Summary
현재 프로토콜은 표적을 검출하기 위해 빠른 3단계 압타머 기반 지수 증폭 분석의 사용을 보여줍니다. 샘플 준비, 신호 증폭 및 색상 현상은 카페인보다 테오필린의 존재를 인식하기 위해 이 시스템을 구현하기 위해 다룹니다.
Abstract
압타머는 높은 친화력과 특이성으로 결합하는 표적 인식 분자입니다. 이러한 특성은 신호 생성 능력을 가진 다른 분자를 제어하는 데 활용할 수 있습니다. 본원에 기술된 시스템의 경우, 변형된 귀상어 리보자임의 앱타머 도메인, 줄기 II를 통한 표적 인식은 초기에 구조화되지 않은 구축물을 안정화시킴으로써 자가-절단 리보자임을 활성화시킨다. 시스 절단 RNA는 줄기 III와 줄기 I의 접합부에서 작용하여 두 개의 절단 산물을 생성합니다. 더 긴 절단 생성물은 두 개의 유사한 촉매 활성 G-쿼드러플렉스의 등온 지수 증폭 반응(EXPAR)을 프라이밍합니다. 이러한 결과 증폭 산물은 과산화효소 환원을 촉매하며, 이는 육안으로 감지할 수 있는 출력으로 비색 기질의 환원과 결합됩니다. 본 연구에 설명된 3파트 시스템은 0.5분 이내에 15μM의 낮은 테오필린의 존재를 나타내는 시각적으로 검출 가능한 신호를 생성하여 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)과 같은 검출 방식을 개선합니다.
Introduction
압타머는 전형적으로 원하는 표적에 대한 높은 결합 친화도 및 특이성을 갖는 진화적 과정을 통해 선택된 단일 가닥 DNA 또는 RNA이다1. 결합 능력에 더하여, 앱타머는 신호-출력 기능(2,3)으로 모티프에 연결되고 제어될 수 있으며, 상기 신호를 증폭하고 시스템의 감도를 향상시킬 수 있다. G-쿼드러플렉스 등온 지수 증폭 반응(GQ-EXPAR) 시스템은시각적 출력(4)을 생성하기 위해 연속적인 구성 요소가 단일 반응 용기에 추가될 때 시각적 신호를 발생시키는 세 부분으로 구성된 시스템(그림 1)입니다. 이 시스템은 관심 표적을 빠르고 구체적으로 검출할 수 있도록 간소화된 워크플로우를 사용하여 주어진 샘플에서 특정 표적(여기서는 테오필린)을 15분 이내에 검출할 수 있습니다. 이 방법은 목표 농도의 특정 정량화가 짧은 시간 내에 반응의 높은 특이성보다 낮은 관심사인 샘플에 대해 고려되어야 합니다.
자기 절단을 겪는 구조 전환 RNA 분자(리보자임)인 알로스테릭 리보스위치(allosteric riboswitch)가 초기 신호를 생성합니다. 이 구조는 귀상어 리보자임을 기반으로 하며, 절단 활성의 조절자로서 Stem II에 도입된 앱타머 도메인이 있습니다. 그것의 자기 분열 기능은 그것의 압타머 도메인이 그것의 표적에 결합할 때 안정화될 때 활성화된다5. 그렇지 않으면 스위치가 기본 상태에서 비활성 상태가 됩니다.
후속 지수 증폭 반응(EXPAR)은 첫 번째 단계에서 자가 절단된 RNA 가닥의 방출을 사용하여 등온 증폭 반응6을 프라이밍합니다. EXPR의 증폭 산물은 시스템의 마지막 단계의 기초로 작용하는 과산화효소 활성7을 갖는다. 일부 기질이 과산화물 분해와 함께 산화되면 다양한 기기에서 측정할 수 있는 형광 출력이 생성됩니다. 다른 일반적인 기질은 시각적 검출을 위한 착색된 생성물을 생산하기 위해 대체될 수 있다. EXPAR 및 이의 증폭 산물의 과산화효소 활성은 2단계 신호-증강제로서 작용하여, 종래의 전략에 비해 더 높은 수준에 대한 민감도를 증가시킨다 7,8.
