Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion

Summary

Das vorliegende Protokoll demonstriert die Verwendung eines schnellen, 3-stufigen, Aptamer-basierten exponentiellen Amplifikations-Assays zur Detektion von Targets. Probenvorbereitung, Signalverstärkung und Farbentwicklung werden behandelt, um dieses System zu implementieren, um das Vorhandensein von Theophyllin gegenüber dem von Koffein zu erkennen.

Abstract

Aptamere sind Zielerkennungsmoleküle, die mit hoher Affinität und Spezifität binden. Diese Eigenschaften können genutzt werden, um andere Moleküle mit der Fähigkeit zur Signalerzeugung zu steuern. Für das hier beschriebene System aktiviert die Zielerkennung durch eine aptamere Domäne, Stamm II eines modifizierten Hammerkopf-Ribozyms, das selbstspaltende Ribozym, indem das anfänglich unstrukturierte Konstrukt stabilisiert wird. Die cis-spaltende RNA wirkt an der Verbindungsstelle von Stamm III und Stamm I, wodurch zwei Spaltprodukte entstehen. Das längere Spaltprodukt führt zu einer isothermen exponentiellen Amplifikationsreaktion (EXPAR) der beiden ähnlichen katalytisch aktiven G-Quadruplexe. Diese resultierenden Amplifikationsprodukte katalysieren die Peroxidase-Reduktion, die mit der Reduktion eines kolorimetrischen Substrats mit einer Leistung gekoppelt ist, die mit bloßem Auge wahrgenommen werden kann. Das in der vorliegenden Studie beschriebene 3-teilige System verbessert Nachweismodalitäten wie Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), indem es in nur 15 Minuten ein visuell detektierbares Signal erzeugt, das das Vorhandensein von nur 0,5 μM Theophyllin anzeigt.

Introduction

Aptamere sind in der Regel einzelsträngige DNA oder RNA, die durch einen evolutionären Prozess mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität für die gewünschten Ziele ausgewählt werden¹. Zusätzlich zur Bindungsfähigkeit können Aptamere mit Motiven verknüpft werden und diese mit Signalausgangsfunktionen^2,3 steuern^, wodurch das Signal verstärkt und die Empfindlichkeit des Systems verbessert wird. Das G-Quadruplex-System der isothermen exponentiellen Verstärkungsreaktion (GQ-EXPAR) ist ein dreiteiliges System (Abbildung 1), das ein visuelles Signal entwickelt, wenn aufeinanderfolgende Komponenten zu einem einzigen Reaktionsgefäß hinzugefügt werden, um einen visuellen Ausgang⁴ zu erzeugen. Dieses System ermöglicht den Nachweis eines bestimmten Ziels, hierin Theophyllin, in einer gegebenen Probe innerhalb von 15 Minuten unter Verwendung eines optimierten Arbeitsablaufs, um eine schnelle, spezifische Detektion eines Ziels von Interesse zu ermöglichen. Diese Methode muss für Proben in Betracht gezogen werden, bei denen eine spezifische Quantifizierung der Zielkonzentration weniger besorgniserregend ist als eine hohe Spezifität der Reaktion in kurzer Zeit.

Ein allosterischer Riboschalter, ein strukturwechselndes RNA-Molekül (Ribozym), das sich selbst spaltet, erzeugt das initiale Signal. Dieses Konstrukt basiert auf dem Hammerhai-Ribozym, wobei in Stamm II eine aptamere Domäne als Regulator der Spaltaktivität eingeführt wurde. Seine Selbstspaltungsfunktion wird aktiviert, wenn seine aptamere Domäne bei der Bindung an sein Ziel^{stabilisiert wird 5}. Andernfalls ist der Switch in seinem nativen Zustand inaktiv.

