Detección de objetivos basada en aptámeros facilitada por una reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 etapas

Summary

El protocolo actual demuestra el uso de un ensayo de amplificación exponencial rápido, de 3 etapas, basado en aptámeros para detectar objetivos. La preparación de la muestra, la amplificación de la señal y el desarrollo del color están cubiertos para implementar este sistema para reconocer la presencia de teofilina sobre la de cafeína.

Abstract

Los aptámeros son moléculas de reconocimiento de objetivos que se unen con alta afinidad y especificidad. Estas características se pueden aprovechar para controlar otras moléculas con capacidad de generación de señales. Para el sistema descrito en este documento, el reconocimiento de objetivos a través de un dominio aptámero, Stem II de una ribozima de cabeza de martillo modificada, activa la ribozima autoescindida estabilizando la construcción inicialmente no estructurada. El ARN cis-escindido actúa en la unión de Stem III y Stem I, creando dos productos de escisión. El producto de escisión más largo prepara una reacción de amplificación exponencial isotérmica (EXPAR) de los dos G-cuádruples catalíticamente activos similares. Esos productos de amplificación resultantes catalizan la reducción de la peroxidasa, que se acopla a la reducción de un sustrato colorimétrico con una salida que el ojo desnudo puede detectar. El sistema de 3 partes descrito en el presente estudio mejora las modalidades de detección, como los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) al producir una señal visualmente detectable para indicar la presencia de teofilina tan baja como 0.5 μM en tan solo 15 minutos.

Introduction

Los aptámeros son típicamente ADN o ARN monocatenario seleccionados a través de un proceso evolutivo con alta afinidad y especificidad de unión a los objetivos deseados¹. Además de la capacidad de unión, los aptámeros pueden vincularse y controlar motivos con funciones de salida de señal^2,3, amplificando dicha señal y mejorando la sensibilidad del sistema. El sistema de reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex (GQ-EXPAR) es un sistema de tres partes (Figura 1) que desarrolla una señal visual a medida que se agregan componentes sucesivos a un solo recipiente de reacción para producir una salida visual⁴. Este sistema permite la detección de un objetivo específico, aquí teofilina, en una muestra dada dentro de los 15 minutos utilizando un flujo de trabajo simplificado para permitir la detección rápida y específica de un objetivo de interés. Este método debe considerarse para muestras en las que la cuantificación específica de la concentración objetivo sea menos preocupante que la alta especificidad de la respuesta en un corto período de tiempo.

Un riboswitch alostérico, una molécula de ARN que cambia de estructura (ribozima) que sufre autoescisión, produce la señal inicial. Esta construcción se basa en la ribozima cabeza de martillo, con un dominio aptámero introducido en Stem II como regulador de la actividad de escisión. Su función de autoescisión se activa cuando su dominio aptámero se estabiliza al unirse a su objetivo⁵. De lo contrario, el conmutador está inactivo en su estado nativo.

La reacción de amplificación exponencial posterior (EXPAR) utiliza la liberación de la cadena de ARN autoescindida desde la primera etapa para preparar una reacción de amplificación isotérmica⁶. El producto de amplificación de EXPAR tiene actividad peroxidasa⁷, actuando como base para la última etapa del sistema. Cuando algunos sustratos se oxidan junto con la descomposición del peróxido, producen una salida fluorescente que se puede medir en varios instrumentos. Otros sustratos comunes pueden ser sustituidos para producir un producto coloreado para la detección visual. EXPAR y la actividad peroxidasa de sus productos de amplificación actúan como un potenciador de señal de 2 etapas, aumentando la sensibilidad a mayores niveles en comparación con las estrategias convencionales ^7,8.

La detección de teofilina versus cafeína se utiliza como un ejemplo de la especificidad de esta plataforma de detección, ya que difieren en un solo grupo metilo (Figura 2). Esta demostración del sistema produce una salida colorimétrica para la detección visual de al menos 500 nM de teofilina.