테오필린 대 카페인의 검출은 단일 메틸기만 다르기 때문에 이 검출 플랫폼의 특이성의 예로 사용됩니다(그림 2). 이 시스템 시연은 최소 500nM 테오필린의 시각적 검출을 위한 비색 출력을 생성합니다.
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Protocol
반응 성분의 특정 부피 및 농도를 포함하는 튜브 준비에 대해서는 보충 표 1 (반응 설정표)을 참조하십시오. 여기에 설명된 프로토콜은 재료 표에 설명된 대로 사전 조립된 검출 플랫폼 키트를 사용합니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 구성 요소는 얼음 위에 보관해야 합니다.
1. 리보자임의 제조
참고: 1차 검출 성분은 테오필린을 인식하는 알로스테릭(압타머 조절) 리보자임입니다( 보충 표 2 참조).
- PCR 튜브에 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 5U(0.5μL, 재료 표 참조)를 수집하여 리보자임 절단 산물을 활성화하는 데 사용합니다.
알림: 이 구성 요소가 먼저 추가되어 사용자가 효소의 올바른 분배를 볼 수 있습니다. - 미리 준비된 5x 리보자임 완충액( 재료 표 참조) 1μL을 각 샘플 튜브(PCR 튜브)에 추가합니다.
- 특이성을 시각적으로 입증하기 위해 1.5μL의 2mM 테오필린(표적) 또는 2mM 카페인(대조군)( 재료 표 참조)을 각 샘플 튜브에 테스트 샘플로 추가합니다.
참고: 표준 곡선을 설정하려면 3.125mM 분석물에서 시작하여 0.001mM까지 5배 희석을 테스트하는 것이 좋습니다. - 각 샘플 튜브를 5-10회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
- 표적에 특이적인 앱타머 도메인을 포함하는 600nM RNA 2μL( 재료 표 참조)를 각 샘플 튜브에 추가하여 5μL의 테스트 용액에 240nM의 최종 농도를 만든 다음 피펫팅으로 빠르게 혼합하고 콜드 블록에 올려 배경 신호를 최소화합니다.
참고: 리보자임이 리보자임 완충액과 결합될 때 자가 절단 반응이 즉시 시작되고 상당한 배경을 생성할 수 있으므로 초기에 리보자임 없이 모든 반응을 준비하는 것이 중요합니다. - 모든 반응 튜브가 준비되면 타이머를 사용하여 각 샘플(5μL)을 실온(23°C)에서 정확히 3분 동안 배양합니다. 배양 후 즉시 샘플 튜브를 얼음(4°C)으로 되돌립니다.
2. GQ-익스프레스
- 3.5 μL의 nickase-polymerase 효소 혼합물( 재료 표 참조)을 각 샘플 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
참고: 필요한 효소 농도는 인식 서열, 효소 유형 및 반응 온도에 따라 달라지며, 이들의 조합은 경험적으로 결정되었습니다. - 주형, 뉴클레오티드 및 반응 완충액( 재료 표 참조)을 포함하는 EXPAR 반응 혼합물 31.5μL을 각 샘플 튜브와 피펫에 추가하여 혼합합니다.
참고: 성분 농도는 중합효소 생성물의 효소 및 서열에 따라 최적화됩니다. - 모든 샘플이 준비되면 타이머를 사용하여 정확히 5분 동안 55°C에서 준비된 각 샘플(40μL)을 배양합니다. 가능하면 가열 된 뚜껑이 필요하지 않지만 thermocycler에서 배양하십시오.
- 배양 단계 후 즉시 샘플 튜브를 얼음(4°C)으로 되돌립니다.
3. 발색
- 각 샘플 튜브에 2 μL의 헤민 용액 (25 uM, 재료 표 참조)을 넣고 잘 섞는다.
