Denna metod kvantifierar mikrobiell överflöd med hjälp av ett 96-brunnsplattformat till plattkolonibildande enheter (CFU) och appliceras på Drosophila-mikrobiomet i hela flughomogenatprover. CFUs räknas med en automatiserad bildanalysprogramvara som tillhandahålls här.
Tarmarna hos djur koloniseras av kommensala mikrober, som påverkar värdens utveckling, hälsa och beteende. Exakt kvantifiering av kolonisering är avgörande för att studera de komplexa interaktionerna mellan värd och mikrob både för att validera den mikrobiella sammansättningen och studera dess effekter. Drosophila melanogaster, som har en låg inhemsk mikrobiell mångfald och är ekonomisk att föda upp med definierad mikrobiell sammansättning, har framstått som en modellorganism för att studera tarmmikrobiomet. Analys av mikrobiomet hos en enskild organism kräver identifiering av vilka mikrobiella arter som är närvarande och kvantifiering av deras absoluta överflöd. Denna artikel presenterar en metod för analys av ett stort antal enskilda flugmikrobiomer. Flugorna är beredda i 96-brunnsplattor, vilket möjliggör hantering av ett stort antal prover samtidigt. Mikrobiellt överflöd kvantifieras genom plätering av upp till 96 hela flughomogenater på en enda agarplatta i en rad fläckar och sedan räkna de kolonibildande enheterna (CFU) som växer på varje plats. Detta pläteringssystem är parat med en automatiserad CFU-kvantifieringsplattform, som innehåller fotografering av plattorna, differentiering av fluorescerande kolonier och automatiserad räkning av kolonierna med hjälp av ett ImageJ-plugin. Fördelarna är att (i) denna metod är tillräckligt känslig för att upptäcka skillnader mellan behandlingar, (ii) punktpläteringsmetoden är lika exakt som traditionella pläteringsmetoder, och (iii) den automatiska räkningsprocessen är korrekt och snabbare än manuell räkning. Arbetsflödet som presenteras här möjliggör kvantifiering av CFUs med hög genomströmning i ett stort antal replikat och kan tillämpas på andra mikrobiologiska studiesystem inklusive in vitro – och andra smådjursmodeller.
Förhållandet mellan tarmmikrobiota och deras djurvärd ligger alltmer i framkant av biologiska studier1, som visar att mikrobiomets stamsammansättning är viktig för värdfysiologin 2,3,4. Upptäcktstakten har begränsats av förvirrande faktorer som hög naturlig interindividuell variation och hög mångfald av koloniserande bakterier 5,6,7. Bananflugan, Drosophila melanogaster, har framstått som en lovande modell på grund av dess naturligt lågdiversitetsmikrobiom, enkel hantering och robusta värdgenetik 8,9,10,11. Flugor kan göras bakteriefria och återförknippas med en definierad mikrobiota12, och det har visat sig att floran påverkar flugfysiologiska egenskaper13,14. Den medfödda floran består av en begränsad uppsättning bakterier som alla är odlingsbara, och nära släktingar till dessa är också endogena till däggdjurets tarm, inklusive Lactobacilli, Proteobacteria och Enterococci15.
Att studera mikrobiomets inflytande på värdegenskaper kräver kvantifiering av mikrobiomet när det gäller både vilka arter som är närvarande och deras absoluta överflöd16. De dominerande sätten att analysera flugmikrobiomet är kolonibildande enhet (CFU) räknar17, 16S rRNA -genampliconsekvensering9 och qPCR för 16S rRNA -genen18. CFU-räkningar kan erhållas utan dyra reagenser, och de bekräftar bakteriecellernas livskraft19. 16S-teknikerna inklusive qPCR har fördelar genom att taxonomiska identiteter hos mikrober kan fastställas utan hänsyn till deras tillväxtbehov eller kolonimorfologier20.
I det fall där experiment använder flugor med ett definierat mikrobiom av kända bakterier (gnotobiotiska flugor) har CFU-räkningar särskilda fördelar jämfört med sekvensering21. Sekvensering är dyrt, vilket kräver DNA-extraktion, PCR-baserad biblioteksberedning och sekvensering med hög genomströmning för att erhålla relativa överflöd22. På grund av den höga kostnaden måste sekvenseringsmetoder med hög genomströmning vanligtvis utföras i bulk för att minska priset per prov23. Ytterligare metoder såsom qPCR krävs för att erhålla absoluta överflöd16. Däremot är CFU-räkningar snabba och billiga och ger det absoluta antalet livskraftiga celler. Drosophila8 och andra små mikrobiommodeller 24, inklusive masken, Caenorhabditis elegans 25,26, och larvzebrafisken, Danio rerio, odlad gnotobiotiskt 27, har ett begränsat antal bakterier, som har kända tillväxtegenskaper 28. I dessa fall, särskilt med gnotobiotiska djur, kan CFU-räkning skilja alla bakteriearter inom tarmsamhällena med flera arter21,27,29. CFU-räkningsmetoder med högre genomströmning skulle ytterligare förbättra kostnadseffektiviteten och hastigheten för att mäta mikrobiomets sammansättning och kan tillämpas på många andra mikrobiologiska experiment.
Att räkna CFUs genom seriell utspädningsplätering av en bakteriesuspension på agarbaserade tillväxtmedier är en standardmetod inom mikrobiologi. Kolonierna som växer på plattorna räknas sedan manuellt. Utspädningarna gör det möjligt för forskaren att välja en densitet av kolonier som är räknbar (t.ex. ~ 100 CFU per platta), vilket innebär att kolonierna inte växer in i varandra och kan räknas inom rimlig tid. De flesta mikrobiologer använder i huvudsak samma CFU-räkningsmetod som utvecklades för 140 år sedan i Robert Kochs laboratorium, och för många applikationer är denna metod fortfarande tillräcklig. Ett problem uppstår emellertid när man försöker kvantifiera ett stort antal prover. Ett enda prov kan kräva plätering av 1 till 10 seriella utspädningar av provet för att erhålla räknbara CFU: er, så experiment med mer än några dussin prover blir beskattande. Olika metoder har utvecklats för att öka effektiviteten i CFU-uppräkningen. Automatiserad spiralplätering eliminerar behovet av seriella utspädningar30, vilket gör endast en platta nödvändig för CFU-räkning men ökar tiden för att plåta provet. Single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) möjliggör CFU-uppskattningar från färre plattor per prov31. Dessa metoder är en förbättring av den traditionella spridningsmetoden men kräver fortfarande hantering och plätering av bakterieprover var för sig och är därför inte idealiska för hög genomströmning. Hantering av prover i 96-brunnsplattor och punktplätering av dessa 96 prover på rektangulära agarplattor förbättrar avsevärt provernas genomströmning19.
Mikrobiomer består vanligtvis av flera stammar och arter. Medan arter ofta kan särskiljas genom kolonimorfologi eller tillväxtmedier, kan fluorescens användas för att ytterligare skilja olika typer av bakterier och deras tillväxtegenskaper32. Till exempel kan olika genotyper av samma art märkas med olika genetiskt kodade fluorescerande proteiner. Plattavbildningsmetoder som innehåller fluorescens gör det möjligt för forskare att dra nytta av dessa genetiska tekniker i CFU-baserade analyser32. Att införliva fluorescens i CFU-räkningsmetoder med hög genomströmning skulle ytterligare förbättra deras användbarhet.
Att räkna CFUs manuellt blir besvärligt när det finns ett stort antal prover. Automatiserad räkning av CFUs kan utföras genom att fotografera plattan och bearbeta bilden med hjälp av specialiserad programvara33. kombinerade den förbättrade pläteringseffektiviteten för punktplätering med automatiserad koloniräkning med konventionell digital fotografering och ImageJ-programvara19.
En metod med hög genomströmning för att screena fenotyperna för specifika mikrob- och värdföreningar skulle hjälpa studier av mikrobiomgemenskapsmontering och påverkan på värdens hälsa och kondition. För studier av Drosophila-mikrobiomet skulle en mikrobiologisk plattform med hög genomströmning innehålla hantering av flygprover i 96-brunnsplattformat, fluglys utan bakteriell lys, effektiviteten av punktplätering, förmågan att använda fluorescens och skilja flera fluoroforer, en kontrollerad ljusmiljö för reproducerbar avbildning av CFU-plattor och en pålitlig automatiserad koloniräkningsprogramvara. Den här artikeln beskriver en metod som är optimerad för analys av CFUs i gnotobiotiska flugor, vilket är enkelt, snabbt och automatiserat. Detta protokoll beskriver ett nytt arbetsflöde som kombinerar det bästa av tidigare publicerade metoder och optimeras för att utforska tarmmikrobiomet i Drosophila.
De detaljerade teknikerna som presenteras här möjliggör en >100-faldig ökning av antalet prover som kan utvärderas i ett CFU-räkningsexperiment. Denna teknik utvecklar befintliga metoder för mikrobiomexperiment i Drosophila 12,35,36 genom att använda 96-brunnsplattformatet för att analysera enskilda flugor. Dessutom tillämpar den en effektivare punktpläteringsmetod19,31 och ett automatiserat arbetsflöde med en fotograferings- och koloniräkningsplattform. Betydelsen av denna metod för Drosophila är att standardisera experiment till 96-brunnsplattformatet, vilket möjliggör samtidig hantering av ett stort antal biologiska replikat med automatisering för att uppnå kvantifiering av CFUs med hög genomströmning.
96-brunnsplattformen visar att ökad överföringsfrekvens och “clearing” av övergående bakterier orsakar en signifikant minskning av både medelmängden och variationen mellan prover (figur 1B,C), vilket visar strängheten i detta förbättrade protokoll. En begränsning av co-housing flugor är den horisontella överföringen av bakterier mellan flugor. En föreslagen lösning är att hålla flugor individuellt i ett 96-brunnsplattformat, till exempel Whole Animal Feeding Flat38.
Även om en signifikant minskning av bakteriebelastningen inte observerades när flugor tvättades i etanol, hade dessa flugor endast hållits i närvaro av externa bakterier i 3 dagar. Bostäder under längre tidsperioder kan tillåta en större bakteriebelastning att ackumuleras39. Därför rekommenderas fortfarande tvätt i etanol.
Överföring av flugor till 96-brunnsplattan är det kritiska första steget för att konfigurera arbetsflödet (figur 1A). När flugorna har tvättats fördelas de i brunnarna en i taget. Ett plattdiagram är användbart i detta skede för att notera vilka förhållanden som finns i varje brunn och lägga till eventuella anteckningar som “fluga förlorades”. Homogenisering är ett annat kritiskt steg med några viktiga försiktighetsåtgärder. Bakterier överlever homogeniseringsprocessen när de är i närvaro av en fluga (figur 1D,E), och förmodligen är denna princip också sann när bakterierna är inne i flugans tarm. Men bakterier dödas också när de homogeniseras enbart i pärlplattor, vilket visar att homogeniseringen kan döda bakteriecellerna under vissa omständigheter, en begränsning som kan vara viktig om man till exempel homogeniserar dissekerade tarmar. I synnerhet är förlusten av CFUs vid homogenisering beroende av antalet CFUs i provet, och förlusten är minimal när ~ 105 CFUs per brunn används. Ytterligare bevarande av CFUs kan uppnås genom att stoppa homogeniseringen halvvägs och kyla plattan på is.
Homogenisering utfördes i 5 minuter i detta protokoll baserat på kontrollexperiment där ett känt antal CFUs blandades med en bakteriefri fluga, och detta fungerade empiriskt för flugbakterier. Mindre slag orsakade att större flugdelar var närvarande, vilket stör pipettering, medan betydligt längre homogeniseringstider på ~ 10 min gjorde att CFU räknades mer variabelt. Den mindre volymen och vinklade formen av koniska plattbrunnar observerades för att minska effektiviteten hos pärlslag jämfört med cylindriska 2 ml rör. Många variationer på detta allmänna tillvägagångssätt är möjliga, inklusive vilka bakteriestammar, vilken pärlslagande behållare, vilka pärlor och vilken fluggenotyp som används. Enskilda användarfall måste använda positiva kontroller för att fastställa sin metod.
