Summary
Denna metod kvantifierar mikrobiell överflöd med hjälp av ett 96-brunnsplattformat till plattkolonibildande enheter (CFU) och appliceras på Drosophila-mikrobiomet i hela flughomogenatprover. CFUs räknas med en automatiserad bildanalysprogramvara som tillhandahålls här.
Abstract
Tarmarna hos djur koloniseras av kommensala mikrober, som påverkar värdens utveckling, hälsa och beteende. Exakt kvantifiering av kolonisering är avgörande för att studera de komplexa interaktionerna mellan värd och mikrob både för att validera den mikrobiella sammansättningen och studera dess effekter. Drosophila melanogaster, som har en låg inhemsk mikrobiell mångfald och är ekonomisk att föda upp med definierad mikrobiell sammansättning, har framstått som en modellorganism för att studera tarmmikrobiomet. Analys av mikrobiomet hos en enskild organism kräver identifiering av vilka mikrobiella arter som är närvarande och kvantifiering av deras absoluta överflöd. Denna artikel presenterar en metod för analys av ett stort antal enskilda flugmikrobiomer. Flugorna är beredda i 96-brunnsplattor, vilket möjliggör hantering av ett stort antal prover samtidigt. Mikrobiellt överflöd kvantifieras genom plätering av upp till 96 hela flughomogenater på en enda agarplatta i en rad fläckar och sedan räkna de kolonibildande enheterna (CFU) som växer på varje plats. Detta pläteringssystem är parat med en automatiserad CFU-kvantifieringsplattform, som innehåller fotografering av plattorna, differentiering av fluorescerande kolonier och automatiserad räkning av kolonierna med hjälp av ett ImageJ-plugin. Fördelarna är att (i) denna metod är tillräckligt känslig för att upptäcka skillnader mellan behandlingar, (ii) punktpläteringsmetoden är lika exakt som traditionella pläteringsmetoder, och (iii) den automatiska räkningsprocessen är korrekt och snabbare än manuell räkning. Arbetsflödet som presenteras här möjliggör kvantifiering av CFUs med hög genomströmning i ett stort antal replikat och kan tillämpas på andra mikrobiologiska studiesystem inklusive in vitro - och andra smådjursmodeller.
Introduction
Förhållandet mellan tarmmikrobiota och deras djurvärd ligger alltmer i framkant av biologiska studier1, som visar att mikrobiomets stamsammansättning är viktig för värdfysiologin 2,3,4. Upptäcktstakten har begränsats av förvirrande faktorer som hög naturlig interindividuell variation och hög mångfald av koloniserande bakterier 5,6,7. Bananflugan, Drosophila melanogaster, har framstått som en lovande modell på grund av dess naturligt lågdiversitetsmikrobiom, enkel hantering och robusta värdgenetik 8,9,10,11. Flugor kan göras bakteriefria och återförknippas med en definierad mikrobiota12, och det har visat sig att floran påverkar flugfysiologiska egenskaper13,14. Den medfödda floran består av en begränsad uppsättning bakterier som alla är odlingsbara, och nära släktingar till dessa är också endogena till däggdjurets tarm, inklusive Lactobacilli, Proteobacteria och Enterococci15.
Att studera mikrobiomets inflytande på värdegenskaper kräver kvantifiering av mikrobiomet när det gäller både vilka arter som är närvarande och deras absoluta överflöd16. De dominerande sätten att analysera flugmikrobiomet är kolonibildande enhet (CFU) räknar17, 16S rRNA -genampliconsekvensering9 och qPCR för 16S rRNA -genen18. CFU-räkningar kan erhållas utan dyra reagenser, och de bekräftar bakteriecellernas livskraft19. 16S-teknikerna inklusive qPCR har fördelar genom att taxonomiska identiteter hos mikrober kan fastställas utan hänsyn till deras tillväxtbehov eller kolonimorfologier20.
I det fall där experiment använder flugor med ett definierat mikrobiom av kända bakterier (gnotobiotiska flugor) har CFU-räkningar särskilda fördelar jämfört med sekvensering21. Sekvensering är dyrt, vilket kräver DNA-extraktion, PCR-baserad biblioteksberedning och sekvensering med hög genomströmning för att erhålla relativa överflöd22. På grund av den höga kostnaden måste sekvenseringsmetoder med hög genomströmning vanligtvis utföras i bulk för att minska priset per prov23. Ytterligare metoder såsom qPCR krävs för att erhålla absoluta överflöd16. Däremot är CFU-räkningar snabba och billiga och ger det absoluta antalet livskraftiga celler. Drosophila8 och andra små mikrobiommodeller 24, inklusive masken, Caenorhabditis elegans 25,26, och larvzebrafisken, Danio rerio, odlad gnotobiotiskt 27, har ett begränsat antal bakterier, som har kända tillväxtegenskaper 28. I dessa fall, särskilt med gnotobiotiska djur, kan CFU-räkning skilja alla bakteriearter inom tarmsamhällena med flera arter21,27,29. CFU-räkningsmetoder med högre genomströmning skulle ytterligare förbättra kostnadseffektiviteten och hastigheten för att mäta mikrobiomets sammansättning och kan tillämpas på många andra mikrobiologiska experiment.
Att räkna CFUs genom seriell utspädningsplätering av en bakteriesuspension på agarbaserade tillväxtmedier är en standardmetod inom mikrobiologi. Kolonierna som växer på plattorna räknas sedan manuellt. Utspädningarna gör det möjligt för forskaren att välja en densitet av kolonier som är räknbar (t.ex. ~ 100 CFU per platta), vilket innebär att kolonierna inte växer in i varandra och kan räknas inom rimlig tid. De flesta mikrobiologer använder i huvudsak samma CFU-räkningsmetod som utvecklades för 140 år sedan i Robert Kochs laboratorium, och för många applikationer är denna metod fortfarande tillräcklig. Ett problem uppstår emellertid när man försöker kvantifiera ett stort antal prover. Ett enda prov kan kräva plätering av 1 till 10 seriella utspädningar av provet för att erhålla räknbara CFU: er, så experiment med mer än några dussin prover blir beskattande. Olika metoder har utvecklats för att öka effektiviteten i CFU-uppräkningen. Automatiserad spiralplätering eliminerar behovet av seriella utspädningar30, vilket gör endast en platta nödvändig för CFU-räkning men ökar tiden för att plåta provet. Single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) möjliggör CFU-uppskattningar från färre plattor per prov31. Dessa metoder är en förbättring av den traditionella spridningsmetoden men kräver fortfarande hantering och plätering av bakterieprover var för sig och är därför inte idealiska för hög genomströmning. Hantering av prover i 96-brunnsplattor och punktplätering av dessa 96 prover på rektangulära agarplattor förbättrar avsevärt provernas genomströmning19.
Mikrobiomer består vanligtvis av flera stammar och arter. Medan arter ofta kan särskiljas genom kolonimorfologi eller tillväxtmedier, kan fluorescens användas för att ytterligare skilja olika typer av bakterier och deras tillväxtegenskaper32. Till exempel kan olika genotyper av samma art märkas med olika genetiskt kodade fluorescerande proteiner. Plattavbildningsmetoder som innehåller fluorescens gör det möjligt för forskare att dra nytta av dessa genetiska tekniker i CFU-baserade analyser32. Att införliva fluorescens i CFU-räkningsmetoder med hög genomströmning skulle ytterligare förbättra deras användbarhet.
