Aptamer-gebaseerde doeldetectie mogelijk gemaakt door een 3-traps G-Quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie

Summary

Het huidige protocol demonstreert het gebruik van een snelle, 3-traps, aptamer-gebaseerde exponentiële versterkingstest om doelen te detecteren. Monstervoorbereiding, signaalversterking en kleurontwikkeling worden behandeld om dit systeem te implementeren om de aanwezigheid van theofylline te herkennen boven die van cafeïne.

Abstract

Aptameren zijn doelherkenningsmoleculen die binden met een hoge affiniteit en specificiteit. Deze kenmerken kunnen worden gebruikt om andere moleculen met signaalgeneratievermogen te besturen. Voor het hierin beschreven systeem activeert doelherkenning via een aptamerisch domein, Stem II van een gemodificeerd hamerkopribozym, het zelfsplitsende ribozym door de aanvankelijk ongestructureerde constructie te stabiliseren. Het cis-splijtende RNA werkt op de kruising van Stem III en Stem I, waardoor twee splitsingsproducten ontstaan. Het langere splitsingsproduct primeert een isothermische exponentiële amplificatiereactie (EXPAR) van de twee vergelijkbaar katalytisch actieve G-quadruplexen. Die resulterende amplificatieproducten katalyseren peroxidasereductie, die is gekoppeld aan de reductie van een colorimetrisch substraat met een uitgang die het blote oog kan detecteren. Het 3-delige systeem dat in deze studie wordt beschreven, verbetert detectiemodaliteiten zoals enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's) door een visueel detecteerbaar signaal te produceren voor het aangeven van de aanwezigheid van zo laag als 0,5 μM theofylline in slechts 15 minuten.

Introduction

Aptameren zijn typisch enkelstrengs DNA of RNA geselecteerd door een evolutionair proces met een hoge bindingsaffiniteit en specificiteit aan de gewenste doelen¹. Naast het bindingsvermogen kunnen aptameren worden gekoppeld aan en besturingsmotieven met signaaluitgangsfuncties^2,3, waardoor het signaal wordt versterkt en de gevoeligheid van het systeem wordt verbeterd. Het G-quadruplex isothermische exponentiële versterkingsreactie (GQ-EXPAR) systeem is een driedelig systeem (figuur 1) dat een visueel signaal ontwikkelt als opeenvolgende componenten worden toegevoegd aan een enkel reactievat om een visuele output^{te produceren 4}. Dit systeem maakt de detectie van een specifiek doelwit, hierin theofylline, in een bepaald monster binnen 15 minuten mogelijk met behulp van een gestroomlijnde workflow om snelle, specifieke detectie van een interessant doelwit mogelijk te maken. Deze methode moet worden overwogen voor monsters waarbij een specifieke kwantificering van de doelconcentratie een lager belang heeft dan een hoge specificiteit van de respons in een korte tijd.

Een allosterische riboswitch, een structuurveranderend RNA-molecuul (ribozym) dat zelfsplitsing ondergaat, produceert het initiële signaal. Deze constructie is gebaseerd op het hamerhaairibozym, met een aptamerisch domein geïntroduceerd in Stem II als regulator van splitsingsactiviteit. De zelfsplitsingsfunctie wordt geactiveerd wanneer het aptamere domein wordt gestabiliseerd bij binding aan zijn doel⁵. Anders is de switch inactief in de oorspronkelijke staat.

De daaropvolgende exponentiële amplificatiereactie (EXPAR) gebruikt de afgifte van de zelfgesplitste RNA-streng uit de eerste fase om een isotherme amplificatiereactie te primen⁶. Het amplificatieproduct van EXPAR heeft peroxidase-activiteit⁷, die fungeert als basis voor de laatste fase van het systeem. Wanneer sommige substraten worden geoxideerd in combinatie met peroxideafbraak, produceren ze een fluorescerende output die kan worden gemeten op verschillende instrumenten. Andere veel voorkomende substraten kunnen worden vervangen om een gekleurd product te produceren voor visuele detectie. EXPAR en de peroxidase-activiteit van zijn amplificatieproducten fungeren als een 2-traps signaalversterker, waardoor de gevoeligheid tot grotere niveaus wordt verhoogd in vergelijking met conventionele strategieën ^7,8.