- 시중에서 판매되는 TMB 용액 58μL( 재료 표 참조)를 각 샘플 튜브에 넣고 잘 섞습니다.
- 발색 반응물(100μL)을 실온에서 최소 3분 및 최대 30분 동안 배양합니다.
참고: (선택 사항) 20μL의 2M 황산을 추가하여 발색을 중지할 수 있습니다. - 샘플을 눈으로 정성적으로 판독하거나 황산을 사용하여 발색 반응이 중단된 경우 450nm에서 흡광도 플레이트 리더를 사용하여 결과를 정량화합니다.
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Representative Results
그림 1 에 묘사된 검출 플랫폼은 앱타머 표적 인식을 단기간에 시료 전처리(표적 대 비표적, 그림 2) 간의 시각적으로 뚜렷한 차이로 변환합니다. Soukup et al.5 에 의해 확인된 알로스테릭 리보자임은 대조군 및 음성 샘플에 대한 표적에 대한 반응으로 덜 잡음이 적은 서열을 생성하기 위한 출발점 역할을 했습니다. 최적화된 구조는 30분 만에 500nM 테오필린(그림 3)만 인식할 수 있었는데, 표적에 노출된 시료 전처리는 3단계에서 파란색을 생성하는 반면, 표적이 포함되지 않은 시료는 무색으로 남습니다. 필요한 경우, 이러한 결과는 먼저 3.4 단계에 설명된 대로 발색 반응을 중지한 다음, 존재하는 표적의 초기 농도를 측정하기 위해 450nm에서 생성된 생성물의 흡광도를 판독함으로써 정량화될 수 있다. 이 공정의 전형적인 결과는 표 1에 제시되어 있으며, 이는 초기 샘플에 존재하는 표적의 농도를 정량적으로 추정하기 위해 비선형 회귀에 맞출 수 있습니다(그림 4).
그림 1: GQ-EXPAR 시스템. 탐지 및 신호 증폭 시스템의 메커니즘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 압타머 표적 및 카운터 표적. 특이성의 입증으로서의 테오필린(표적)과 카페인(counter-target control)의 분자 구조. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: GQ-EXPAR 시각적 결과. 발색 3분 및 30분 후 다양한 농도의 테오필린을 검출하는 시스템의 대표적인 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표적인 테오필린 표준물질 곡선. A450에서 30분 동안 발색한 후 측정한 시스템 신호의 표준 곡선입니다. 미가공 데이터는 표 1, N=3에 제시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| [테오필린] (밀리 미터) | 트라이얼 1 (A450) | 트라이얼 2 (A450) | 트라이얼 3 (A450) | 평균(A450) |
| 3.125 | 0.342 | 0.318 | 0.39 | 0.350 ± 0.0299 |
| 0.625 | 0.321 | 0.303 | 0.317 | 0.314 ± 0.00772 |
| 0.125 | 0.263 | 0.264 | 0.287 | 0.271 ± 0.0111 |
| 0.025 | 0.221 | 0.215 | 0.234 | 0.223 ± 0.00793 |
| 0.005 | 0.168 | 0.167 | 0.184 | 0.173 ± 0.00779 |
| 0.001 | 0.134 | 0.115 | 0.138 | 0.129 ± 0.0100 |
| 0 | 0.107 | 0.104 | 0.117 | 0.109 ± 0.00556 |
| 리보자임 없음 | 0.095 | 0.088 | 0.129 | 0.104 ± 0.0179 |
표 1: 대표적인 테오필린 표준물질 곡선 원시 데이터. 발색 30분 후 다양한 농도의 테오필린을 검출하기 위한 시스템의 결과. 리보자임 없음 샘플도 평가하였고, N=3이었다.