Att räkna CFUs manuellt blir besvärligt när det finns ett stort antal prover. Automatiserad räkning av CFUs kan utföras genom att fotografera plattan och bearbeta bilden med hjälp av specialiserad programvara33. kombinerade den förbättrade pläteringseffektiviteten för punktplätering med automatiserad koloniräkning med konventionell digital fotografering och ImageJ-programvara19.
En metod med hög genomströmning för att screena fenotyperna för specifika mikrob- och värdföreningar skulle hjälpa studier av mikrobiomgemenskapsmontering och påverkan på värdens hälsa och kondition. För studier av Drosophila-mikrobiomet skulle en mikrobiologisk plattform med hög genomströmning innehålla hantering av flygprover i 96-brunnsplattformat, fluglys utan bakteriell lys, effektiviteten av punktplätering, förmågan att använda fluorescens och skilja flera fluoroforer, en kontrollerad ljusmiljö för reproducerbar avbildning av CFU-plattor och en pålitlig automatiserad koloniräkningsprogramvara. Den här artikeln beskriver en metod som är optimerad för analys av CFUs i gnotobiotiska flugor, vilket är enkelt, snabbt och automatiserat. Detta protokoll beskriver ett nytt arbetsflöde som kombinerar det bästa av tidigare publicerade metoder och optimeras för att utforska tarmmikrobiomet i Drosophila.
Protocol
1. Flyga kolonisering
OBS: Denna metod är lämplig för kvantitativ analys av flugor med ett odlingsbart tarmmikrobiom genom tillväxtplätering av CFUs. Ett detaljerat protokoll för uppfödning av gnotobiotiska flugor har tidigare publicerats12.
- Upprätta stabil kolonisering av en kommensal bakterieart.
- Förbered en färsk bakteriekultur, pellet genom centrifugering vid 400 x g i 3 minuter vid rumstemperatur, och återsuspendera cellpelleten i PBS till en OD600 på 1,0. För detta protokoll, Lactiplantibacillus plantarum (tidigare känd som Lactobacillus plantarum) odlades över natten till en OD600 av 2.0.
- Pipettera 100 μl på maten i en injektionsflaska med fluga (se Materialförteckning). Sprid jämnt och låt vätskan absorberas i 15-30 min.
- Överför 20 bakteriefria flugor till injektionsflaskan med standardflaskan till injektionsflaskan34. Varje fluga kommer att äta en ungefär lika stor mängd av bakteriedosen35. Alternativt kan bakteriefria ägg tillsättas.
- Överför flugorna till färsk steril mat dagligen i 3 dagar. Gör allt detta i ett biosäkerhetsskåp och använd steril teknik (figur 1A-1).
- Innan du mäter CFU-belastningen, överför flugorna till en injektionsflaska som innehåller sterilt agarvatten i 4 timmar för att rensa övergående bakterier från tarmen. Agarvattenflaskorna ger en fuktkälla för flugan men ingen näring för flugan eller bakterier på ytan. De är beredda i samma sterila flugflaskor som med standardmat men innehåller endast avjoniserat vatten och 1,5% agar.
2. Homogenisering flyger individuellt i en 96-brunns PCR-platta
- Förbered pärlvispplattor i förväg.
- Häll 0,5 μm glaspärlor (se Materialförteckning) på pärlmätbrickan (3D-printad med hjälp av Supplemental Coding File 1 S1-bead-measurer.stl). Sprid pärlorna på brickan så att alla brunnar är fulla och plana och borsta sedan bort överflödiga pärlor i ett koniskt rör för att återställa dem.
- Placera en halvkjolad PCR-platta (se materialtabell) upp och ner på mätbrickan och rikta in den mot brunnarna genom att montera den i fördjupningen på mätbrickan. Vänd sedan snabbt på den för att överföra pärlorna.
- Ta bort överflödiga pärlor från PCR-plattans yta och täck den med folie. Inspektera PCR-plattan för att säkerställa att alla brunnar innehåller pärlor. Använd en vägskopa om det behövs för att lägga pärlor i en enda brunn. Om statisk elektricitet får pärlor att fastna på plattans ytor, torka eller spraya baksidan av mätbrickan och PCR-plattan med 70% etanol.
- Täck med aluminiumfolie. Många plattor kan beredas på detta sätt och sedan autoklaveras och lagras för senare användning. När den är klar för användning, tillsätt 100 μL PBS till varje brunn med 96-kanals pipettor (se materialförteckning).
- Ytsterilisera de mikrobkoloniserade flugorna (se steg 1) med 70% etanol före homogenisering.
- Bedöva flugorna med 100%CO2 i 5 s. Överför bedövade flugor från injektionsflaskan till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med en liten tratt (figur 1A-2). I denna studie tillsattes vanligtvis 25 flugor per rör.
- Spraya omedelbart ~ 1 ml 70% etanol i röret, stäng röret och blanda genom inversion i 10 s. Aspirera sedan etanolen med en P1000-pipett och var försiktig så att du inte aspirerar några flugor. Upprepa en gång till med etanol, sedan två gånger med steril PBS (figur 1A-3).
- Efter den sista PBS-tvätten, stäng röret och knacka hårt på locket med locksidan nedåt några gånger på bänken så att flugorna går in i locket.
- Öppna röret och fördela flugor i brunnarna med pincett (figur 1A-4). Placera en fluga i varje brunn (figur 1A-5). Håll plattan på is medan du laddar för att hålla flugorna sövda.
- Försegla plattan med termisk bindningsvärmetätningsfolie (se materialtabell).
- Ta först bort eventuella ströpärlor som ligger nära brunnarna eftersom dessa kan orsaka läckage i folietätningen. Se till att den tråkiga sidan av folien är orienterad ner på plattan och den blanka sidan upp mot värmeförseglaren. Tryck ned värmeförseglaren (se materialtabellen) ordentligt i 5 s (figur 1A-6). Bränn med handapplikatorn (se materialtabellen) för att säkra folien.
OBS: Dålig tätning är en orsak till provförlust.
- Ta först bort eventuella ströpärlor som ligger nära brunnarna eftersom dessa kan orsaka läckage i folietätningen. Se till att den tråkiga sidan av folien är orienterad ner på plattan och den blanka sidan upp mot värmeförseglaren. Tryck ned värmeförseglaren (se materialtabellen) ordentligt i 5 s (figur 1A-6). Bränn med handapplikatorn (se materialtabellen) för att säkra folien.
- Fäst plattan i plattskakaren. Homogenisera i 5 minuter (figur 1A-7). Snurra ner pärlplattan i 30 s i en miniplattspinnare (se materialtabell) vid 350 x g för att ta bort vätska från tätningsfolien.
- Ta bort folien medan du håller plattan för att inte stänka droppar av flughomogenat ur brunnarna.
3. Seriell utspädning av flughomogenat och spotting på CFU-plattor
- Placera fyra rektangulära MRS-agartillväxtplattor (se materialförteckning) i biosäkerhetsskåpet och ta bort locken. I detta protokoll användes MRS-agar för tillväxt av L. plantarum. Låt dessa plattor torka i minst 10 min (20 min om de är nyhällda eller kalla från förvaring).
OBS: Om plattorna är våta kommer dropparna från 96-brunnsplattan att löpa ihop och förstöra räkningarna. - Bered tre utspädningsplattor genom att tillsätta 100 μL PBS till varje brunn i en steril 96-brunnsplatta med en 96-kanals pipettor. Ladda ett rack med P20-spetsar på 96-kanals pipettoren.