De detectie van theofylline versus cafeïne wordt gebruikt als een voorbeeld van de specificiteit van dit detectieplatform, omdat ze slechts door een enkele methylgroep verschillen (figuur 2). Deze demonstratie van het systeem produceert een colorimetrische output voor visuele detectie van ten minste 500 nM theofylline.

Protocol

Zie aanvullende tabel 1 (de tabel met de reactieopstelling) voor de buisvoorbereiding, met inbegrip van de specifieke volumes en concentraties van de reactiecomponenten. Het hier gedemonstreerde protocol maakt gebruik van een voorgemonteerde detectieplatformkit zoals beschreven in de materiaaltabel. Alle onderdelen moeten op ijs worden bewaard, tenzij anders aangegeven.

1. Bereiding van ribozym

OPMERKING: De primaire detectiecomponent is een allosterisch (aptamer-gereguleerd) ribozym dat theofylline herkent (zie aanvullende tabel 2).

1. Verzamel 5 U T4 polynucleotidekinase (0,5 μL, zie materiaaltabel) in een PCR-buis, die zal worden gebruikt om de ribozymsplitsingsproducten te activeren.
   OPMERKING: Deze component wordt eerst toegevoegd, zodat de gebruiker de juiste dosering van het enzym kan zien.
2. Voeg 1 μL vooraf voorbereide 5x ribozymbuffer (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis (PCR-buis).
3. Om de specificiteit visueel aan te tonen, voegt u 1,5 μl 2 mM theofylline (doel) of 2 mM cafeïne (controle) (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis als de testmonsters.
   OPMERKING: Voor het vaststellen van een standaardcurve wordt aanbevolen om te beginnen bij 3,125 mM analyt en vijfvoudige verdunningen te testen tot 0,001 mM.
4. Meng elke monsterbuis grondig door 5-10 keer te pipetteren.
5. Voeg 2 μL 600 nM RNA met een aptamerisch domein specifiek voor het doelwit (zie tabel met materialen) toe aan elke monsterbuis om een eindconcentratie van 240 nM in 5 μL testoplossing te maken, meng vervolgens snel door pipetteren en plaats op een koud blok om het achtergrondsignaal te minimaliseren.
   OPMERKING: het is belangrijk om in eerste instantie alle reacties zonder ribozym voor te bereiden, omdat de zelfsplitsingsreactie onmiddellijk zal beginnen wanneer ribozym wordt gecombineerd met ribozymbuffer en een significante achtergrond kan produceren.
6. Zodra alle reactiebuizen zijn voorbereid, incubeer u elk monster (5 μL) bij kamertemperatuur (23 °C) gedurende precies 3 minuten met behulp van een timer. Breng de monsterbuizen na incubatie onmiddellijk terug naar ijs (4 °C).

2. GQ-EXPAR

1. Voeg 3,5 μL nickase-polymerase-enzymmengsel (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis en meng goed.
   OPMERKING: De vereiste enzymconcentraties zijn afhankelijk van de herkenningssequenties, soorten enzymen en reactietemperaturen, waarvan de combinatie empirisch is bepaald.
2. Voeg 31,5 μl expar reactiemengsel met sjabloon, nucleotiden en reactiebuffer (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis en pipet om te mengen.
   OPMERKING: De componentconcentraties zijn geoptimaliseerd op basis van de enzymen en sequenties van de polymeraseproducten.
3. Zodra alle monsters zijn bereid, incubeert u elk bereid monster (40 μL) bij 55 °C gedurende precies 5 minuten met behulp van een timer. Incubeer indien mogelijk op een thermocycler, hoewel een verwarmd deksel niet nodig is.
4. Breng de monsterbuizen na de incubatiestap onmiddellijk terug naar ijs (4 °C).

3. Kleurontwikkeling

1. Voeg 2 μL Hemin-oplossing (25 uM, zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis en meng goed.
2. Voeg 58 μL van de in de handel verkrijgbare TMB-oplossing (zie materiaaltabel) toe aan elke monsterbuis en meng goed.
3. Incubeer de kleurontwikkelingsreactie (100 μL) bij kamertemperatuur gedurende ten minste 3 minuten en maximaal 30 minuten.
   OPMERKING: (Optioneel) Kleurontwikkeling kan worden gestopt door 20 μL 2 M zwavelzuur toe te voegen.
4. Lees de monsters kwalitatief met het oog of kwantificeer de resultaten met behulp van een absorptieplaatlezer bij 450 nm als de kleurontwikkelingsreacties worden gestopt met zwavelzuur.