Protocol

Consulte la Tabla suplementaria 1 (la tabla de configuración de reacción) para la preparación del tubo, incluidos los volúmenes y concentraciones específicos de los componentes de reacción. El protocolo que se muestra aquí utiliza un kit de plataforma de detección preensamblado como se describe en la Tabla de materiales. Todos los componentes deben mantenerse en hielo a menos que se indique lo contrario.

1. Preparación de ribozima

NOTA: El componente primario de detección es una ribozima alostérica (regulada por aptámero) que reconoce la teofilina (ver Tabla complementaria 2).

1. Recoja 5 U de polinucleótido quinasa T4 (0,5 μL, consulte la Tabla de materiales) en un tubo de PCR, que se utilizará para activar los productos de escisión de ribozima.
   NOTA: Este componente se agrega primero para que el usuario pueda ver la dispensación correcta de la enzima.
2. Agregue 1 μL de tampón de ribozima 5x preparado previamente (consulte la Tabla de materiales) a cada tubo de muestra (tubo de PCR).
3. Con el fin de demostrar visualmente la especificidad, añadir 1,5 μL de teofilina 2 mM (objetivo) o 2 mM de cafeína (control) (véase la Tabla de materiales) a cada tubo de muestra como muestras de ensayo.
   NOTA: Para establecer una curva estándar, se recomienda comenzar con un analito de 3.125 mM y probar diluciones de cinco veces hasta 0.001 mM.
4. Mezcle bien cada tubo de muestra pipeteando 5-10 veces.
5. Añadir 2 μL de ARN de 600 nM que contengan un dominio aptámero específico para el objetivo (ver Tabla de materiales) a cada tubo de muestra para obtener una concentración final de 240 nM en 5 μL de solución problema, luego mezclar rápidamente por pipeteo y colocar en un bloque frío para minimizar la señal de fondo.
   NOTA: es importante preparar inicialmente todas las reacciones sin ribozima, ya que la reacción de autoescisión comenzará inmediatamente cuando la ribozima se combine con el tampón de ribozima y puede producir antecedentes significativos.
6. Una vez preparados todos los tubos de reacción, incubar cada muestra (5 μL) a temperatura ambiente (23 °C) durante exactamente 3 min con un temporizador. Devolver inmediatamente los tubos de muestra a hielo (4 °C) después de la incubación.

2. GQ-EXPAR

1. Agregue 3.5 μL de mezcla de enzima nickasa-polimerasa (consulte la Tabla de materiales) a cada tubo de muestra y mezcle bien.
   NOTA: Las concentraciones requeridas de enzimas dependen de las secuencias de reconocimiento, los tipos de enzimas y las temperaturas de reacción, cuya combinación se determinó empíricamente.
2. Agregue 31.5 μL de mezcla de reacción EXPAR que contenga plantilla, nucleótidos y tampón de reacción (consulte la Tabla de materiales) a cada tubo de muestra y pipeta a mezclar.
   NOTA: Las concentraciones de los componentes se optimizan en función de las enzimas y secuencias de los productos de la polimerasa.
3. Una vez preparadas todas las muestras, incubar cada muestra preparada (40 μL) a 55 °C durante exactamente 5 min con un temporizador. Si es posible, incubar en un termociclador, aunque una tapa calentada es innecesaria.
4. Devolver inmediatamente los tubos de muestra al hielo (4 °C) después de la etapa de incubación.

3. Desarrollo del color

1. Añadir 2 μL de solución de hemina (25 uM, ver Tabla de materiales) a cada tubo de muestra y mezclar bien.
2. Añadir 58 μL de la solución TMB disponible en el mercado (ver Tabla de materiales) a cada tubo de muestra y mezclar bien.
3. Incubar la reacción de desarrollo del color (100 μL) a temperatura ambiente durante al menos 3 min y hasta 30 min.
   NOTA: (Opcional) El desarrollo del color se puede detener agregando 20 μL de ácido sulfúrico 2 M.
4. Lea las muestras cualitativamente a ojo, o cuantifique los resultados utilizando un lector de placas de absorbancia a 450 nm si las reacciones de desarrollo de color se detienen con ácido sulfúrico.