- Späd 1:10 genom att suga upp 11,1 μl homogenat från provplattan som beretts i avsnitt 2 (figur 1A-8). Var noga med att dra från mitten av brunnarna snarare än botten av brunnarna eftersom flughomogenatet och glaspärlorna kommer att täppa till pipetterna. Pärlorna sjunker och flugpartiklarna flyter och lämnar mellanskiktet mestadels klart.
- Fördela 11,1 μl i den första utspädningsplattan, som redan innehåller 100 μl steril PBS per brunn. Förvara utspädningsplattan på plattskakaren i 10 s vid 600 rpm. Blanda igen genom att pipettera upp och ner i fem cykler. Överför 11,1 μl från den första utspädningsplattan till den andra utspädningsplattan och upprepa blandningsstegen för de två följande utspädningsplattorna.
- Utför utspädningsserieplätering enligt beskrivningen nedan.
- Hämta tillväxtplattorna från biosäkerhetsskåpet.
- Börja med den mest utspädda plattan, placera 2 μL från varje brunn på agarplattorna med pipettor med 96-brunnar (figur 1A-9).
- Sänk pipettorhuvudet långsamt på plattan och var försiktig så att du inte sticker in i agar. Undersök plattan noggrant och se till att alla fläckar har dispenserats; Om inte, tillsätt manuellt 2 μL till lämplig position. Kontrollera att vätskefläckarna snabbt suger in i agar och inte går ihop.
- Om fläckarna går ihop, torka en ny uppsättning färska agarplattor under en längre period och gör om spottingen. Om det finns flera platttyper (t.ex. olika medier eller med antibiotika), upptäck dem också. Fördela eventuell återstående lösning tillbaka i utspädningsplattan och fortsätt till nästa högre koncentration.
Anmärkning: När du upptäcker utspädningar, blanda nästa utspädning fem gånger för att säkerställa att innehållet i pipettspetsarna rensas från den tidigare utspädningen. Utspädningsplattorna kan förvaras >8 timmar vid 4 °C utan att påverka antaletkolonier 35.
- Upprepa pläteringsprocessen enligt beskrivningen i steg 3.5 för de återstående utspädningsplattorna och fortsätt från de mest utspädda till de mest koncentrerade tills plattan med det ursprungliga homogenatet.
- När all vätska har absorberats i agar, invertera plattorna och placera dem i inkubatorn (figur 1A-10). För Lactiplantibacillus och Acetobacter från Drosophila är den optimala temperaturen 30 °C på MRS media. Inkubera tills kolonierna har nått optimal storlek: kolonierna är tillräckligt stora för att tydligt se dem men inte så stora att de smälter samman eller stör varandras tillväxt (se de representativa resultaten för kvantifiering av den optimala storleken).
OBS: Optimala tillväxtförhållanden är stamberoende och måste bestämmas empiriskt. För Lactiplantibacillus från Drosophila är den optimala inkubationstiden 26 h till 30 h på MRS-agar. För Acetobacter från Drosophila är den optimala inkubationstiden 30 h till 48 h på MRS beroende på stammen. - Efter inkubation, förvara plattorna vid 4 °C om det behövs tills de är klara för räkning.
4. Kvantifiering av CFU
- Kvantifiera CFUs genom att fotografera plattorna och sedan räkna kolonierna med hjälp av automatiserad programvara, som beskrivs nedan. Om plattorna förvarades vid 4 °C, låt dem först nå rumstemperatur så att det inte blir någon kondens på plattorna, vilket ger bländning.
- Organisera plattorna i en logisk sekvens och håll dem i den ordningen medan du fotograferar - det gör det lättare att namnge filerna. Orientera alla plattor så att A1 är i det övre vänstra hörnet för alla plattor. Det rekommenderas att märka A1-hörnet med ett unikt ID för att säkerställa ingen blandning av bilderna. Stapla varje utspädningsserie i ordning.
- Ta bort plattlocket och placera plattan på scenen med A1 orienterad i rätt hörn. Design ingår för plattans fotolåda (Supplemental File 1, Supplemental File 2), som är optimerad för fotografering av dessa brickplattor och innehåller belysnings- och filteralternativ för att avbilda fluorescerande kolonier.
- Avbilda plattorna. Använd kameran (se Materialförteckning) med manuella inställningar för att uppnå en jämn exponeringsnivå mellan plattorna. En inställning för lång brännvidd rekommenderas för att minimera perspektivförvrängning. Ta fotot med en fjärrslutare för att minimera oskärpa från kameraskakningar.
- Överför bilderna till en dator och byt namn på dem, inklusive experimentnamnet, typen av media, utspädningsfaktorn och andra relevanta detaljer. Vissa operativsystem (se Materialförteckning) har en användbar batchbytesfunktion i Finder genom att högerklicka på ett urval av filer.
5. Automatiserad koloniräkning med hjälp av Count-On-It-sviten (tilläggsfil 3)
- Beskär bilderna med det medföljande Croptacular plugin (Supplemental Coding File 2) för ImageJ. Detta plugin hjälper till att dela upp bilden i en ordnad uppsättning underregioner (t.ex. 8 x 12 för en 96-brunnsplatta). Delregionerna kommer att räknas individuellt.
OBS: Ett separat plugin för att räkna cirkulära plattor som heter Circus beskrivs i Supplemental Coding File 3 Circus_.ijm.- Organisera bilderna som ska bearbetas för kvantifiering i en mapp. Välj filnamn som särskiljer plåtarna, eftersom dessa filnamn blir kolumnrubriker för varje uppsättning räkningar . I den här mappen skapar du undermappar med namnet "beskurna" och "kvitton" .
- Starta Croptacular och klicka på OK för att börja beskära.
Standardinställningarna visas och är vanligtvis tillräckliga. Beroende på bildens upplösning, belysningen, spotstorleken etc. kan det vara bra att justera basparametrarna. - Om bilden redan är rak trycker du bara på Mellanslag. Annars rätar du ut bilden genom att rita en linje längs en kant som ska bli horisontell. Rita om linjen så många gånger som behövs om bilden fortfarande inte verkar rätad.
- Rita sedan en gränsruta för det område som räkningen ska göras för. Justera storlek och proportion tills alla fläckar finns i sina celler. Dra markören utanför gränsrutan för att uppdatera rutnätet. När rutnätet ser bra ut trycker du på Mellanslag.
- Se till att nästa bild automatiskt roterar till samma vinkel som den första; Plugin förutsätter att alla foton är inriktade på samma sätt. Om detta är korrekt trycker du på Mellanslag för att fortsätta. Annars räta ut bilden som tidigare. Rutnätet påminner också om samma position som föregående bild; justera om det behövs och tryck sedan på Mellanslag.
- Räkna upp kolonierna på plattorna med hjälp av det medföljande Count-On-It: Gridiron-plugin för ImageJ (Supplemental Coding File 4). Detaljerade instruktioner för installation och användning av plugin-programmet ingår i tilläggsfil 3.
- Starta Count-On-It > Gridiron. Använd samma rutnätsinställningar som med Croptacular. Användare kan gruppera en hel mapp, analysera en enskild bild eller börja från den aktuella bilden.