Representative Results

Het detectieplatform in figuur 1 zet aptamere doelherkenning in korte tijd om in visueel onderscheiden verschillen tussen de monsterpreparaten (doel versus niet-doel, figuur 2). Een allosterisch ribozym geïdentificeerd door Soukup et ^al.5 diende als uitgangspunt voor het creëren van een minder luidruchtige sequentie met respons op het doelwit over de controle en negatieve monsters. De geoptimaliseerde constructie was in staat om slechts 500 nM theofylline in 30 minuten te herkennen (figuur 3) - monsterpreparaten die aan het doelwit werden blootgesteld, produceren een blauwe kleur in stap 3, terwijl monsters die geen doel bevatten kleurloos blijven. Indien nodig kunnen deze resultaten worden gekwantificeerd door eerst de kleurontwikkelingsreactie te stoppen zoals beschreven in stap 3.4 en vervolgens de absorptie van het resulterende product bij 450 nm af te lezen om de initiële concentratie van het aanwezige doelwit te meten. Typische resultaten van dit proces zijn weergegeven in tabel 1, die kan worden aangepast aan een niet-lineaire regressie om de concentratie van het doelwit in het oorspronkelijke monster kwantitatief te schatten (figuur 4).

Figuur 1: Het GQ-EXPAR systeem. Mechanismen van het detectie- en signaalversterkingssysteem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Aptamer target en counter-target. Moleculaire structuur van theofylline (target) en cafeïne (counter-target control) als demonstratie van specificiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: GQ-EXPAR visuele resultaten. Representatieve resultaten van het systeem voor het detecteren van verschillende concentraties theofylline na 3 min en 30 min kleurontwikkeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve theofylline standaardcurve. Standaardcurve van het systeemsignaal gemeten bij A450 na 30 minuten kleurontwikkeling. Ruwe gegevens zijn weergegeven in tabel 1, N = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

[Theofylline] (mM)	Proef 1 (A450)	Proef 2 (A450)	Proef 3 (A450)	Gemiddeld (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Geen Ribozyme	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tabel 1: Representatieve theoretische standaardcurve ruwe gegevens. Resultaten van het systeem voor het detecteren van verschillende concentraties theofylline na 30 minuten kleurontwikkeling. No-ribozyme monsters werden ook beoordeeld, N = 3.

Aanvullende tabel 1: GQ-EXPAR setup. Samenvatting van de GQ-EXPAR reagensvolumes en volgorde van toevoeging zoals beschreven in het protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: GQ-EXPAR oligonucleotidesequenties. Sequenties van de DNA- en RNA-moleculen die worden gebruikt in de detectiereacties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van de overgang tussen een aanvankelijk ongeordende secundaire structuur in een allosterisch ribozym en de extra stabiliteit die wordt verleend door de binding van het doelwit aan het aptamere domein om het cis-splitsende hamerhaairibozym te activeren. De stabiliteit van het ribozym werd aangepast om katalytische activiteit te minimaliseren in afwezigheid van het doelwit, terwijl doelbinding de actieve structuur kon herstellen. Bovendien moet ervoor worden gezorgd dat de buffers van de meerdere enzymen die nodig zijn voor het vergemakkelijken van de EXPAR en kleurontwikkeling in evenwicht worden gebracht. Ten slotte, gezien het feit dat dit een 3-traps systeem is, betekende de combinatie van incubatietijden en temperaturen naast de concentraties van de reactiecomponenten dat het maximaliseren van het signaal terwijl ruis werd geminimaliseerd geen kleine uitdaging was.

Tijdens de bereiding van het ribozym (stap 1) stabiliseert doelbinding aan het aptamere domein de structuur van het zelfsplitsende ribozym. Desondanks zal het ribozym in staat zijn om te klieven zodra het in de ribozymbuffer is geïntroduceerd, zelfs als er geen doelwit is. Om het achtergrondsignaal te minimaliseren, is het dus van vitaal belang om de reacties op ijs te houden totdat ze klaar zijn voor de gedefinieerde incubatie. De succesvolle binding van het doelwit aan het aptamere domein en de resulterende splitsingsgebeurtenis produceren twee splitsingsproducten, zoals afgebeeld in figuur 1, fase 1: een kort segment van stam I en een nieuw blootgesteld segment van stam III met een terminale cyclische fosfaat⁸. Het T4 polynucleotidekinase in de monstermix verwijdert het cyclische fosfaat uit het Stem III-splitsingsproduct, dat fungeert als een primer voor de amplificatiereactie in stadium 2. De concentraties en volumes van de reagentia die in dit systeem worden gebruikt, zijn geoptimaliseerd op basis van experimenten om het achtergrondsignaal versus specifieke respons⁴ te evalueren en moeten worden geoptimaliseerd vanaf het punt waarop wijzigingen worden aangebracht. Bovendien wordt 3,125 mM theofylline aanbevolen als de hoogste concentratie voor het vaststellen van een standaardcurve, aangezien de kleurontwikkeling als gevolg van dit monster dicht bij de maximaal mogelijke absorptie ligt bij 450 nm (figuur 4). Een niet-lineaire regressie door gewone kleinste kwadraten wordt gebruikt om de standaardcurve voor deze voorbereiding van het GQ-EXPAR-systeem te bepalen.