Die anschließende exponentielle Amplifikationsreaktion (EXPAR) nutzt die Freisetzung des selbstgespaltenen RNA-Strangs aus der ersten Stufe, um eine isotherme Amplifikationsreaktion⁶ auszulösen. Das Amplifikationsprodukt von EXPAR hat die Peroxidaseaktivität⁷, die als Grundlage für die letzte Stufe des Systems dient. Wenn einige Substrate in Verbindung mit dem Peroxidabbau oxidiert werden, erzeugen sie eine Fluoreszenzleistung, die mit verschiedenen Geräten gemessen werden kann. Andere gängige Substrate können ersetzt werden, um ein farbiges Produkt für die visuelle Detektion herzustellen. EXPAR und die Peroxidaseaktivität seiner Amplifikationsprodukte wirken als 2-stufiger Signalverstärker, der die Empfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Strategien auf höhere Konzentrationen erhöht ^7,8.

Der Nachweis von Theophyllin im Vergleich zu Koffein wird als Beispiel für die Spezifität dieser Nachweisplattform verwendet, da sie sich nur um eine einzige Methylgruppe unterscheiden (Abbildung 2). Diese Demonstration des Systems erzeugt einen kolorimetrischen Ausgang für den visuellen Nachweis von mindestens 500 nM Theophyllin.

Protocol

Siehe Ergänzende Tabelle 1 (die Reaktionsaufbautabelle) für die Herstellung von Röhrchen, einschließlich der spezifischen Volumina und Konzentrationen der Reaktionskomponenten. Das hier demonstrierte Protokoll verwendet ein vormontiertes Detektionsplattform-Kit, wie in der Materialtabelle beschrieben. Alle Komponenten müssen auf Eis gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.

1. Herstellung von Ribozym

HINWEIS: Die primäre Nachweiskomponente ist ein allosterisches (Aptamer-reguliertes) Ribozym, das Theophyllin erkennt (siehe Ergänzende Tabelle 2).

1. Sammeln Sie 5 U T4-Polynukleotidkinase (0,5 μl, siehe Materialtabelle) in einem PCR-Röhrchen, das zur Aktivierung der Ribozym-Spaltprodukte verwendet wird.
   Anmerkungen: Diese Komponente wird zuerst hinzugefügt, damit der Benutzer die korrekte Abgabe des Enzyms sehen kann.
2. Geben Sie 1 μl vorbereiteten 5x Ribozympuffer (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen (PCR-Röhrchen).
3. Um die Spezifität visuell nachzuweisen, werden 1,5 μl 2 mM Theophyllin (Ziel) oder 2 mM Koffein (Kontrolle) (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen als Testproben gegeben.
   HINWEIS: Für die Erstellung einer Standardkurve wird empfohlen, bei 3,125 mM Analyt zu beginnen und fünffache Verdünnungen bis 0,001 mM zu testen.
4. Mischen Sie jedes Probenröhrchen gründlich, indem Sie 5-10 Mal pipettieren.
5. Geben Sie 2 μl 600 nM RNA mit einer für das Target spezifischen aptameren Domäne (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen, um eine Endkonzentration von 240 nM in 5 μl Testlösung zu erreichen, mischen Sie dann schnell durch Pipettieren und legen Sie es auf einen kalten Block, um das Hintergrundsignal zu minimieren.
   HINWEIS: Es ist wichtig, zunächst alle Reaktionen ohne Ribozym vorzubereiten, da die Selbstspaltungsreaktion sofort beginnt, wenn Ribozym mit Ribozympuffer kombiniert wird, und einen erheblichen Hintergrund erzeugen kann.
6. Sobald alle Reaktionsgefäße vorbereitet sind, inkubieren Sie jede Probe (5 μL) bei Raumtemperatur (23 °C) genau 3 Minuten lang mit einem Timer. Legen Sie die Probenröhrchen nach der Inkubation sofort wieder in Eis (4 °C) ein.