- Ange tröskelvärdet baserat på ett övre och ett lägre pixelintensitetsvärde. Gör tröskeln så strikt som möjligt samtidigt som du väljer alla kolonier. Helst kommer det att finnas lite utrymme mellan de valda kolonierna, men programvaran kan segmentera blobarna till en viss grad. Klicka på OK i dialogrutan "Åtgärd krävs" när tröskeln är tillfredsställande .
- Om du vill inspektera resultaten zoomar du in och tittar närmare på antalet kolonier. Om du klickar på Avbryt avbryts plugin-programmet. Klicka på OK för att fortsätta.
- På den första bilden, se till att alternativet ges för att fortsätta eller återgå till inställningsmenyn, till exempel för att ändra minsta kolonistorlek. Om du vill fortsätta med batchprocessen klickar du på OK. Välj sedan en mapp för att behålla kvitton och resultattabellen. Använd mappen "kvitton" eller skapa en ny mapp.
- Efter den första bilden kommer nästa bilder som standard att vara samma tröskel som de tidigare inställningarna. Klicka på OK för att använda dessa inställningar eller justera inställningarna. Om bilderna är konsekventa och inställningen är korrekt klickar du på OK i dialogrutan "Åtgärd krävs".
OBS: När alla bilder i batchen är klara sparas resultattabellen automatiskt i samma mapp som kvitton. - Granska antalet kvitton som produceras av programvaran och korrigera eventuella räknefel manuellt. ImageJ-plugin-programmet är statistiskt korrekt, men fel uppstår. Bevisa kvitton för att undersöka avvikande värden och identifiera felräkningar. Programvaran sparar CFU-data som en .csv fil i samma mapp som kvitton.
- Analysera data med hjälp av den användarpreferensprogramvara.
Representative Results
Uppräkning av CFUs i hundratals enskilda flugor i 96-brunnsplåtformat med hjälp av koloniseringsanalys
För att förstå sammansättningen av många enskilda flugmikrobiomer mättes CFU: er med hjälp av det medföljande protokollet, vilket möjliggjorde identifiering av de närvarande arterna, andelen flugor som koloniserades och det absoluta överflödet av bakterier i varje fluga. Orsakerna till den stora observerade individuella-till-individuella variationen i mikrobiomkompositionen är dåligt förstådda, och kvantifiering av den statistiska fördelningen av kolonisering kan hjälpa till att studera denna variation36,37. För att erhålla ett betydande antal biologiska replikat utvecklades en pipeline med hög genomströmning för kvantifiering av mikrobförekomst hos många enskilda flugor med hjälp av CFU-räkningar (figur 1A).
Den slutliga kvantifieringen av CFUs kan påverkas av hur flugor hanteras före analys, till exempel faktorer som ytsterilisering, tid sedan konsumtion av bakterier och clearance av övergående bakterier från tarmen. För det första, med fokus på Drosophila commensal bakterieart L. plantarum (Lp; se Lp stam WF i Obadia et al.36), matades flugor en dos av ~ 105 CFUs av Lp och hölls i grupper om 25 flugor per injektionsflaska. Dessa flugor förvarades antingen i samma injektionsflaska i 3 dagar eller överfördes dagligen (överfördes) till färsk, steril mat (figur 1B). Oöverförda flugor tvättades sedan antingen i etanol för att avlägsna ytbakterier (tvättade) eller inte tvättade (otvättade). Tvättning gav en icke-signifikant minskning av de totala CFU: erna som uppmättes (figur 1B), vilket indikerar att under dessa mycket kontrollerade inokuleringsförhållanden blir flugytan inte signifikant koloniserad av bakterier på 3 dagar. De andra grupperna av flugor överfördes varje dag för att minska ackumuleringen av bakterier från tillväxt på mat (Överförd); Dessutom överfördes en grupp till färsk mat i 4 timmar före provtagning (postöverförd), eller de sattes i injektionsflaskor med endast sterilt agarvatten i 4 timmar (rensat) för att tillåta övergående intagna mikrober att rensa från tarmen. Vart och ett av dessa steg för att ge strängare koloniseringsmätning gav en statistiskt signifikant minskning av överflödet av CFUs i flugorna, med undantag för yttvätt i etanol. Överföring till sterilt livsmedel (postöverfört) eller agarvatten (rensat) i 4 timmar före mätning gav oskiljbara effekter, vilket indikerar att överföring till sterila förhållanden 4 h före mätning minskar bakteriebelastningen. Detta resultat överensstämmer med tolkningen att vissa tarmbakterier i flugtarmen är övergående, medan andra är mer stabilt associerade35. Överflödet av Lp varierade från 1 x 10 4,3 CFUs/fluga i rensade flugor till 1 x 104,9 CFUs i de otvättade flugorna (n = 724 flugor).
Därefter genomfördes samma analys med Acetobacter indonesiensis (Ai), en gramnegativ bakterie som koloniserar flugtarmen (figur 1C; se stam Ai SB003 i Obadia et al.36). Som med Lp-koloniserade flugor gav ytsterilisering en icke-signifikant minskning av CFU: er. På samma sätt minskade daglig överföring till steril mat signifikant bakteriebelastningen och överföring till sterila förhållanden i 4 timmar före homogenisering gav en ytterligare minskning av bakteriebelastningen. Mängden Ai varierade från 1 x 104,7 CFUs/fluga i rensade flugor till 1 x 105,0 CFUs i de otvättade flugorna (n = 528 flugor). Således beror exakt kvantifiering av tarmbakterier på överföringsfrekvensen, inklusive på överföringsdagen. Att avlägsna den yttre bakteriebelastningen genom tvättning i etanol hade en icke-signifikant effekt, men mer signifikanta effekter kan observeras för olika bakteriestammar eller olika odlingsförhållanden. Dessa faktorer bör kontrolleras experimentellt.
Den potentiella effekten av homogeniseringsmetoden på CFU-räkningar testades också. Flugorna homogeniserades med hjälp av en pärlvisp med 0,5 μm glaspärlor i 100 μL PBS, vilket kunde minska livskraften hos bakterieceller. Först framställdes en suspension av Lp-bakterier från odling i PBS och pläterades sedan för att räkna CFUs som en positiv kontroll. Samma kultur placerades i pärlvispplattan och (i) homogeniserades med pärlor, (ii) homogeniserades med pärlor och en bakteriefri fluga, eller (iii) homogeniserades i PBS utan pärlor (figur 1D). Homogenisering i pärlor när en fluga var närvarande påverkade inte signifikant överflödet av livskraftiga celler i lösning, medan homogeniseringen av bakterier i frånvaro av en fluga dödade ett betydande antal bakterieceller. Homogenisering i PBS utan pärlor minskade också signifikant antalet livskraftiga celler. På liknande sätt bevarades Ai-livskraften när den homogeniserades i närvaro av en fluga, medan homogenisering utan fluga minskade antalet livskraftiga celler i lösning (figur 1E). Dessa resultat indikerar att flugvävnaden skyddar bakterierna från att förstöras av pärlorna under homogenisering. Experimenten i figur 1D och figur 1E utfördes dock med mer än 108 CFU per brunn. I praktiken visade sig brunnar med ~ 106 celler per brunn eller mindre visa liten cellförlust när pärlor användes utan fluga. Kylning av plattan på is halvvägs genom pärlslag förbättrar också cellviabiliteten. Betydelsen av dessa resultat är att läsarna bör vara medvetna om dessa potentiella problem och utforma lämpliga kontroller för deras specifika användningsfall.
Noggrannhet för punktplätering av 96-brunnsplattor för CFU-kvantifiering med hög genomströmning
Eftersom målet är att mäta CFU-förekomsterna för hundratals till tusentals enskilda flugor är traditionella spridningspläteringsmetoder oöverkomligt tids- och materialintensiva. Punktplätering är en effektiv och ändamålsenlig metod för CFU-tillväxt och uppräkning 19,31. Punktpläteringsmetoden använder en 96-kanals pipettor för att dosera 2 μL bakteriesuspension på medier som framställts i rektangulära trågplattor (figur 2A). Varje fläck representerar bakteriebelastningen för ett enda prov, så 96 flugor kan analyseras med en enda platta (figur 2B). Noggrannheten hos punktplätering jämfördes med traditionell plätering genom ympning av tillväxtplattor med exakt samma 0,0001 OD-suspension av Lp för båda metoderna. Suspensionen var tvåfaldig serieutspädd fem gånger i PBS. Som en head-to-head-jämförelse spreds 50 μL av inokulum på enskilda runda plattor, eller 2 μL fläckar gjordes på rektangulära MRS-plattor. Plattorna inkuberades sedan vid 30 °C tills kolonierna var räknebara. De resulterande CFU-värdena för varje utspädning användes för att beräkna suspensionens ursprungliga koncentration och jämfördes (figur 2C). Runda plattor med 50-500 CFUs räknades som kontroll. Ingen signifikant skillnad observerades mellan högkapacitetsmetoden och traditionella rundpläteringsmetoder.
Eftersom tätheten av kolonier kan påverka deras tillväxt och kvantifiering testades effekten av CFU-densitet på slutliga räkningar. Fläckar med 2 till 25 kolonier per plats visade ingen skillnad i sluträkning jämfört med den traditionella rundplåtsmetoden (figur 2C). Fläckar med i genomsnitt 35 kolonier gav resultat som skev något lägre än kontrollspridningsplattorna (figur 2C; p = 0,0017). Noggrann undersökning av fotografierna av enskilda fläckar indikerade att denna skevhet berodde på att kolonier överlappade varandra i täta fläckar. Mätningar baserade på fläckar med i genomsnitt 11 kolonier per plats resulterade i koncentrationer närmast de som baserades på spridningsplattorna (figur 2C; Spridningsplattor: medelvärde = 1 x 104,4 CFU; SD = 0,086 jämfört med fläckar med 11 genomsnittliga kolonier: medelvärde = 1 x 104,4 CFU; SD = 0,12, p = 0,42, Welchs t-test).
Generera högkvalitativa bilder för kvantifiering med hjälp av en specialiserad fotograferingsplattform med antingen vitt ljus eller fluorescens
Punktplätering med hög genomströmning genererar naturligtvis ett stort antal målområden, som måste räknas exakt. Kvalitetsfotografier kan användas för att dokumentera data och för att underlätta räkningen av CFUs. En robust och enkel fotograferingsplattform utvecklades med hjälp av kommersiellt tillgängliga material (figur 3A). En digitalkamera fästes på ett fäste ovanpå en specialkonstruerad ljuslåda, kallad FluoroBox, och riktades direkt nedåt, vinkelrätt mot mitten av plattan. Ett färgat emissionsfilter placerades valfritt framför linsen med hjälp av en filterreglage. En ljussköld förhindrade linsflare genom att blockera direkt ljus från LED-remsorna nedan. LED-remsor upplyste plattan från sidorna, snarare än ovan, för att förhindra bländning på plattan. Förutom vitt ljus användes enfärgade blå och gröna lysdioder för att excitera gröna respektive röda fluorescerande proteiner. Plattan hölls på plats av en tallrikshållare på lådan, och lådan var utrustad med lådreglage för att göra det enkelt att sätta in plattan. Kompletta mönster finns i tilläggsfil 1 och tilläggsfil 2.
Ett foto av en spotplatta av Lp-kolonier togs med hjälp av lysdioder med vitt ljus och en digitalkamera för att hjälpa till att räkna kolonier och skilja olika färger och morfologier (figur 3B). För att validera att ljusintensiteten var jämn mättes agarens bakgrundsintensitet över olika regioner på ett plattfotografi (figur 3C). För att visa att kolonierna tydligt kan särskiljas från bakgrunden mättes intensiteten över diametern på 10 olika kolonier på olika delar av plattan och befanns vara ungefär ~ 300% högre än bakgrunden (figur 3C). Plattan inokulerades med Lp med en mCherry fluorescerande proteinuttryckande plasmid, liksom en del Lp som inte innehöll plasmiden, så kolonierna var antingen mCherry-positiva eller mCherry-negativa. För att skilja dessa två typer av kolonier fotograferades plattan med samma kamera med grönt LED-ljus (515-525 nm) och ett rött filter (Tiffen #29), vilket fick mCherry-positiva kolonier att fluorescera (figur 3D). Skillnaden i intensitet mellan mCherry-positiv och mCherry-negativ kvantifierades genom att mäta intensiteten över ett urval av kolonier (n = 10 kolonier). mCherry-positiva kolonier var ~1 000% högre intensitet än mCherry-negativa (figur 3E). Kolonier av Ai som uttrycker GFP och kolonier av Ai som inte uttrycker någon fluorescens fotograferades med blå LED-lampor (465-475 nm) och ett grönt filter (Tiffen #58) (Figur 3F). GFP-positiva kolonier visade 200 % högre intensitet än GFP-negativa (figur 3G).
Automatisk räkning av CFU:er på spotplattor med hjälp av det anpassade ImageJ-plugin-programmet Count-On-It
Foton ensam hjälper till att räkna kolonier (t.ex. genom att lagra data, dela data, zooma in, markera ett överlägg, separera färger etc.). Handlingen att manuellt räkna och organisera resultaten av hundratals fläckar kan dock vara tråkig, tidskrävande och benägen för skillnader mellan människor i slutliga räkningar. För att påskynda räkningsprocessen och standardisera reproducerbarheten av räkningar utvecklades ett specialiserat ImageJ-plugin-program som heter Count-On-It (Figur 4A). Denna plug-in möjliggör exakt halvautomatisk räkning av CFUs på agarplattor. Användaren förbereder bilder för att räkna genom att först beskära och räta ut dem med hjälp av det extra plugin-programmet Croptacular. Bilderna kan valfritt bearbetas och tröskeln kan justeras för varje platta. Flera andra alternativ låter användaren öka noggrannheten i platträkningen, inklusive justering av ljusvåglängderna (RGB-bilder), inställning av ett intervall av kolonistorlek (i pixlar), ändring av det maximala bildförhållandet och anpassning av dimensionerna för det aktiva markeringsnätet. Count-On-It matar ut en tabell med resultat där varje platta representeras som en kolumn med CFU-antal. Det genererar också ett fotokvitto som visar ett överlägg för att visuellt dokumentera dess räkningsresultat och hjälpa till med manuell felkorrigering (figur 4B). Även om fel uppstår, när antalet kolonier som räknades manuellt jämfördes med antalet kolonier som räknades med hjälp av detta plugin-program (figur 4C), var förhållandet i allmänhet ekvivalent, med linjär regression mellan de manuella och automatiserade räkningarna som visade en lutning på 0,95 med över 90% noggrannhet (R2 = 0,93), även om felet ökade när antalet kolonier översteg 20.
Count-On-It kan också användas för att separat räkna fluorescerande kolonier med hjälp av fluorescensfunktionen i FluoroBox. mCherry-positiva koloniantal (figur 4D) efter programvaruplugin kontra manuell hade en R2 på 0,92 (figur 4E). På samma sätt hade GFP-positiva kolonier (figur 4F) räknade med programvaruplugin jämfört med manuell en R2 på 0,90 (figur 4G). Fluorescerande kontra icke-fluorescerande kolonier kan särskiljas inom ett enda prov, och kolonistorlek och form kan dessutom användas för att skilja separata delpopulationer (figur 4H-K). Fotokvittona ger en post som gör det möjligt för användaren att snabbt kontrollera noggrannheten i räkningarna och manuellt korrigera fel. I figur 4C, E, G, I, K har fotokvitton inte använts för att förbättra räkningsnoggrannheten så att läsarna kan se metodens råa utdata. Fall som i figur 4G, där ett manuellt antal på 1 gav ett automatiserat antal 21, kan snabbt upptäckas med hjälp av fotokvitton. I det här fallet skapade bländning på kanten av plattan blobbar som räknades som kolonier. För varje användningsfall måste de optimala inställningarna för programvaruplugin-programmet bestämmas innan högt dataflöde räknas.
Figur 1: Koloniseringsanalysen mäter CFUs i hundratals enskilda flugor med ett 96-brunnsplattformat. (A) Bildöversikt över koloniseringsanalysen och kvantifieringsmetoden med hög genomströmning som används enligt beskrivningen i protokollavsnittet. (B) Lactiplantibacillus plantarum (Lp) förekomst hos flugor efter koloniseringsanalysen mättes under varierande förhållanden med hjälp av CFU-kvantifieringsmetoden med hög genomströmning. Flugor förvarades i samma injektionsflaska i 3 dagar och homogeniserades och pläterades sedan (otvättad), tvättades i etanol före plätering (tvättades), tvättades och överfördes varje dag (överfördes), överfördes dagligen och förvarades sedan på steril mat före plätering (postöverförd) eller förvarades i injektionsflaskor med endast vatten i 4 timmar (rensad) (n = 724 flugor totalt, 3 biologiska replikat och ~ 72 flugor totalt per behandling). (C) Samma analys som i (B) utfördes med Acetobacter indonesiensis (Ai) (n = 528 flugor). (D) Lp bakteriell suspension bereddes i PBS och pläterades sedan för att räkna CFUs eller homogeniserades först genom pärlslagning, pärlslagen i kombination med en bakteriefri (GF) fluga eller skakades på pärlvisparen utan pärlor eller en fluga (n = 236 provbrunnar). (E) Ai-viabiliteten efter homogenisering testades på samma sätt som i (D) (n = 282 provbrunnar). Statistisk signifikans för paneler (B-E) beräknades med hjälp av ett Kruskal-Wallis-test följt av parvis Wilcoxon-rank-sum-tester med Bonferronis korrigering av flera jämförelser. Box ger interkvartilintervall. Linje indikerar median. Whiskers ger totalt intervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Noggrannhet för punktplätering av 96-brunnsplattor för CFU-kvantifiering med hög genomströmning. A) Punktplätering med hjälp av en 96-kanals pipettor för att dosera 2 μl på medier som beretts i rektangulära trågplattor. (B) MRS-agar tillväxtplatta med 96 fläckar av Lp-kolonier . (C) Koncentration av Lp-suspension baserad på CFU-antal från traditionella runda plattor (n = 24 plattor) jämfört med koncentration baserad på CFU-antal från spotplattor (n = 680 fläckar) seriellt utspädd och ordnad med genomsnittligt koloniantal per plats (~ 48 fläckar för varje enskild utspädningsfaktor för tre replikatplattor räknades). Varje datapunkt representerar de exakta kolonierna per plats, medan varje kolumn representerar de genomsnittliga kolonierna för den utspädningen. Horisontell prickad linje indikerar det beräknade CFU-antalet för den kultur som pläterades. Gröna konturerade punkter markerar de traditionella runda platträkningarna. Rödfyllda punkter markerar den optimala kolonidensiteten på 11 CFUs per 2 μL spot. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av vanlig envägs ANOVA som jämförde medelvärdet av varje kolumn mot medelvärdet av spridningsplattans kontrollkolumn med Bonferronis korrigering av flera jämförelser. Box ger interkvartilintervall. Linje indikerar median. Whiskers ger totalt intervall. **p < 0,01. ns = inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: En fotoplattform producerar kvantifierbara bilder av plattor med vitt ljus eller fluorescens . (A) Översikt över FluoroBox-designen. (B) Foto av en fläckplatta av Lp-kolonier med vitt ljus. (C) Intensitetsprofil för enskilda kolonier under vitt ljus jämfört med bakgrundsintensiteten (BKG) (n = 10 kolonier, streckad linje representerar standardavvikelse). (D) Foto av samma dekorplatta som i (B), med enfärgade gröna lampor och det röda filtret för att välja för mCherry-positiva Lp-kolonier . (E) Intensitetsprofil för enskilda kolonier som illustrerar skillnaden mellan kolonier med och utan mCherry-utsläpp. (F) Foto av en punktplatta som innehåller Ai-kolonier, varav några har en GFP-etikett . G) Intensitetsprofil för enskilda kolonier som illustrerar skillnaden mellan GFP-negativa och GFP-positiva kolonier. E, F, G: n = 10 kolonier för varje tomt. Kolonidiametrar är ca 1,5 mm. Streckad linje är SD. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Noggrann räkning av dekorplattor med plugin-programmet Count-On-It ImageJ. (A) Skärmdump av installationsfönstret för plugin-programmet. (B) Plugin-programmet genererar ett kvitto för dokumenträkning och hjälper till med felkorrigering. Insats: Överlägg med antalet kolonier som räknas för varje spotregion; Den gula konturen indikerar att en enda koloni räknades och röd att flera kolonier räknades. (C) Diagram som visar antalet kolonier som räknas manuellt jämfört med antalet kolonier som räknats med hjälp av plug-in (automatiserad) när en bild av vitt ljus användes, där varje punkt i diagrammet representerar en enda fläck som räknas manuellt eller automatiskt (lutning av passform = 0,95, cyanlinje; 1:1-linjen är prickad röd; R2 = 0,93, Pearsons korrelationskoefficient, p < 0,0001). (D) Fotokvittobild från plugin-programmet när mCherry-positiva kolonier valdes med hjälp av fluorescensfunktionen i fotorutan. (E) Diagram som visar antalet mCherry-positiva kolonier som räknats med manuell jämfört med automatiserad metod när röd fluorescens användes (lutning av passform = 1,1, cyanlinje; 1:1-linjen är prickad röd; R2 = 0,92, Pearsons korrelationskoefficient, p < 0,0001). Observera att extremvärden och fel inte har korrigerats med hjälp av analyskvittona för E,G,I,K. (F) Fotokvittobild från plugin-programmet när GFP-positiva kolonier valdes med hjälp av den gröna fluorescensfunktionen i fotorutan och val av den gröna kanalen med plugin-programmet. G) Diagram som visar antalet GFP-positiva kolonier som räknats med manuell jämfört med automatiserad metod när grön fluorescensbelysning användes (lutning av passform = 1,1, cyanlinje; 1:1-linjen är prickad röd; R2 = 0,90, Pearson-korrelationskoefficient, p < 0,0001). (H) mCherry-positiva kolonier utvalda från blandade kolonimorfologier med användning av en hög fluorescenströskel i plug-in-programmet. (I) Diagram som visar antalet mCherry-positiva kolonier som räknats med manuell jämfört med automatiserad metod när röd fluorescensbelysning användes (lutning av passform = 0,99; R2 = 0,91, Pearsons korrelationskoefficient, p < 0,0001). (J) mCherry-negativa kolonier utvalda från blandade kolonimorfologier med användning av en låg fluorescenströskel. K) Diagram som visar antalet mCherry-negativa kolonier som räknats med manuell jämfört med automatiserad metod när intensitetströskeln sattes för att välja icke-fluorescerande kolonier (lutning av passform = 1,1; R2 = 0,85, Pearsons korrelationskoefficient, p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 1: Monteringsanvisningar för FluoroBox. Den här filen leder läsaren steg för steg genom konstruktionen av den kontrollerade belysningsboxen som används i videon. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: FluoroBox akryllaserskärning. Den här filen tillhandahåller en klippmall för att laserskära akrylbitarna för den kontrollerade belysningslådan. Filen kan skickas till en laserskuren akrylleverantör. Se materialförteckningen för leverantören som används i detta protokoll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Programvaruinstruktioner. Den här filen leder läsaren steg för steg genom installationen och användningen av Croptacular och Count-On-It-programvaran som medföljer detta protokoll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: 3D-utskriftskod för pärlmätningsbricka (S1-bead-measurer.stl). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: Rektangulär platta foto cropper ImageJ plugin (Croptacular_.ijm). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 3: Plugin för rundplåtsfotobeskärare (Circus_.ijm). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 4: Rektangulär platta 96 spot counter plugin (Gridiron_.ijm). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
De detaljerade teknikerna som presenteras här möjliggör en >100-faldig ökning av antalet prover som kan utvärderas i ett CFU-räkningsexperiment. Denna teknik utvecklar befintliga metoder för mikrobiomexperiment i Drosophila 12,35,36 genom att använda 96-brunnsplattformatet för att analysera enskilda flugor. Dessutom tillämpar den en effektivare punktpläteringsmetod19,31 och ett automatiserat arbetsflöde med en fotograferings- och koloniräkningsplattform. Betydelsen av denna metod för Drosophila är att standardisera experiment till 96-brunnsplattformatet, vilket möjliggör samtidig hantering av ett stort antal biologiska replikat med automatisering för att uppnå kvantifiering av CFUs med hög genomströmning.
96-brunnsplattformen visar att ökad överföringsfrekvens och "clearing" av övergående bakterier orsakar en signifikant minskning av både medelmängden och variationen mellan prover (figur 1B,C), vilket visar strängheten i detta förbättrade protokoll. En begränsning av co-housing flugor är den horisontella överföringen av bakterier mellan flugor. En föreslagen lösning är att hålla flugor individuellt i ett 96-brunnsplattformat, till exempel Whole Animal Feeding Flat38.
Även om en signifikant minskning av bakteriebelastningen inte observerades när flugor tvättades i etanol, hade dessa flugor endast hållits i närvaro av externa bakterier i 3 dagar. Bostäder under längre tidsperioder kan tillåta en större bakteriebelastning att ackumuleras39. Därför rekommenderas fortfarande tvätt i etanol.
Överföring av flugor till 96-brunnsplattan är det kritiska första steget för att konfigurera arbetsflödet (figur 1A). När flugorna har tvättats fördelas de i brunnarna en i taget. Ett plattdiagram är användbart i detta skede för att notera vilka förhållanden som finns i varje brunn och lägga till eventuella anteckningar som "fluga förlorades". Homogenisering är ett annat kritiskt steg med några viktiga försiktighetsåtgärder. Bakterier överlever homogeniseringsprocessen när de är i närvaro av en fluga (figur 1D,E), och förmodligen är denna princip också sann när bakterierna är inne i flugans tarm. Men bakterier dödas också när de homogeniseras enbart i pärlplattor, vilket visar att homogeniseringen kan döda bakteriecellerna under vissa omständigheter, en begränsning som kan vara viktig om man till exempel homogeniserar dissekerade tarmar. I synnerhet är förlusten av CFUs vid homogenisering beroende av antalet CFUs i provet, och förlusten är minimal när ~ 105 CFUs per brunn används. Ytterligare bevarande av CFUs kan uppnås genom att stoppa homogeniseringen halvvägs och kyla plattan på is.
Homogenisering utfördes i 5 minuter i detta protokoll baserat på kontrollexperiment där ett känt antal CFUs blandades med en bakteriefri fluga, och detta fungerade empiriskt för flugbakterier. Mindre slag orsakade att större flugdelar var närvarande, vilket stör pipettering, medan betydligt längre homogeniseringstider på ~ 10 min gjorde att CFU räknades mer variabelt. Den mindre volymen och vinklade formen av koniska plattbrunnar observerades för att minska effektiviteten hos pärlslag jämfört med cylindriska 2 ml rör. Många variationer på detta allmänna tillvägagångssätt är möjliga, inklusive vilka bakteriestammar, vilken pärlslagande behållare, vilka pärlor och vilken fluggenotyp som används. Enskilda användarfall måste använda positiva kontroller för att fastställa sin metod.
Punktpläteringsmetoden användes på ett specifikt sätt: 1:2 utspädningar av L. plantarum WF i PBS upptäcktes på MRS-plattor och inkuberades vid 30 °C i 2 dagar (kortare inkubationstider kan implementeras för att generera mindre kolonistorlekar). Metoden kräver en viss investering i utrustning, främst pärlvisparen och 96-kanals pipettor (figur 2A), vilket är nödvändigt för både utspädningsserien och punktplätering. Det finns dock billigare alternativ, inklusive en 96-brunns plattreplikator med slitsade stift. Utspädningsserien är ett kritiskt steg som påverkar noggrannheten i CFU-räkningsresultaten. När det gäller fellägen är det möjligt att täppa till pipettspetsarna med flygdelar eller glaspärlor och att pipettspetsarna inte tätar ordentligt på pipettorn eller misslyckas av någon annan anledning. Alla dessa problem resulterar i underräkning av de drabbade brunnarna och bör övervakas. Tillräcklig blandning vid varje steg i utspädningsserien är också avgörande. Varje utspädning ska blandas noggrant antingen genom att lägga plattan på en tallriksskakare eller genom att pipettera upp och ner 15-20 gånger, vilket också tjänar till att skölja spetsarna. Genom att upptäcka från den mest utspädda till minst utspädda plattan kan spetsarna återanvändas för hela utspädningsserien. Med 1:2 utspädningar är räkningen korrekt över ett intervall av 2-25 kolonier, som spänner över en storleksordning (figur 2C). Därför sparar 1:10 utspädningar tid och material. En annan variabel som kan utnyttjas är inkubationstid, som kan justeras för att producera mindre kolonier och därmed öka utbudet av räknbara fläckar genom att förhindra sammanslagning av intilliggande kolonier.
Ett kvalitetsfoto av plattan är viktigt eftersom det blir de råa källdata från vilka CFU: erna analyseras och kan arkiveras på obestämd tid. FluoroBox är utformad för att producera foton av plattorna med jämn ljusintensitet, vilket minimerar bländning på agarytan. Dessutom, designen kan selektivt fotografera fluorescerande kolonier med enfärgade LED-lampor och färgade fotofilter (figur 3A). Konstruktionen av en installation som FluoroBox, med kontrollerad belysning och kamerainställningar, kan kraftigt öka reproducerbarheten av CFU-bilder, vilket är viktigt för automatiserad analys. Kolonimorfologier, fluorescensintensitet och effekterna av tid eller densitet på kolonitillväxt är bara några av de egenskaper som kan analyseras med hjälp av fotografierna. Fotolådan kan konstrueras utan färgfilter och enfärgade lampor om inga fluorescerande bakterier används, vilket minskar kostnaden och komplexiteten. Olika excitationsljus och emissionsfilter kan ersättas med de som rekommenderas här om en annan fluorofor används av ett laboratorium. En kamera som är ansluten till en surfplatta via WiFi med en app är användbar både för den automatiska slutarfunktionen för att förhindra skakningar och för att underlätta dataöverföring. Bilder kan överföras till surfplattan och sedan till en bärbar dator med trådlös filöverföringsprogramvara. Rekommenderade kameror med dessa funktioner anges i materialförteckningen.
Count-On-It är ett plugin-program skrivet i ImageJ. Den automatiserade CFU-räkningsprogramvaran segmenterar plattbilden i ett enhetligt 96-brunnsnät, räknar kolonierna i varje rutnätscell och batchar resultaten till ett enkelt kalkylblad. Eftersom det alltid finns variationer i spotnätets position på plattan och på fotot måste användaren manuellt anpassa rutnätet till fotot med hjälp av plugin-programmet Croptacular. Detta hjälper också till att utesluta områden nära plattkanten, som har bländning. Att ställa in tröskeln är nyckeln till att få det mest exakta CFU-antalet från bilden. Om tröskeln är för hög kommer kolonierna att gå samman; Om tröskeln är för låg kommer kolonierna att uteslutas. När tröskelvärdet har ställts in tillämpar makrot gaussisk oskärpa för att mjuka upp kanterna och minska aliasing, vattendelarfiltret delar överlappande kolonier och blobarna räknas med hjälp av analyspartiklar.
Ibland är tätheten av kolonier för hög på en viss plats. Count-On-It ger ett sätt att hantera detta. För att uppskatta antalet kolonier i en rutnätscell med delvis sammanslagna kolonier tas först den genomsnittliga ytan av en cirkulär blob från hela plattan som Cavg. Därefter divideras området för blob A 1 med medelvärdet av en cirkulär blob A1/Cavg. Det här talet avrundas till närmaste heltal och det är uppskattningen för hur många kolonier som finns i en blob. Den här funktionen är en anledning till att tröskelvärdet kan påverka räkningsresultaten: det relativa genomsnittliga koloniområdet jämfört med ett sammanfogat blobområde kommer att vara olika beroende på hur tröskelvärdet påverkade sammanslagna blobar.
De metoder som presenteras har flera begränsningar. Dessa inkluderar behovet av utrustning för att dispensera flytande media exakt från 96-brunnsplattor. Denna utrustning, antingen en 96-kanals pipettor eller ett slitsat replikatorstiftverktyg, kan kosta tusentals dollar att få. Billigare alternativ finns men är mindre exakta. Automatiserad räkning via Count-On-It ger också vissa begränsningar. Om till exempel två kolonityper i en blandad population avgränsades baserat på enbart storlek, skulle blobräkning inte kunna tilldela kolonier till rätt typ. I det här fallet måste fläckar med blobbar elimineras från räkningar. Ytterligare differentiering av kolonier baserat på morfologi skulle vara en värdefull förlängning av den metod som för närvarande inte implementeras. Användningen av selektiva medier inklusive stamspecifika näringsämnen och antibiotika förenklar behovet av komplex bildanalys.
Att upprätthålla fruktflugeexperiment i 96-brunnsplattor multiplicerar antalet prover och förhållanden som kan testas i ett enda experiment och kan underlätta skärmar med hög genomströmning i Drosophila-bakterieföreningsfenotyper. Vi föreställer oss att denna metod kan utökas genom att använda selektiva medier för att differentiera många bakteriestammar i komplexa blandningar. Metoden är inte begränsad till studien av flugmikrobiomet. Kvantifiering av CFUs är vanligt i många tillämpningar av mikrobiologi, från koliforma räkningar i dricksvatten till identifiering av patogener. CFU-pläteringssystemet som presenteras här möjliggör skärmar med hög genomströmning, samt automatiserad insamling, bearbetning, lagring och leverans av resultat.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Dr. Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper och medlemmar av Ludington-labbet gav värdefull input om utvecklingen av detta protokoll. Finansiering tillhandahölls av NSF IOS-bidrag 2032985, NIH-bidrag DP5OD017851, ett Carnegie Institution of Canada-bidrag och Carnegie Institute for Science's Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bead beating and spot plating | |||
| Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
| Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
| Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
| Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
| Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
| Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
| MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
| Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
| TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
| Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
| Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
| Photobox construction | |||
| ¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
| ¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
| ¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
| 1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 18 Gauge Wire - Two Conductor Power Wire - 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
| 22-10 AWG Red Wire Nut - WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
| 22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector - 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
| 4" Solderless Clamp-On Jumper Connector - 8mm Single Color LED Strip Lights - Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
| 4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor - 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
| 6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
| 6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
| 8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| 8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
| Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
| Black Cable Ties - 10 Pack - 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
| Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
| Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Blue - 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
| Custom Length Single Color LED Strip Light - Eco Series Tape Light - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
| Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
| Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
| Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
| Mean Well LED Switching Power Supply - LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply - 24V DC - 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
| Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
| Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
| Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
| Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases - 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
| SPST Round Rocker Switch - No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
| Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
| Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
| Software | |||
| ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
| MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
| Unix | BSD | N/A | 64 bit |
| Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |
References
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota. Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).
- Taur, Y., et al. Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research. Nature Communications. 12 (1), 6740 (2021).
- D'hoe, K., et al. Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community. eLife. 7, 2892 (2018).
- Ludington, W. B., Ja, W. W. Drosophila as a model for the gut microbiome. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398 (2020).
- Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system. PLoS Genetics. 7 (9), 1002272 (2011).
- Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria. PLoS Biology. 16 (7), 2005710 (2018).
- Adair, K. L., et al. Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies. The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).
- Koyle, M. L., et al. Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions. Journal of Visualized Experiments. (113), e54219 (2016).
- Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease. Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).
- Grenier, T., Leulier, F. How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster. Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).
- Broderick, N. A., Lemaitre, B.
- Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
- Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle. Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).
- Ryu, J. -H., et al. Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science. 319 (5864), 777-782 (2008).
- Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. A simple and fast method for determining colony forming units. Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).
- Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
- Newell, P. D., Douglas, A. E. Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster. Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (1), 6 (2014).
- Vega, N. M., Ludington, W. B. From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory. Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).
- Sundarraman, D., et al. Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome. mBio. 11 (5), 1-15 (2020).
- Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).
- Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms. Nature Ecology & Evolution. 1, 0109 (2017).
- Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. Spiral plate method for bacterial determination. Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).
- Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples. Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).
- Nuñez, I., et al. Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering. PLoS One. 12 (11), 0187163 (2017).
- Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit. Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).
- Dodge, R., et al. A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota. bioRxiv. , (2021).
- Obadia, B., et al. Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability. Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).
- Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLoS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
- Jaime, M., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
- Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off. Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).