Representative Results

La plataforma de detección representada en la Figura 1 convierte el reconocimiento de objetivos aptámeros en diferencias visualmente distintas entre las preparaciones de la muestra (objetivo vs. no objetivo, Figura 2) en un corto período de tiempo. Una ribozima alostérica identificada por Soukup et ^al.5 sirvió como punto de partida para crear una secuencia menos ruidosa con respuesta al objetivo sobre las muestras control y negativas. La construcción optimizada fue capaz de reconocer tan poco como 500 nM teofilina en 30 minutos (Figura 3): las preparaciones de muestra expuestas al objetivo producen un color azul en el paso 3, mientras que las muestras que no contienen ningún objetivo permanecen incoloras. Si es necesario, estos resultados se pueden cuantificar deteniendo primero la reacción de desarrollo del color como se describe en el paso 3.4, y luego leyendo la absorbancia del producto resultante a 450 nm para medir la concentración inicial del objetivo presente. Los resultados típicos de este proceso se presentan en la Tabla 1, que puede ajustarse a una regresión no lineal para estimar cuantitativamente la concentración del objetivo presente en la muestra inicial (Figura 4).

Figura 1: El sistema GQ-EXPAR. Mecanismos del sistema de detección y amplificación de señales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Objetivo y contraobjetivo del aptámero. Estructura molecular de teofilina (diana) y cafeína (control contradiana) como demostración de especificidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Resultados visuales de GQ-EXPAR. Resultados representativos del sistema para detectar diversas concentraciones de teofilina después de 3 min y 30 min de desarrollo del color. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Curva estándar representativa de teofilina. Curva estándar de la señal del sistema medida en A450 después de 30 min de desarrollo del color. Los datos brutos se presentan en la Tabla 1, N = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

[Teofilina] (mM)	Ensayo 1 (A450)	Juicio 2 (A450)	Prueba 3 (A450)	Promedio (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Sin ribozima	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tabla 1: Datos brutos representativos de la curva estándar de teofilina. Resultados del sistema para detectar varias concentraciones de teofilina después de 30 min de desarrollo del color. También se evaluaron muestras sin ribozima, N = 3.

Tabla complementaria 1: Configuración de GQ-EXPAR. Resumen de los volúmenes de reactivos GQ-EXPAR y orden de adición como se describe en el protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 2: Secuencias de oligonucleótidos GQ-EXPAR. Secuencias de las moléculas de ADN y ARN utilizadas en las reacciones de detección. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El método presentado aquí aprovecha la transición entre una estructura secundaria inicialmente desordenada en una ribozima alostérica y la estabilidad adicional conferida a través de la unión del objetivo al dominio aptámero para activar la ribozima de cabeza de martillo cis-escindida. La estabilidad de la ribozima se ajustó para minimizar la actividad catalítica en ausencia del objetivo, al tiempo que permite la unión del objetivo para restaurar la estructura activa. Además, se debe tener cuidado para equilibrar los amortiguadores de las múltiples enzimas necesarias para facilitar el desarrollo de EXPAR y color. Finalmente, considerando que este es un sistema de 3 etapas, la combinación de tiempos de incubación y temperaturas junto con las concentraciones de los componentes de reacción significaba que maximizar la señal y minimizar el ruido no era un desafío menor.

