्लेट से एक गोलाकार ब्लॉब के औसत क्षेत्र को सीऔसत के रूप में लिया जाता है। फिर, ब्लॉब ए1 के क्षेत्रफल को एक गोलाकार ब्लॉब ए1/सी औसत के औसत क्षेत्रफल से विभाजित किया जाता है। यह संख्या निकटतम पूर्णांक के लिए गोल है, और यह अनुमान है कि एक ब्लॉब में कितनी कॉलोनियां हैं। यह फ़ंक्शन एक कारण है कि दहलीज गिनती परिणामों को प्रभावित कर सकती है: सापेक्ष औसत कॉलोनी क्षेत्र बनाम एक विलय ब्लॉब क्षेत्र इस बात पर निर्भर करता है कि सीमा ने विलय किए गए ब्लॉब्स को कैसे प्रभावित किया।
प्रस्तुत विधियों में कई सीमाएँ हैं। इनमें 96-वेल प्लेटों से तरल मीडिया को सटीक रूप से वितरित करने के लिए उपकरणों की आवश्यकता शामिल है। यह उपकरण, या तो एक 96-चैनल पिपेटर या एक स्लॉट डे प्रतिलिपिकार पिन उपकरण, प्राप्त करने के लिए हजारों डॉलर खर्च कर सकता है। सस्ता विकल्प मौजूद है लेकिन कम सटीक हैं। काउंट-ऑन-इट के माध्यम से स्वचालित गिनती भी कुछ सीमाएं प्रस्तुत करती है। उदाहरण के लिए, यदि मिश्रित आबादी में दो कॉलोनी प्रकारों को अकेले आकार के आधार पर सीमांकित किया गया था, तो ब्लॉब गिनती कॉलोनियों को सही प्रकार में असाइन करने में सक्षम नहीं होगी। इस मामले में, ब्लब्स वाले धब्बों को गिनती से समाप्त करने की आवश्यकता होगी। आकृति विज्ञान के आधार पर कॉलोनियों का आगे भेदभाव उस विधि का एक मूल्यवान विस्तार होगा जो वर्तमान में लागू नहीं है। तनाव-विशिष्ट पोषक तत्वों और एंटीबायोटिक दवाओं सहित चयनात्मक मीडिया का उपयोग जटिल छवि विश्लेषण की आवश्यकता को सरल बनाता है।
96-वेल प्लेटों में फ्रूट फ्लाई प्रयोगों को बनाए रखने से नमूनों और स्थितियों की संख्या कई गुना बढ़ जाती है जिन्हें एक ही प्रयोग में परीक्षण किया जा सकता है और ड्रोसोफिला-बैक्टीरिया एसोसिएशन फेनोटाइप्स में उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन की सुविधा प्रदान कर सकता है। हम कल्पना करते हैं कि जटिल मिश्रण में कई जीवाणु उपभेदों को अलग करने के लिए चयनात्मक मीडिया का उपयोग करके इस विधि को बढ़ाया जा सकता है। विधि फ्लाई माइक्रोबायोम के अध्ययन तक सीमित नहीं है। पीने के पानी में कोलीफॉर्म गिनती से लेकर रोगजनकों की पहचान तक, माइक्रोबायोलॉजी के कई अनुप्रयोगों में सीएफयू का परिमाणीकरण आम है। यहां प्रस्तुत सीएफयू प्लेटिंग सिस्टम उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन, साथ ही स्वचालित अधिग्रहण, प्रसंस्करण, भंडारण और परिणामों के वितरण को सक्षम बनाता है।
The authors have nothing to disclose.
केरविन केसी हुआंग, डॉ एंड्रेस अरंडा-डिआज़, टेड कूपर और लुडिंगटन प्रयोगशाला के सदस्यों ने इस प्रोटोकॉल के विकास पर मूल्यवान इनपुट दिया। एनएसएफ आईओएस अनुदान 2032985, एनआईएच अनुदान डीपी 5ओडी017851, कनाडा के कार्नेगी इंस्टीट्यूशन अनुदान और कार्नेगी इंस्टीट्यूट फॉर साइंस एंडोमेंट द्वारा वित्त पोषण प्रदान किया गया था।
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |