Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein interventionelles radiologisches Verfahren, das für die intrathymische Injektion bei Mäusen eingerichtet wurde, um das Risiko einer offenen Operation zu vermeiden und die Genauigkeit blinder perkutaner Injektionen zu verbessern.
Abstract
Die intrathymische Injektion in Mausmodellen ist eine wichtige Technik zur Untersuchung der Thymus- und Immunfunktion, einschließlich genetischer und erworbener T-Zell-Störungen. Dies erfordert Methoden zur direkten Ablagerung von Reagenzien und/oder Zellen in den Thymus lebender Mäuse. Traditionelle Methoden der intrathymischen Injektion umfassen Thoraxchirurgie oder minimalinvasive perkutane Blindinjektionen, die beide erhebliche Einschränkungen aufweisen. Ultrahochfrequenz-Ultraschallbildgebungsgeräte haben bildgeführte perkutane Injektionen bei Mäusen ermöglicht, wodurch die Injektionsgenauigkeit des perkutanen Injektionsansatzes erheblich verbessert und die Injektion kleinerer Ziele ermöglicht wurde. Bildgeführte Injektionen sind jedoch auf die Verwendung eines integrierten Schienensystems angewiesen, was dies zu einem starren und zeitaufwändigen Verfahren macht. Hier wird eine einzigartige, sichere und effiziente Methode für perkutane intrathymische Injektionen bei Mäusen vorgestellt, wodurch die Abhängigkeit vom Schienensystem für Injektionen entfällt. Die Technik beruht auf der Verwendung einer hochauflösenden Mikroultraschalleinheit, um den Mausthymus nichtinvasiv abzubilden. Mittels Freihandtechnik kann ein Radiologe unter sonographischer Anleitung eine Nadelspitze direkt in den Mausthymus einführen. Mäuse werden vor der Bildgebung gereinigt und betäubt. Für einen erfahrenen Radiologen, der sich mit ultraschallgeführten Verfahren auskennt, ist die Lernzeit für die angegebene Technik recht kurz, typischerweise innerhalb einer Sitzung. Die Methode hat eine niedrige Morbiditäts- und Mortalitätsrate für die Mäuse und ist viel schneller als aktuelle mechanisch unterstützte Techniken zur perkutanen Injektion. Es ermöglicht dem Forscher, präzise und zuverlässige perkutane Injektionen von Thymus jeder Größe (einschließlich sehr kleiner Organe wie dem Thymus von gealterten oder immundefizienten Mäusen) mit minimaler Belastung für das Tier effizient durchzuführen. Diese Methode ermöglicht auf Wunsch die Injektion einzelner Lappen und erleichtert aufgrund der Zeitersparnis des Verfahrens groß angelegte Experimente.
Introduction
Der Thymus spielt eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung und Immunität von T-Zellen. T-Zell-Mangel, der unter anderem durch Thymusinvolution, genetische Störungen, Infektionen und Krebsbehandlungen verursacht werden kann, führt zu hoher Mortalität und Morbidität 1,2. Mausmodelle sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der translationalen Immunologieforschung unverzichtbar und werden seit Jahrzehnten zur Untersuchung der Thymusbiologie und T-Zell-Entwicklung sowie zur Entwicklung von Therapien für Menschen mit Thymusdysfunktion und T-Zell-Mangel eingesetzt 3,4,5.
Ein zentraler Bestandteil der Thymusuntersuchungen war die intrathymische Injektion von biologischem Material wie Zellen, Genen oder Proteinen in Mausmodellen 6,7,8,9,10,11,12. Konventionelle intrathymische Injektionsmethoden verwenden Thorakotomie, gefolgt von intrathymischer Injektion unter direkter Visualisierung oder durch "blinde" perkutane Injektion in das Mediastinum. Der chirurgische Ansatz erhöht unter anderem das Pneumothorax-Risiko signifikant. Darüber hinaus führt der erhöhte Stress während dieser Operation zu einer Immunsuppression, wodurch möglicherweise immunologische Daten beeinträchtigtwerden 13. Erfahrene Forscher können nach einiger Übung die Blindinjektionstechnik durchführen, aber dieser Ansatz ist weniger genau und beschränkt daher Versuchspersonen auf junge Mäuse mit einem großen Thymus.
Die Verwendung der Ultraschallführung wurde als präzise und minimalinvasive Alternative zu herkömmlichen intrathymischen Injektionsansätzen eingeführt14. Dieses Verfahren ist jedoch sehr zeitaufwendig, wenn anstelle der Freihandtechnik das integrierte Schienensystem verwendet wird. Die Durchführung von Injektionen mit der Injektionshalterung erfordert eine sorgfältige Optimierung der Bildgebung und Positionierung des Wandlers mit Hilfe der verschiedenen Befestigungen wie dem Wandlerständer und der Halterung, dem X-, Y- und Z-Positioniersystem sowie eine kompetente Bedienung der Mikromanipulationssteuerungen und Schienensystemerweiterungen. Eine einfache alternative Technik, die ultraschallgesteuerte Thymusinjektion, wird hier von einem Radiologen unter Verwendung eines Freihandansatzes15 vorgestellt, der sowohl eine schnelle als auch genaue minimalinvasive Alternative zu den oben beschriebenen Methoden darstellt. Wichtig ist, dass der aktuelle Ansatz mit jedem hochauflösenden Ultraschall-Bildgebungssystem durchgeführt werden kann, ohne dass eine Injektionshalterung und ein integriertes Schienensystem erforderlich sind. Es ist besonders nützlich für Studien, die die Injektion einer großen Anzahl von Mäusenerfordern 11, für Experimente, bei denen beide Thymuslappen injiziert werden, oder für die genaue Injektion kleiner Thymusen in ältere, bestrahlte oder immungeschwächte Mäuse12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Eingriffe wurden in Übereinstimmung mit den Tierpflegerichtlinien des Center for Discovery and Innovation (IACUC-Protokoll 290) durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden C57BL/6-Mäuse (weiblich, 4-6 Wochen alt), C57BL/6-Mäuse (weiblich, 6 Monate alt), J:NU-Weibchen, NOD scid gamma (NSG) weibliche Mäuse und B6; CAG-luc, -GFP-Mäuse wurden als junges Mausmodell, gealtertes Mausmodell, athymisches Nacktmodell, immundefizientes Modell und Biolumineszenzzellquelle verwendet. Die Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle). Dieses Verfahren erfordert typischerweise zwei Personen (eine, um während der Durchführung der Injektionen steril zu bleiben, und eine andere, um die Mäuse zu behandeln).
1. Tierische Zubereitung
- Induktion der Anästhesie bei den Mäusen mit 3% -4% Isoflurangas und Aufrechterhaltung der Anästhesie mit 1% -3% Isoflurangas, das über einen Nasenkegel und einen präzisionskalibrierten Vaporizer verabreicht wird (siehe Materialtabelle).
- Bestätigen Sie die entsprechende Betäubungstiefe / Bewusstlosigkeit durch Nichtansprechbarkeit auf die Hinterpfotenklemme.
- Entfernen Sie das Fell aus dem vorderen Brustbereich der Mäuse, indem Sie eine dünne Schicht Enthaarungscreme für weniger als 1 Minute auftragen. Verwenden Sie ein nasses Papiertuch, um die Creme zusammen mit dem losen Fell vollständig zu entfernen.
HINWEIS: Das Auftragen von zu viel Creme führt dazu, dass sich die Haut im Brustbereich entzündet. - Legen Sie jeweils eine Maus, Rückenlage, mit dem Nasenkegel auf die beheizte Plattform der Ultraschall-Bildgebungsstation für Kleintiere (siehe Materialtabelle) (Abbildung 1).
- Befestigen Sie die Maus mit medizinischem Klebeband an Hinter- und Vorderbeinen auf der Bühne (Abbildung 1).
- Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
- Desinfizieren Sie die fellfreie obere Thoraxhaut mit einem Chlorhexidingluconat-Applikator (siehe Materialtabelle).
2. Vorbereitung des Ultraschallgeräts und des Sterilfeldes
- Aktivieren Sie die höchste verfügbare lineare Sonde, typischerweise die Sonde mit der höchsten räumlichen Auflösung für die Größe des abgebildeten Tieres. Aktivieren Sie die Sonde, indem Sie nach dem Startbildschirm auf die entsprechende Schaltfläche tippen.
HINWEIS: Für diese Anwendung mit Mäusen ist die verwendete Sonde speziell für die Verwendung mit Mäusen und kleinen Ratten konzipiert (siehe Materialtabelle). - Optimieren Sie die Ultraschalleinstellungen für Bildgebung und Injektion, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Stellen Sie die Tiefe des Sichtfelds auf eine für das Zieltier geeignete Größe ein, indem Sie die vertikal ausgerichteten Schieberegler auf der rechten Seite des Bildschirms anpassen (Abbildung 2). Die maximale Tiefeneinstellung beträgt typischerweise etwa 6-8 mm für junge Mäuse.
- Passen Sie die Graustufenverstärkung an, indem Sie die Taste entlang des horizontalen Balkens am unteren Bildschirmrand schieben (Abbildung 2). Ziel ist es, mit einem Bild zu beginnen, das nur geringfügig dunkler ist als ein typisches "graues" Aussehen.
- Stellen Sie die Fokuszone (blauer Pfeil rechts auf dem Bildschirm, Abbildung 2) auf das erwartete Niveau des Thymus ein. Für junge Mäuse wird dies etwa eine Tiefe von 4 mm sein.
- Wenn eine Bildaufnahme gewünscht wird, testen Sie die Funktionalität der Schaltflächen Bild speichern und Clip speichern, um sicherzustellen, dass die Bilder während des gesamten Vorgangs ordnungsgemäß gespeichert werden können. Tippen Sie dazu unten rechts auf dem Bildschirm auf die Schaltfläche Save Clip (Clip speichern) oder auf die Schaltfläche Freeze (Stand) und dann auf Save Image (Bild speichern) (Abbildung 2).
- Tragen Sie eine kleine Menge (~ 1 ml) Ultraschallgel auf die Oberfläche des Schallkopfes auf (siehe Materialtabelle), während es aufrecht ist, entweder im Halter des Ultraschallgeräts oder in den Händen eines Assistenten.
- Bereiten Sie ein kleines steriles Feld neben der beheizten Plattform vor. Die optimale Positionierung hierfür liegt in der Regel zwischen der Plattform und dem Ultraschallgerät.
- Entleeren Sie diese Gegenstände auf das sterile Feld: eine sterile Sondenabdeckung, Gummiband, sterile Handschuhe und steriles Ultraschallgel (siehe Materialtabelle).
- Wenn das sterile Feld eingerichtet und die Gegenstände an Ort und Stelle sind, ziehen Sie die sterilen Handschuhe an.
- Legen Sie die sterile Sondenabdeckung vorsichtig über den Ultraschallwandler (sowie über das Gel, das ursprünglich auf die Sonde gelegt wurde). Bewahren Sie die Sterilität und berühren Sie nur die sterile Abdeckung, sonst nichts. Schieben Sie das sterile Gummiband über die sterile Sondenabdeckung, um es an Ort und Stelle zu halten.
HINWEIS: Die Luftherde können unabhängig von ihrer Größe die Ultraschallbildgebung beeinträchtigen. Daher ist es wichtig, das Ultraschallgel zwischen dem Schallkopf und der sterilen Sondenabdeckung und oben auf die Sondenabdeckung aufzutragen, um eine luftfreie Schnittstelle zwischen der Ultraschallsonde und dem Tier zu gewährleisten. - Geben Sie eine moderate Menge (2-3 ml) steriles Ultraschallgel auf den Schallkopf.
HINWEIS: Der Benutzer ist jetzt bereit, eine betäubte Maus abzubilden.
3. Bildgebung und Lokalisierung des Thymus
- Unter Beibehaltung der Sterilität platzieren Sie die Ultraschallgelsonde vertikal auf den desinfizierten Teil der vorderen Brustwand der Maus für die erste Bildgebung.
- Nehmen Sie sich einen Moment Zeit, um sich das Ultraschallbild anzusehen und es weiter zu optimieren. Gehen Sie zurück zu Schritt 2.2, und passen Sie es an, um ein ähnliches Erscheinungsbild wie in Abbildung 3 zu erhalten.
- Scannen Sie die vordere Brust der Maus in einer Querebene. Führen Sie dies aus, indem Sie den Schallkopf vertikal halten und ihn in einer pinselartigen oder "schwungvollen" Bewegung vom Hals zum Bauch auf und ab bewegen.
HINWEIS: Das Herz wird aufgrund seiner schnellen Bewegung und seines "kammerförmigen" Aussehens die bekannteste Struktur in der Brust sein. Sobald das Herz lokalisiert ist, kann dies als Referenzpunkt verwendet werden, um ein Bild des Thymus zu erhalten. - Wenn das Herz im Sichtfeld zentriert ist, streichen Sie den Schallkopf leicht in Richtung Hals. Gerade dem Herzen überlegen, wird normalerweise der Thymus angetroffen.
- Visualisieren Sie den Thymus als eine zweilappige, pyramidale, reflexionsarme ("dunkel" oder "schwarz" erscheint auf dem Bildschirm) Struktur, die in der Mittellinie, vor der Aorta und hinter dem Brustbein zentriert ist (Abbildung 3A).
- Notieren Sie sich die beiden runden gepaarten schwarzen (dh "reflexionsarmen") Strukturen auf beiden Seiten der oberen Brust.
HINWEIS: Dies sind die bilateralen Venae cavae. Die Aorta ist eine ähnliche krummlinige echoarme Struktur in der Mittellinie zwischen den beiden Venae cavae. Diese sind leicht an ihrer pulsierenden Bewegung zu erkennen.
4. Injektion des Thymus
- Tragen Sie bei Bedarf mehr (2-3 ml) steriles Ultraschallgel auf den Schallkopf auf.
HINWEIS: Eine relativ große Menge sterilen Gels auf dem Schallkopf (im Vergleich zur Größe des Mausthorax) wirkt als "Gelpad" um die Brustwand der Maus. Dies reduziert die Anzahl der Ultraschallartefakte, die durch Luft innerhalb des Sichtfeldes erzeugt werden. - Lokalisieren Sie mit der Ultraschallsonde den breitesten Teil des Thymus, der normalerweise die ideale Zielstelle für die Injektion ist. Antizipieren Sie eine horizontale Nadelbahn an der gewählten Position.
- Beachten Sie, wo sich die wichtigsten Blutgefäße (SVCs und Aorta) an dieser Stelle befinden. Vermeiden Sie diese während der Injektion.
- Die Blutgefäße sind echoarme, pulsatile Strukturen, wie in Schritt 3.7 beschrieben. Wenn Sie sich nicht sicher sind, verwenden Sie den Farbdopplermodus, um den Durchfluss innerhalb der Behälter zu überprüfen (Abbildung 4A). Aktivieren Sie den Farbdoppler-Modus, indem Sie auf die Schaltfläche Farbe auf dem Bildschirm tippen.
- Wenn erwartet wird, dass eines der Hauptblutgefäße (oder das Herz) entlang der erwarteten Nadelbahn liegt, wählen Sie einen neuen Zielbereich oder suchen Sie einen anderen Ansatz / eine andere Flugbahn.
- Halten Sie den Schallkopf in der einen Hand und eine 30 g Insulinnadel (siehe Materialtabelle) mit 10 μL Injektion in der anderen.
HINWEIS: Das Injektat variiert je nach Versuchsdesign. Die vorliegende Studie verwendete phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Trypanblau oder D-Luciferin (0,1 μg/10 μL). - Um den Injektionsvorgang zu beginnen, bewegen Sie den Schallkopf seitlich, so dass der Thymus im Ultraschallsichtfeld nicht mittig ist. Stellen Sie sicher, dass die andere Seite des Sichtfeldes hauptsächlich aus Ultraschallgel besteht und sonst nichts.
- Legen Sie die Nadelspitze in das Gel unter dem Schallkopf und bewegen Sie die Nadel langsam, bis sie neben der Hautoberfläche sichtbar ist (Abbildung 4B).
- Während Sie die Nadel kontinuierlich unter Ultraschall abbilden, führen Sie die Nadel mit einer perkutanen Flugbahn in die Thymusdrüse ein, weg von Blutgefäßen.
- Verwenden Sie eine horizontale Flugbahn "Kreuzthymus", um die Nadelspitze im Thymuslappen kontralateral zur Eintrittsstelle zu platzieren. Dies erklärt potenzielle Leckagen entlang des Nadeltrakts (Abbildung 5A).
- Sobald sich die Nadelspitze im gewünschten Teil des Thymus befindet, injizieren Sie schnell den Inhalt (z. B. 10 μL Trypanblau oder D-Luciferin, 0,1 μg / 10 μL) aus der 30-G-Spritze, während Sie die sonographische Visualisierung verwenden.
- Um die Spritze während des Nadeleinführens und der Injektion zu stabilisieren, halten Sie die Spritze zwischen Daumen und dritten Finger und steuern Sie den Spritzenkolben mit dem Zeigefinger.
- Entfernen Sie die Nadel, nachdem der gesamte Inhalt abgelegt wurde.
5. Überwachung der Tiere nach der Injektion
- Bringen Sie das Tier in einen leeren Käfig und beobachten Sie, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
HINWEIS: Es wird erwartet, dass eine vollständige Erholung von der Anästhesie innerhalb von 2 Minuten eintritt. - Überwachen Sie das Tier für weitere 10 Minuten auf Anzeichen von Stress, Atemnot oder Blutungen.
HINWEIS: Schmerzen nach der Injektion werden nicht erwartet, und es besteht in der Regel keine Notwendigkeit für eine Analgesie nach der Injektion. - Nach vollständiger Genesung und nach einer ereignislosen Beobachtungszeit nach der Injektion wird das injizierte Tier in Begleitung anderer Tiere zurückgegeben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die erfolgreiche Implementierung dieser Technik hängt von einigen wichtigen Schritten ab, die befolgt werden müssen. Zunächst muss eine zuverlässige Identifizierung der Thymusdrüse selbst sichergestellt werden. Bei jungen Mäusen ist dies aufgrund der Größe der Drüse einfach (Abbildung 3A). Bei älteren Mäusen oder immundefizienten Mäusen kann es schwieriger sein; mit modernen Ultraschallgeräten ist es jedoch immer noch sehr gut machbar (Abbildung 3B,C). Zweitens ist es von entscheidender Bedeutung, die Nadelbahn so einzustellen, dass sie während des Vorrückens der Nadelspitze durch die Brustwandschichten und in den Thymus kontinuierlich visualisiert wird. Bei einer erfolgreichen Injektion wird die Nadel vollständig visualisiert, während sie vorangetrieben wird. Dies stellt sicher, dass der Bediener keine kritische Struktur wie das Herz, die Aorta oder eine der unteren Venenhöhlen durchquert hat (Abbildung 4). Dies gilt auch für die Injektion selbst. Die Nadelspitze muss während der Injektion immer an ihrer Zielstelle visualisiert werden, damit die intrathymische Ablagerung bestätigt wird (Abbildung 5).
Es gibt einige kleinere Fallstricke, die, wenn sie erkannt werden, relativ leicht gemildert werden können. Bei der Befestigung der Maus am Bühnen- und Nasenkegel muss der Brustkorb der Maus so neutral wie möglich gemacht werden (d.h. ohne signifikante Rotation nach links oder rechts). Wenn der Thorax zu stark rotiert, ist der korrekte "Annäherungswinkel" der Nadel möglicherweise nicht leicht erreichbar. Wenn die Maus nicht fest genug befestigt ist, kann sie sich beim Versuch, die Nadel vorzuschieben, bewegen oder gleiten, was die Anatomie verzerrt und die Visualisierung erschwert. Mit der richtigen Technik und Vorbereitung kann jedoch eine erfolgreiche intrathymische Injektion mit Konsistenz, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit erreicht werden.
Sobald die Injektion abgeschlossen ist, gibt es mehrere Möglichkeiten, den intrathymischen Ort der Injektion zu bestätigen. Die vorliegende Studie verwendete Luciferin als Injektion in Luciferase-transgene Mäuse. Diese können dann unmittelbar nach der Injektion mit Biolumineszenz-Bildgebung ausgewertet werden, um den korrekten Ort der Injektion zu bestätigen, ohne das Tier zu opfern (Abbildung 6A). Diese Technik hat den zusätzlichen Vorteil, dass injizierte Luciferin-markierte Zellen zu mehreren Zeitpunkten abgebildet werden können, wodurch die Persistenz der Aktivität im Thymus sichergestellt wird. Alternativ kann Trypanblau als visueller Marker der Injektionsstelle injiziert werden, und die Injektionsgenauigkeit kann dann ex vivo mit Nekropsie16 bestätigt werden (Abbildung 6B).
Abbildung 1: Anästhesierte Maus auf dem Bildgebungstisch für die Ultraschalluntersuchung des Thymus. Eine 6 Wochen alte weibliche C57BL/6-Maus mit einer enthaarten Brust wurde betäubt und in die Bildgebungsstation gebracht. Die Maus befindet sich in Rückenlage, wobei die ausgestreckten Beine mit Klebeband gesichert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Einstellungen des Ultraschallgeräts. Abbildung des Bedienfelds des Ultraschallgeräts (Touchscreen). Die wichtigsten Anpassungen der Einstellungen zur Optimierung der Bildgebung sind die Anpassung der Tiefe (roter Pfeil), der Fokuszone (gelb eingekreist) und der Gewinne (rotes Sternchen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ultraschallbildgebung des Thymus bei immunkompetenten und immundefizienten jungen und älteren Mäusen. (A) Immunkompetente junge Maus (C57BL/6, weiblich, 4 Wochen alt, n = 5). Die transversale sonographische Ansicht zeigt den rechten und linken Lappen des Thymus (Sternchen). (B) Immunkompetente ältere Maus (C57BL/6, weiblich, 6 Monate alt, n = 5). Der Thymus (Sternchen) ist kleiner, behält aber seine typische Lage und Pyramidenform bei. (C) Immundefiziente junge Maus (NOD scid gamma, Weibchen, 4 Wochen alt, n = 5). Beachten Sie die viel kleinere Größe des Thymus (Sternchen) im Vergleich zur normalen jungen Maus. (D) Athymische Nacktmaus (Weibchen, 8 Wochen alt, n = 1). Es gibt eine völlige Abwesenheit von Thymusgewebe. Bemerkenswert ist, dass die dunkle (reflexionsarme) vertikale Linie in der Mitte des Bildes (Sternchen) ein Schattenartefakt aus dem Brustbein ohne echtes Thymusgewebe ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Vorbereitung für die Injektion. (A) Farbdopplerbild des vorderen Thorax zeigt die Beziehung des Thymus zu den mediastinalen Gefäßen. Die untere Mitte ist der Aortenbogen (roter Pfeil), und die abgerundeten Gefäße auf beiden Seiten sind die rechte und linke obere Venae Cava (gelbe Pfeilspitzen). Blut, das zur bildgebenden Sonde fließt, ist rot codiert, und Blut, das vom Schallkopf wegfließt, ist blau codiert. (B) Nadelplatzierung vor dem Vordringen in die Brust von linksseitiger Annäherung. Die Nadelspitze (gelber Pfeil) muss mit dem Ultraschallwandler und die Spitze mit dem mittleren Teil des Thymus übereinstimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Injektionstechnik . (A) Nadelplatzierung zur Injektion des rechten Thymuslappens einer immunkompetenten jungen Maus. Die Nadelspitze (gelber Pfeil) befindet sich im zentralen Teil des rechten Lappens. (B) Bild des rechten Lappens nach der Injektion, das eine Ansammlung dunkler (reflexionsarmer) Flüssigkeit und kleiner heller (echogener) Luftblasen an der Injektionsstelle zeigt (gestrichelte rote Linie). Der gelbe Pfeil zeigt die Nadelspitze an. (C) Nadelplatzierung (gelber Pfeil an der Nadelspitze) zur Injektion des linken Thymuslappens einer immunkompetenten jungen Maus. (D) Nadelplatzierung (gelber Pfeil) zur Injektion des rechten Lappens einer immunkompetenten jungen Maus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: In-vivo- und Ex-vivo-Überprüfung der Genauigkeit. (A) Injektion von D-Luciferin (0,1 μg/10 μL) in den Thymus einer 8 Wochen alten luziferase-transgenen Maus, gefolgt von 1 s In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung unter Verwendung eines In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebungssystems (n = 3). Die Farbkodierung zeigt die gesamte Biolumineszenz-Strahldichte (Photonen·s−1·cm−2·steradian−1), wie durch den Farbbalken rechts angegeben. (B) Dem Thymus von zwei 5 Wochen alten C57BL/6-Mäusen wurde Trypanblau injiziert, und die Injektionsgenauigkeit wurde durch Nekropsie nachgewiesen (n = 3). Oberseite: Dorsale Oberfläche eines Trypan Blue-gefärbten injizierten Thymus in situ. Unteres Bild: Ventrale Oberfläche eines Trypan Blau gefärbten Thymus ex situ nach Injektion des linken Lappens. Reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Tuckett et al.1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eine ultraschallgeführte Freihandinjektion ist eine hochgenaue Technik, um Studienmaterialien effizient und aseptisch an den Thymus zu liefern. Nach der ersten Sterilisation der Haut an der Injektionsstelle bleibt die Sterilität während des Verfahrens durch die Verwendung von sterilen Handschuhen, sterilen Ultraschallsondenabdeckungen und sterilem Ultraschallgel erhalten. Im Gegensatz zum blinden perkutanen Ansatz 10,17 oder dem Einsatz chirurgischer Schnitte zur direkten Visualisierung des Thymus18,19, die die häufig verwendeten Methoden für intrathymische Injektionen bei Mäusen sind, kombiniert die Verwendung von Freihand-Ultraschallführung ein hohes Maß an Sicherheit und Schnelligkeit mit enormer Präzision des Verfahrens. Die Durchführung ultraschallgeführter Injektionen unter Verwendung der Schienenplattform14 bietet ein ähnliches Maß an Sicherheit und Genauigkeit, aber dieser umständliche Ansatz dauert typischerweise mindestens 5 Minuten pro Injektion ab dem Zeitpunkt, an dem die Maus betäubt und auf der Bildgebungsplattform positioniert wurde, verglichen mit der Freihandtechnik, die es einem Experten ermöglicht, Injektionen in etwa 20-30 s pro Mausabzuschließen 15.
Umfangreiche Erfahrung und Ausbildung sind Voraussetzung für ein hohes Leistungsniveau in allen verschiedenen Methoden der intrathymischen Injektion, einschließlich der ultraschallgeführten Freihandinjektionstechnik. Ein Radiologe mit klinischer Erfahrung in ultraschallgeführten Verfahren kann jedoch innerhalb einer 1-stündigen Übungssitzung die intrathymische Injektion von Mäusen beherrschen.
Die Flexibilität der Freihandinjektionsmethode ermöglicht es dem Prüfarzt, je nach den spezifischen experimentellen Anforderungen der Studie entweder einen Thymuslappen, beide Thymuslappen in einem Injektionsdurchgang oder beide Thymuslappen in zwei separaten Injektionen zu injizieren. Bemerkenswert ist, dass die Injektion einzelner Thymuslappen mit Placebo im Vergleich zu Studienmaterial als Strategie verwendet werden kann, um die Anzahl der benötigten Studienteilnehmer zu reduzieren, indem der Placebo-injizierte Lappen als interne Kontrolle verwendet wird. Im Gegensatz dazu ermöglicht der starre Aufbau des integrierten Schienensystems eine Injektion in einen Thymuslappen pro Injektionsperiode. Die Injektion eines zweiten Lappens würde es erfordern, den Aufsatz des Spritzenhalters zu demontieren, ihn auf der Rückseite der Maus zu installieren und die Mikromanipulationskontrollen sorgfältig anzupassen, bis die Flugbahn der Nadel korrekt ist, bevor die nächste Injektion fortgesetzt werden kann. Diese Probleme erhöhen die Anästhesiebelastung und die Zeit, die benötigt wird, um das Experiment abzuschließen, erheblich.
Ein einzigartiger Vorteil der intrathymischen Freihand-Ultraschallmethode im Vergleich zum blinden intrathymischen Injektionsverfahren ist die relative Leichtigkeit der genauen Injektion kleiner Thymusen wie die Thymusen älterer Mäuse (6 Monate oder älter), die viel kleiner sind als die bei jüngeren Mäusen (4-10 Wochen alt). Dieser Vorteil, kombiniert mit der einfachen Skalierung, ermöglicht es Immunologen, intrathymische injektionsbasierte Studien in einer Vielzahl von präklinischen Mausmodellen durchzuführen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Beobachtungen reichlich Beweise liefern, die die Freihandtechnik für sichere, schnelle und präzise Injektionen auf einzelne Thymuslappen unterstützen. Diese minimal-invasive Methode stellt daher eine hocheffiziente und genaue Option für die Thymusforschung dar und ermöglicht groß angelegte präklinische Untersuchungen an Mäusen mit Thymus von groß bis extrem klein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken Raymond H. Thornton für seine aufschlussreichen und umfassenden frühen Arbeiten zu dieser Technik. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), der Children's Leukemia Research Association, der Hackensack Meridian School of Medicine und der HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
- Chinn, I. K., Blackburn, C. C., Manley, N. R., Sempowski, G. D. Changes in primary lymphoid organs with aging. Seminars in Immunology. 24 (5), 309-320 (2012).
- Gruver, A. L., Sempowski, G. D. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy. Journal of Leukocyte Biology. 84 (4), 915-923 (2008).
- Masopust, D., Sivula, C. P., Jameson, S. C. Of mice, dirty mice, and men: Using mice to understand human immunology. Journal of Immunology. 199 (2), 383-388 (2017).
- Mukherjee, P., Roy, S., Ghosh, D., Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animals Research. 38 (1), 18 (2022).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: What have we learned from mice. Seminars in Immunopathology. 30 (4), 399-409 (2008).
- Zlotoff, D. A., et al. CCR7 and CCR9 together recruit hematopoietic progenitors to the adult thymus. Blood. 115 (10), 1897-1905 (2010).
- Vukmanovic, S., Grandea, A. G., Faas, S. J., Knowles, B. B., Bevan, M. J. Positive selection of T-lymphocytes induced by intrathymic injection of a thymic epithelial cell line. Nature. 359 (6397), 729-732 (1992).
- Schwarz, B. A., Bhandoola, A. Circulating hematopoietic progenitors with T lineage potential. Nature Immunology. 5 (9), 953-960 (2004).
- Marodon, G., et al. Induction of antigen-specific tolerance by intrathymic injection of lentiviral vectors. Blood. 108 (9), 2972-2978 (2006).
- Adjali, O., et al. In vivo correction of ZAP-70 immunodeficiency by intrathymic gene transfer. Journal of Clinical Investigation. 115 (8), 2287-2295 (2005).
- Tuckett, A. Z., et al. Image-guided intrathymic injection of multipotent stem cells supports life-long T cell immunity and facilitates targeted immunotherapy. Blood. 123 (18), 2797-2805 (2014).
- Tuckett, A. Z., Thornton, R. H., O'Reilly, R. J., vanden Brink, M. R. M., Zakrzewski, J. L. Intrathymic injection of hematopoietic progenitor cells establishes functional T cell development in a mouse model of severe combined immunodeficiency. Journal of Hematology & Oncology. 10 (1), 109 (2017).
- Hogan, B. V., Peter, M. B., Shenoy, H. G., Horgan, K., Hughes, T. A.
- Blair-Handon, R., Mueller, K., Hoogstraten-Miller, S. An alternative method for intrathymic injections in mice. Laboratory Animals. 39 (8), 248-252 (2010).
- Tuckett, A. Z., Zakrzewski, J. L., Li, D., vanden Brink, M. R., Thornton, R. H. Free-hand ultrasound guidance permits safe and efficient minimally invasive intrathymic injections in both young and aged mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (4), 1105-1111 (2015).
- Küker, S., et al. The value of necropsy reports for animal health surveillance. BMC Veterinary Research. 14 (1), 191 (2018).
- Sinclair, C., Bains, I., Yates, A. J., Seddon, B. Asymmetric thymocyte death underlies the CD4:CD8 T-cell ratio in the adaptive immune system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2905-2914 (2013).
- Manna, S., Bhandoola, A.
- de la Cueva, T., Naranjo, A., de la Cueva, E., Rubio, D.