Durante la preparación de la ribozima (paso 1), la unión del objetivo al dominio aptámero estabiliza la estructura de la ribozima autoescindida. A pesar de esto, la ribozima será capaz de escindirse una vez introducida en el tampón de ribozima, incluso en ausencia de un objetivo. Por lo tanto, para minimizar la señal de fondo, es vital mantener las reacciones en hielo hasta que estén listas para la incubación definida. La unión exitosa del objetivo al dominio aptámero y el evento de escisión resultante producen dos productos de escisión, como se muestra en la Figura 1, etapa 1: un segmento corto de Stem I y un segmento recién expuesto de Stem III con un fosfato cíclico terminal⁸. La quinasa polinucleótido T4 presente en la mezcla de muestra elimina el fosfato cíclico del producto de escisión Stem III, que actúa como cebador para la reacción de amplificación en la etapa 2. Las concentraciones y volúmenes de los reactivos utilizados en este sistema se optimizaron en base a experimentos para evaluar la señal de fondo frente a la respuesta específica⁴ y deberán optimizarse a partir de cualquier cambio puntual que se realice. Además, se recomienda 3.125 mM de teofilina como la concentración más alta para establecer una curva estándar, ya que el desarrollo del color resultante de esta muestra está cerca de la absorción máxima posible a 450 nm (Figura 4). Se utiliza una regresión no lineal por mínimos cuadrados ordinarios para determinar la curva estándar para esta preparación del sistema GQ-EXPAR.

GQ-EXPAR, llevado a cabo en el paso 2, utiliza dos plantillas de ADN: una que es cebada por el producto de escisión Stem III y produce G-quadruplex, y otra que es cebada por G-quadruplex y produce G-quadruplex. La primera reacción es más importante que la segunda, ya que es necesario traducir el producto de escisión Stem III en G-quadruplexes para producir una salida colorimétrica, mientras que la autoamplificación G-quadruplex aumenta la señal que ya está presente. La ADN polimerasa Bst 2.0 lleva a cabo la amplificación isotérmica y tiene actividad de desplazamiento de hebras, mientras que la Nt. BstNBI nickasa se escinde antes de la secuencia G-quadruplex para permitir que Bst 2.0 desplace el producto generado previamente y produzca más amplicón G-quadruplex. El tampón también suministra K ⁺, que permite que el producto de amplificación se pliegue en la forma activa G-quadruplex. Diferentes nickasas tienen diferentes secuencias de reconocimiento para unirse y cortar, y enzimas específicas tendrán diferentes eficiencias de corte; Cambiar la secuencia en el sitio de reconocimiento/nicking requerirá un cambio en la nickase y volver a optimizar el paso 2.

En el paso 3, los G-quadruplexes pueden funcionar como enzimas de ADN con actividad peroxidasa, especialmente cuando se asocian con hemina⁷. La reducción de peróxido se combina con la oxidación del sustrato como TMB para producir una señal detectable para visualización o cuantificación.

La limitación clave en este sistema es el ruido que puede generar la ribozima alostérica. Aunque la estructura activa de autoescisión no es estable en ausencia del objetivo (en este caso, teofilina), el ARN tiene la oportunidad de muestrear diferentes configuraciones y puede acceder inadvertidamente a la configuración activa⁴. Esto, combinado con la amplificación de la señal encontrada en la etapa 2 y la etapa 3, puede generar una señal falsa positiva. Por lo tanto, es vital reducir la actividad del sistema tanto como sea posible a través de la optimización de las cantidades de ARN, tampón y enzimas, así como minimizar los tiempos de incubación y las temperaturas para limitar la producción de eventos de escisión de ARN que no están mediados por el objetivo.

A pesar de la dificultad para optimizar un flujo de trabajo GQ-EXPAR, el sistema puede ser bastante versátil una vez establecido. Ya se han identificado varias ribozimas alostéricas controladas por aptámeros⁹ y pueden optimizarse para la funcionalidad deseada⁵. También se ha avanzado en el desarrollo de ADN alostérico modulado por aptámeros¹⁰, ampliando las químicas que pueden integrarse en esta plataforma. Estas opciones para modificar el reconocimiento de objetivos del sistema no se han evaluado y serían el foco de futuros estudios. Además, los componentes clave del sistema se pueden intercambiar por materiales equivalentes con diferentes requisitos de actividad, como temperaturas de incubación más bajas para la polimerasa o diferentes secuencias de reconocimiento para la nickasa. La flexibilidad y modularidad de este sistema le permiten adaptarse a una amplia gama de entradas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.