2. GQ-EXPAR

1. Geben Sie 3,5 μl Nickase-Polymerase-Enzymgemisch (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut.
   HINWEIS: Die erforderlichen Enzymkonzentrationen hängen von den Erkennungssequenzen, den Enzymtypen und den Reaktionstemperaturen ab, deren Kombination empirisch bestimmt wurde.
2. Geben Sie 31,5 μl EXPAR-Reaktionsmischung mit Templat, Nukleotiden und Reaktionspuffer (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und jede Pipette, um sie zu mischen.
   HINWEIS: Die Komponentenkonzentrationen sind auf der Grundlage der Enzyme und Sequenzen der Polymeraseprodukte optimiert.
3. Sobald alle Proben vorbereitet sind, inkubieren Sie jede vorbereitete Probe (40 μL) bei 55 °C genau 5 Minuten lang mit einem Timer. Wenn möglich, inkubieren Sie auf einem Thermocycler, obwohl ein beheizter Deckel nicht erforderlich ist.
4. Legen Sie die Probenröhrchen nach dem Inkubationsschritt sofort wieder in Eis (4 °C) ein.

3. Farbentwicklung

1. Geben Sie 2 μl Hemin-Lösung (25 μM, siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut.
2. Geben Sie 58 μl der handelsüblichen TMB-Lösung (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut.
3. Inkubieren Sie die Farbentwicklungsreaktion (100 μL) bei Raumtemperatur für mindestens 3 min und bis zu 30 min.
   Anmerkungen: (Optional) Die Farbentwicklung kann durch Zugabe von 20 μl 2 M Schwefelsäure gestoppt werden.
4. Lesen Sie die Proben qualitativ mit dem Auge ab oder quantifizieren Sie die Ergebnisse mit einem Absorptionsplatten-Lesegerät bei 450 nm, wenn die Farbentwicklungsreaktionen mit Schwefelsäure gestoppt werden.

Representative Results

Die in Abbildung 1 dargestellte Detektionsplattform wandelt die aptamerische Zielerkennung in kurzer Zeit in visuell deutliche Unterschiede zwischen den Probenpräparaten (Target vs. Nicht-Ziel, Abbildung 2) um. Ein allosterisches Ribozym, das von Soukup et ^al.5 identifiziert wurde, diente als Ausgangspunkt für die Erstellung einer weniger verrauschten Sequenz mit Reaktion auf das Target über die Kontroll- und Negativproben. Das optimierte Konstrukt war in der Lage, bereits 500 nM Theophyllin in 30 min zu erkennen (Abbildung 3) – Probenpräparate, die dem Target ausgesetzt waren, erzeugten in Schritt 3 eine blaue Farbe, während Proben, die kein Target enthielten, farblos blieben. Falls erforderlich, können diese Ergebnisse quantifiziert werden, indem zuerst die Farbentwicklungsreaktion gestoppt wird, wie in Schritt 3.4 beschrieben, und dann die Absorption des resultierenden Produkts bei 450 nm abgelesen wird, um die Anfangskonzentration des vorhandenen Ziels zu messen. Typische Ergebnisse dieses Prozesses sind in Tabelle 1 dargestellt, die an eine nichtlineare Regression angepasst werden kann, um die Konzentration des in der Ausgangsprobe vorhandenen Ziels quantitativ abzuschätzen (Abbildung 4).

Abbildung 1: Das GQ-EXPAR-System. Mechanismen des Detektions- und Signalverstärkungssystems. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Aptamer-Target und Counter-Target. Molekulare Struktur von Theophyllin (Target) und Koffein (Counter-Target-Kontrolle) als Nachweis der Spezifität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Visuelle Ergebnisse von GQ-EXPAR. Repräsentative Ergebnisse des Systems zur Detektion verschiedener Konzentrationen von Theophyllin nach 3 min und 30 min Farbentwicklung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Repräsentative Theophyllin-Standardkurve. Standardkurve des Systemsignals gemessen am A450 nach 30 min Farbentwicklung. Die Rohdaten sind in Tabelle 1, N = 3 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

[Theophyllin] (mM)	Versuch 1 (A450)	Versuch 2 (A450)	Versuch 3 (A450)	Durchschnittlich (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Kein Ribozym	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tabelle 1: Repräsentative Rohdaten der Theophyllin-Standardkurve. Ergebnisse des Systems zur Detektion verschiedener Konzentrationen von Theophyllin nach 30 min Farbentwicklung. Es wurden auch No-Ribozym-Proben untersucht, N = 3.