GQ-EXPAR, uitgevoerd in stap 2, maakt gebruik van twee DNA-sjablonen: een die wordt geprimed door het Stem III-splitsingsproduct en G-quadruplex produceert, en een die wordt geprimed door G-quadruplex en G-quadruplex produceert. De eerste reactie is belangrijker dan de laatste, omdat het vertalen van het Stem III-splitsingsproduct in G-quadruplexen noodzakelijk is om een colorimetrische uitgang te produceren, terwijl G-quadruplex zelfversterking het signaal verhoogt dat al aanwezig is. Bst 2.0 DNA-polymerase voert de isotherme amplificatie uit en heeft strengverplaatsingsactiviteit, terwijl Nt. BstNBI-nickase splitst voorafgaand aan de G-quadruplex-sequentie om Bst 2.0 in staat te stellen het eerder gegenereerde product te verdringen en meer G-quadruplex-amplicon te produceren. De buffer levert ook K⁺, waardoor het versterkingsproduct kan worden gevouwen in de actieve G-quadruplex-vorm. Verschillende nickases hebben verschillende herkenningssequenties voor binden en snijden, en specifieke enzymen zullen verschillende snij-efficiënties hebben; Het veranderen van de volgorde in de herkennings-/nickingsite vereist een wijziging in de nickase en het opnieuw optimaliseren van stap 2.

In stap 3 kunnen G-quadruplexen functioneren als DNAzymen met peroxidase-activiteit, vooral wanneer geassocieerd met hemine⁷. De reductie van peroxide gaat gepaard met oxidatie van het substraat zoals TMB om een detecteerbaar signaal te produceren voor visualisatie of kwantificering.

De belangrijkste beperking in dit systeem is de ruis die het allosterische ribozym kan genereren. Hoewel de actieve, zelfsplitsende structuur niet stabiel is in afwezigheid van het doelwit (in dit geval theofylline), heeft het RNA de mogelijkheid om verschillende configuraties te bemonsteren en kan het onbedoeld toegang krijgen tot de actieve configuratie⁴. Dit, in combinatie met de versterking van het signaal in fase 2 en fase 3, kan een vals positief signaal genereren. Het is dus van vitaal belang om de activiteit van het systeem zoveel mogelijk te verminderen door optimalisatie van de RNA-, buffer- en enzymhoeveelheden, evenals het minimaliseren van de incubatietijden en temperaturen om de productie van RNA-splitsingsgebeurtenissen te beperken die niet doelgemedieerd zijn.

Ondanks de moeilijkheid om een GQ-EXPAR workflow te optimaliseren, kan het systeem behoorlijk veelzijdig zijn als het eenmaal is opgezet. Verschillende aptamer-gecontroleerde allosterische ribozymen zijn al geïdentificeerd⁹ en kunnen worden geoptimaliseerd voor de gewenste functionaliteit⁵. Er is ook vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van allosterische DNAzymen gemoduleerd door aptameren¹⁰, waardoor de chemische stoffen die in dit platform kunnen worden geïntegreerd, worden uitgebreid. Deze opties voor het wijzigen van de doelherkenning van het systeem zijn niet geëvalueerd en zouden de focus zijn van toekomstige studies. Bovendien kunnen belangrijke componenten van het systeem worden uitgewisseld voor gelijkwaardige materialen met verschillende activiteitsvereisten, zoals lagere incubatietemperaturen voor het polymerase of verschillende herkenningssequenties voor de nickase. De flexibiliteit en modulariteit van dit systeem maken het mogelijk om zich aan te passen aan een breed scala aan ingangen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.