보충 표 1: GQ-EXPAR 설정. 프로토콜에 설명된 GQ-EXPAR 시약 부피 및 첨가 순서의 요약. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: GQ-EXPAR 올리고뉴클레오티드 서열. 검출 반응에 사용되는 DNA 및 RNA 분자의 서열. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 방법은 알로스테릭 리보자임에서 초기에 무질서한 2차 구조와 시스 절단 귀상어 리보자임을 활성화하기 위해 앱타머 도메인에 대한 표적의 결합을 통해 부여된 추가 안정성 사이의 전이를 이용합니다. 리보자임의 안정성은 표적 결합이 활성 구조를 복원하도록 허용하면서 표적의 부재 하에서 촉매 활성을 최소화하도록 조정되었다. 또한 EXPAR 및 발색을 촉진하는 데 필요한 여러 효소의 완충액의 균형을 맞추기 위해 주의를 기울여야 합니다. 마지막으로, 이것이 3단계 시스템이라는 점을 고려할 때, 반응 성분의 농도와 함께 배양 시간과 온도의 조합은 노이즈를 최소화하면서 신호를 최대화하는 것이 작은 도전이 아니라는 것을 의미했습니다.
리보자임의 제조 동안(단계 1), 앱타머 도메인에 대한 표적 결합은 자가-절단 리보자임의 구조를 안정화시킨다. 그럼에도 불구하고, 리보자임은 일단 리보자임 완충액에 도입되면, 표적이 없는 경우에도 절단할 수 있을 것이다. 따라서 배경 신호를 최소화하려면 정의된 배양 준비가 될 때까지 반응을 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다. 압타머 도메인에 대한 표적의 성공적인 결합 및 결과적인 절단 이벤트는 그림 1, 단계 1에 묘사된 바와 같이 두 개의 절단 생성물을 생성합니다: 줄기 I의 짧은 세그먼트 및 말단 고리형 인산염을 갖는 줄기 III의 새로 노출된 세그먼트8. 샘플 혼합물에 존재하는 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제는 2단계에서 증폭 반응을 위한 프라이머 역할을 하는 Stem III 절단 산물에서 고리형 인산염을 제거합니다. 이 시스템에 사용된 시약의 농도와 부피는 배경 신호 대특정 반응4 을 평가하기 위한 실험을 기반으로 최적화되었으며, 어떤 점 변경이 이루어지든 처음부터 최적화되어야 합니다. 또한 3.125mM 테오필린은 이 샘플에서 발생하는 발색이 450nm에서 가능한 최대 흡수에 가깝기 때문에 표준 곡선을 설정하기 위한 최고 농도로 권장됩니다(그림 4). 일반 최소 제곱에 의한 비선형 회귀는 GQ-EXPAR 시스템의 이러한 준비에 대한 표준 곡선을 결정하는 데 사용됩니다.
2단계에서 수행된 GQ-EXPAR은 두 개의 DNA 템플릿을 사용합니다: 하나는 Stem III 절단 산물에 의해 프라이밍되어 G-쿼드러플렉스를 생성하고, 다른 하나는 G-쿼드러플렉스에 의해 프라이밍되어 G-쿼드러플렉스를 생성합니다. 비색 출력을 생성하기 위해서는 Stem III 절단 산물을 G-사중으로 변환하는 것이 필요하고 G-사중체 자체 증폭은 이미 존재하는 신호를 증가시키기 때문에 전자의 반응이 후자보다 더 중요합니다. Bst 2.0 DNA 중합효소는 등온 증폭을 수행하고 가닥 변위 활성을 갖는 반면, Nt. BstNBI 니카제는 G-쿼드러플렉스 서열 이전에 절단되어 Bst 2.0이 이전에 생성된 생성물을 대체하고 더 많은 G-쿼드러플렉스 앰플리콘을 생성할 수 있도록 합니다. 버퍼는 또한 K+를 공급하여 증폭 산물이 활성 G-쿼드러플렉스 형태로 접힐 수 있도록 합니다. 다른 nickase는 결합 및 절단에 대한 다른 인식 서열을 가지며 특정 효소는 절단 효율이 다릅니다. 인식/니킹 부위에서 시퀀스를 변경하려면 Nickase를 변경하고 2단계를 다시 최적화해야 합니다.