Punktpläteringsmetoden användes på ett specifikt sätt: 1:2 utspädningar av L. plantarum WF i PBS upptäcktes på MRS-plattor och inkuberades vid 30 °C i 2 dagar (kortare inkubationstider kan implementeras för att generera mindre kolonistorlekar). Metoden kräver en viss investering i utrustning, främst pärlvisparen och 96-kanals pipettor (figur 2A), vilket är nödvändigt för både utspädningsserien och punktplätering. Det finns dock billigare alternativ, inklusive en 96-brunns plattreplikator med slitsade stift. Utspädningsserien är ett kritiskt steg som påverkar noggrannheten i CFU-räkningsresultaten. När det gäller fellägen är det möjligt att täppa till pipettspetsarna med flygdelar eller glaspärlor och att pipettspetsarna inte tätar ordentligt på pipettorn eller misslyckas av någon annan anledning. Alla dessa problem resulterar i underräkning av de drabbade brunnarna och bör övervakas. Tillräcklig blandning vid varje steg i utspädningsserien är också avgörande. Varje utspädning ska blandas noggrant antingen genom att lägga plattan på en tallriksskakare eller genom att pipettera upp och ner 15-20 gånger, vilket också tjänar till att skölja spetsarna. Genom att upptäcka från den mest utspädda till minst utspädda plattan kan spetsarna återanvändas för hela utspädningsserien. Med 1:2 utspädningar är räkningen korrekt över ett intervall av 2-25 kolonier, som spänner över en storleksordning (figur 2C). Därför sparar 1:10 utspädningar tid och material. En annan variabel som kan utnyttjas är inkubationstid, som kan justeras för att producera mindre kolonier och därmed öka utbudet av räknbara fläckar genom att förhindra sammanslagning av intilliggande kolonier.
Ett kvalitetsfoto av plattan är viktigt eftersom det blir de råa källdata från vilka CFU: erna analyseras och kan arkiveras på obestämd tid. FluoroBox är utformad för att producera foton av plattorna med jämn ljusintensitet, vilket minimerar bländning på agarytan. Dessutom, designen kan selektivt fotografera fluorescerande kolonier med enfärgade LED-lampor och färgade fotofilter (figur 3A). Konstruktionen av en installation som FluoroBox, med kontrollerad belysning och kamerainställningar, kan kraftigt öka reproducerbarheten av CFU-bilder, vilket är viktigt för automatiserad analys. Kolonimorfologier, fluorescensintensitet och effekterna av tid eller densitet på kolonitillväxt är bara några av de egenskaper som kan analyseras med hjälp av fotografierna. Fotolådan kan konstrueras utan färgfilter och enfärgade lampor om inga fluorescerande bakterier används, vilket minskar kostnaden och komplexiteten. Olika excitationsljus och emissionsfilter kan ersättas med de som rekommenderas här om en annan fluorofor används av ett laboratorium. En kamera som är ansluten till en surfplatta via WiFi med en app är användbar både för den automatiska slutarfunktionen för att förhindra skakningar och för att underlätta dataöverföring. Bilder kan överföras till surfplattan och sedan till en bärbar dator med trådlös filöverföringsprogramvara. Rekommenderade kameror med dessa funktioner anges i materialförteckningen.
Count-On-It är ett plugin-program skrivet i ImageJ. Den automatiserade CFU-räkningsprogramvaran segmenterar plattbilden i ett enhetligt 96-brunnsnät, räknar kolonierna i varje rutnätscell och batchar resultaten till ett enkelt kalkylblad. Eftersom det alltid finns variationer i spotnätets position på plattan och på fotot måste användaren manuellt anpassa rutnätet till fotot med hjälp av plugin-programmet Croptacular. Detta hjälper också till att utesluta områden nära plattkanten, som har bländning. Att ställa in tröskeln är nyckeln till att få det mest exakta CFU-antalet från bilden. Om tröskeln är för hög kommer kolonierna att gå samman; Om tröskeln är för låg kommer kolonierna att uteslutas. När tröskelvärdet har ställts in tillämpar makrot gaussisk oskärpa för att mjuka upp kanterna och minska aliasing, vattendelarfiltret delar överlappande kolonier och blobarna räknas med hjälp av analyspartiklar.
Ibland är tätheten av kolonier för hög på en viss plats. Count-On-It ger ett sätt att hantera detta. För att uppskatta antalet kolonier i en rutnätscell med delvis sammanslagna kolonier tas först den genomsnittliga ytan av en cirkulär blob från hela plattan som Cavg. Därefter divideras området för blob A 1 med medelvärdet av en cirkulär blob A1/Cavg. Det här talet avrundas till närmaste heltal och det är uppskattningen för hur många kolonier som finns i en blob. Den här funktionen är en anledning till att tröskelvärdet kan påverka räkningsresultaten: det relativa genomsnittliga koloniområdet jämfört med ett sammanfogat blobområde kommer att vara olika beroende på hur tröskelvärdet påverkade sammanslagna blobar.
De metoder som presenteras har flera begränsningar. Dessa inkluderar behovet av utrustning för att dispensera flytande media exakt från 96-brunnsplattor. Denna utrustning, antingen en 96-kanals pipettor eller ett slitsat replikatorstiftverktyg, kan kosta tusentals dollar att få. Billigare alternativ finns men är mindre exakta. Automatiserad räkning via Count-On-It ger också vissa begränsningar. Om till exempel två kolonityper i en blandad population avgränsades baserat på enbart storlek, skulle blobräkning inte kunna tilldela kolonier till rätt typ. I det här fallet måste fläckar med blobbar elimineras från räkningar. Ytterligare differentiering av kolonier baserat på morfologi skulle vara en värdefull förlängning av den metod som för närvarande inte implementeras. Användningen av selektiva medier inklusive stamspecifika näringsämnen och antibiotika förenklar behovet av komplex bildanalys.
Att upprätthålla fruktflugeexperiment i 96-brunnsplattor multiplicerar antalet prover och förhållanden som kan testas i ett enda experiment och kan underlätta skärmar med hög genomströmning i Drosophila-bakterieföreningsfenotyper. Vi föreställer oss att denna metod kan utökas genom att använda selektiva medier för att differentiera många bakteriestammar i komplexa blandningar. Metoden är inte begränsad till studien av flugmikrobiomet. Kvantifiering av CFUs är vanligt i många tillämpningar av mikrobiologi, från koliforma räkningar i dricksvatten till identifiering av patogener. CFU-pläteringssystemet som presenteras här möjliggör skärmar med hög genomströmning, samt automatiserad insamling, bearbetning, lagring och leverans av resultat.
The authors have nothing to disclose.
Dr. Kerwyn Casey Huang, Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper och medlemmar av Ludington-labbet gav värdefull input om utvecklingen av detta protokoll. Finansiering tillhandahölls av NSF IOS-bidrag 2032985, NIH-bidrag DP5OD017851, ett Carnegie Institution of Canada-bidrag och Carnegie Institute for Science’s Endowment.
Bead beating and spot plating | |||
Fly vials | Genesee | 32-121 | autoclavable |
Fly vial stoppers | Genesee | 59-201 | autoclavable |
Hand Applicator | 3M | 3M PA1 | |
Heat Sealer | Eppendorf | 5390 | |
Mini-Beadbeater 96 | BioSpec | 1001 | |
Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0.5 mm | BioSpec | 11079105 | |
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner | Labnet | LI-CF-P1000 | |
Rainin BenchSmart 96 semi-automated pipettor | Mettler Toledo | 30296705 | Less expensive options available, including slotted 96 well pin tool from VP Scientific |
TempPlate semi-skirted 96-well PCR plate, straight skirt, natural | USA scientific | 1402-9220 | Must be polypropylene for heat sealer |
Thermal Bond Heat Seal Foil | 4titude | 4ti-0591 | Keep sterile |
Tray Plate,128 x 85 mm, Polystyrene, Sterile | SPL Life Sciences | 31001 | For making rectangular agar plates |
Photobox construction | |||
¼”-20 X ½” Bolts (X2) | Amazon | ASIN: B07BP1WR3H | To attach the camera bracket. Brand not important. Any 1/4"-20 1/2" bolt works. |
¼”-20 x ½” Connector Nut | Amazon | UPC: 799862376780 | AKA cap nut or connector bolt. This is for attaching the rubber bands on the plate holder. Brand not important. |
¼”-20 x ¾” bolts (X3) | Amazon | ASIN: B003QZSZY4 | For the plate holder. Brand not important. |
1/8” x ½” washer | Amazon | UPC: 611982484599 | Washer for the cap nuts on outside of box. Brand not important. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
18 Gauge Wire – Two Conductor Power Wire – 18 AWG Power Wire – 10ft | Superbrightleds.com | WP18-2 | |
22-10 AWG Red Wire Nut – WN-R2210 – Quantity 4 | Superbrightleds.com | WN-R2210 | |
22-18 AWG 3/16in Female Push On Connector – 22-18 AWG – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SCFP-2218 | |
4" Solderless Clamp-On Jumper Connector – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-2 | |
4" Solderless Clamp-On Pigtail Adaptor – 8mm Single Color LED Strip Lights – Quantity 3 | Superbrightleds.com | SBL-MA2P-8-1 | |
6” drawer handle | Amazon | ASIN: B07Z331P99 | Any drawer handle should work. |
6” Drawer slides | Btibpse | UPC: 712243424979 | Trim the soft close rubber stoppers on the drawer sliders. |
8-32 x ½” Cap Nuts (x4) | Amazon | ASIN: B00HYLZB98 | Attaches drawer slide bolts on outside of box. Brand not important. Nylon won't damage the acrylic. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
8-32 x ½” Nylon Bolts (x4) | Amazon | ASIN: B07KX9T7NF | To attach drawer slides. Brand not important. Any bolt or machine screw meeting the specifications works. Nylon won't damage the acrylic and allows you to cut the bolt flush with the nut. Spray paint black before attaching to blend with the acrylic. |
Acrylic Glue | SCIGRIP | Ean: 7844908489337 | SCIGRIP Weld-On #4 Adhesive, Pint and Weld-On Applicator Bottle with Needle |
Black Cable Ties – 10 Pack – 4 Inch Long | Superbrightleds.com | CT-B04-10 | |
Camera L-Bracket | WLPREOE, Vikerer, Unbranded | ASIN: B09X46YKQZ | The bracket should be "reversed" from its intended configuration so that the camera is on the "outside" of the L. Some brackets come in two pieces and allow for this alternate configuration, some don't, you'll need one that can be flipped. Also should have 1/4" holes for attachment. WLPREOE, Vikerer, Unbranded. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Canon T series camera for tethering option OR | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.. | 1894C002 | The Canon Ti series cameras are a good option and can tether to a computer. Use with the 18-55mm standard kit lens. Used options are recommended from the Canon T5 to T7 (current model). |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Blue – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BBLU-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Green – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-BGRE-B6A-08C1M-24V | |
Custom Length Single Color LED Strip Light – Eco Series Tape Light – 24V – IP20 – 250 lm/ft – Natural White 4000K – 2 meters | Superbrightleds.com | STN-A40K80-B6A-08C1M-24V | |
Drill with ¼”, 1/8” drill bits | Black & Decker | BDCDD12PK | Brand not important. |
Flat Black Spray Paint, 2X Ultra-Matte | Rustoleum | 331182 | Paint the interior of everything FLAT black. Brand not important. |
Laser Cut Acrylic Walls | Big Blue Saw | www.bigbluesaw.com | Use the attached PDF, delete all cutouts in the top piece except desired hole for camera |
Mean Well LED Switching Power Supply – LPV Series 20-100W Single Output LED Power Supply – 24V DC – 20 Watt | Superbrightleds.com | LPV-20-24 | |
Panasonic ZS100 for wifi connection to a phone, tablet, or computer | Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc. | DMC-ZS100K | Panasonic cameras can be wirelessly connected to a computer for data transfer and remote shutter options. Used options are good. |
Quick Release Plate | Neewer Aluminium 50mm Quick Release Plate QR Clamp 3/8-inch with 1/4-inch | ASIN: B07417F21D | Add this to the bracket so the camera can be easily removed for changing color filters. Amazon Serial Identification Number given as an example. |
Rubber Bands, Assorted sizes | BAZIC Products | Alliance Rubber 26649 | Rubber bands go on the plate holder. Brand not important. |
Screw/Adhesive Cable Tie Mounting Bases – 3/4 inch base – Quantity 4 | Superbrightleds.com | CTMB-20 | |
SPST Round Rocker Switch – No LED – Quantity 3 | Superbrightleds.com | RRS-SP | |
Tiffen 29 Filter (Red) 72 mm | Tiffen | 72R29 | |
Tiffen 58 Filter (Green) 72 mm | Tiffen | 7258 | |
Software | |||
ImageJ64 | https://imagej.net/downloads | N/A | Free. Just cite: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019 |
MacOSX | Apple | N/A | Has a useful batch rename feature in Finder to rename a group of photos to facilitate organizing and analyzing in Count-on-it. |
Unix | BSD | N/A | 64 bit |
Windows | Microsoft | N/A | 64 bit |