3 단계에서, G- 쿼드러 플렉스는 특히 헤민7과 관련이있을 때 퍼 옥시다제 활성을 갖는 DNAzyme으로 기능 할 수 있습니다. 과산화물의 환원은 TMB와 같은 기질의 산화와 결합되어 시각화 또는 정량화를 위한 검출 가능한 신호를 생성합니다.
이 시스템의 주요 한계는 알로스테릭 리보자임이 생성할 수 있는 소음입니다. 활성, 자가 절단 구조는 표적(이 경우 테오필린)이 없을 때 안정적이지 않지만, RNA는 다른 구성을 샘플링할 수 있는 기회를 가지며 의도치 않게 활성 구성4에 접근할 수 있습니다. 이것은 2 단계와 3 단계에서 발견 된 신호의 증폭과 결합되어 거짓 양성 신호를 생성 할 수 있습니다. 따라서 RNA, 완충액 및 효소 양의 최적화를 통해 시스템의 활성을 최대한 줄이고 배양 시간과 온도를 최소화하여 표적 매개 되지 않는 RNA 절단 이벤트의 생성을 제한하는 것이 중요합니다.
GQ-EXPAR 워크플로우를 최적화하는 데 어려움이 있음에도 불구하고 시스템은 일단 구축되면 매우 다재다능할 수 있습니다. 다양한 압타머-제어 알로스테릭 리보자임이 이미 확인되었으며9 원하는 기능성5에 맞게 최적화될 수 있다. 또한 앱타머10에 의해 조절되는 알로스테릭 DNA자임 개발에 진전이 있어 이 플랫폼에 통합될 수 있는 화학 물질을 확장합니다. 시스템의 목표 인식을 변경하기위한 이러한 옵션은 평가되지 않았으며 향후 연구의 초점이 될 것입니다. 또한 시스템의 주요 구성 요소는 중합효소에 대한 낮은 배양 온도 또는 니카제에 대한 다른 인식 서열과 같은 다양한 활성 요구 사항을 가진 동등한 물질로 교환할 수 있습니다. 이 시스템의 유연성과 모듈성을 통해 광범위한 입력에 적응할 수 있습니다.
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Disclosures
Aptagen, LLC는 압타머 기반 검출 시스템을 직접 경험하고자 하는 사용자를 위해 GQ-EXPAR 데모 키트를 제조 및 판매합니다.
Acknowledgments
이 연구는 Aptagen LLC의 연구 개발 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution" | PerkinElmer | FOOD-1806-1000 | Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2. |
| 5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3. |
| 5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’ | Integrated DNA Technologies (IDT) | Custom | Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| 5x Ribozyme Buffer | Aptagen, LLC | N/A | 5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4. |
| Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit | Aptagen, LLC | GQ-EXPAR-TMB | The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group. |
| Bst 2.0 DNA polymerase | New England Biolabs | M0537S | Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B6003SVIAL | Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750-100G | Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1. |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447S | Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| EXPAR reaction mixture | Aptagen, LLC | N/A | 0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1. |
| Isothermal Amplification Buffer | New England Biolabs | B0537SVIAL | Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2. |
| MgCl2 | Amresco (VWR) | E525-500ML | Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3. |
| MJ PTC-100 Thermocycler | MJ Research, Inc. | PTC-100 | Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used. |
| N, N-Dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | 227056-100ML | Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1. |
| Nickase-polymerase Mix | Aptagen, LLC | N/A | Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1. |
| Nt.BstNBI | New England Biolabs | R0607S | Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1. |
| T4 Kinase Buffer | New England Biolabs | B0201SVIAL | Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes. |
| Tecan GENios FL | Tecan | Genios-FL TWT | Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results. |
| Theophylline | Sigma-Aldrich | T1633-50G | Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2. |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043-01000 | Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4. |
References
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