Ergänzende Tabelle 1: GQ-EXPAR-Setup. Zusammenfassung der GQ-EXPAR-Reagenzvolumina und Reihenfolge der Zugabe, wie im Protokoll beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: GQ-EXPAR-Oligonukleotidsequenzen. Sequenzen der DNA- und RNA-Moleküle, die in den Nachweisreaktionen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die hier vorgestellte Methode nutzt den Übergang zwischen einer anfänglich ungeordneten Sekundärstruktur in einem allosterischen Ribozym und der zusätzlichen Stabilität, die durch die Bindung des Ziels an die aptamere Domäne verliehen wird, um das cis-spaltende Hammerkopf-Ribozym zu aktivieren. Die Stabilität des Ribozyms wurde angepasst, um die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Targets zu minimieren und gleichzeitig die Bindung des Targets zur Wiederherstellung der aktiven Struktur zu ermöglichen. Darüber hinaus muss darauf geachtet werden, die Puffer der verschiedenen Enzyme auszugleichen, die für die Erleichterung des EXPAR und der Farbentwicklung erforderlich sind. Wenn man bedenkt, dass es sich um ein 3-stufiges System handelt, bedeutete die Kombination aus Inkubationszeiten und Temperaturen zusammen mit den Konzentrationen der Reaktionskomponenten, dass die Maximierung des Signals bei gleichzeitiger Minimierung des Rauschens keine kleine Herausforderung darstellte.

Während der Herstellung des Ribozyms (Schritt 1) stabilisiert die Targetbindung an die Aptamerdomäne die Struktur des selbstspaltenden Ribozyms. Trotzdem ist das Ribozym in der Lage, sich zu spalten, sobald es in den Ribozympuffer eingeführt wurde, auch wenn kein Ziel vorhanden ist. Um das Hintergrundsignal zu minimieren, ist es daher wichtig, die Reaktionen auf Eis zu legen, bis sie für die definierte Inkubation bereit sind. Die erfolgreiche Bindung des Ziels an die Aptamerdomäne und das daraus resultierende Spaltungsereignis erzeugen zwei Spaltprodukte, wie in Abbildung 1, Stadium 1 dargestellt: ein kurzes Segment von Stamm I und ein neu exponiertes Segment von Stamm III mit einem terminalen zyklischen Phosphat⁸. Die in der Probenmischung vorhandene T4-Polynukleotidkinase entfernt das zyklische Phosphat aus dem Stem-III-Spaltprodukt, das als Primer für die Amplifikationsreaktion in Stufe 2 dient. Die Konzentrationen und Volumina der in diesem System verwendeten Reagenzien wurden auf der Grundlage von Experimenten optimiert, um das Hintergrundsignal im Vergleich zur spezifischen Reaktion⁴ zu bewerten, und müssen ab jedem Punkt, an dem Änderungen vorgenommen werden, optimiert werden. Darüber hinaus wird 3,125 mM Theophyllin als höchste Konzentration für die Erstellung einer Standardkurve empfohlen, da die aus dieser Probe resultierende Farbentwicklung nahe an der maximal möglichen Absorption bei 450 nm liegt (Abbildung 4). Eine nichtlineare Regression durch gewöhnliche kleinste Quadrate wird verwendet, um die Standardkurve für diese Präparation des GQ-EXPAR-Systems zu bestimmen.

GQ-EXPAR, das in Schritt 2 durchgeführt wird, verwendet zwei DNA-Templates: eine, die durch das Spaltprodukt Stem III geprimt wird und G-Quadruplex produziert, und eine, die durch G-Quadruplex grundiert ist und G-Quadruplex produziert. Die erste Reaktion ist wichtiger als die letztere, da die Übersetzung des Spaltprodukts von Stem III in G-Quadruplexe notwendig ist, um eine kolorimetrische Ausgabe zu erzeugen, während die G-Quadruplex-Selbstverstärkung das bereits vorhandene Signal verstärkt. Die Bst 2.0 DNA-Polymerase führt die isotherme Amplifikation durch und hat eine Strangverdrängungsaktivität, während die Nt. BstNBI-Nickase vor der G-Quadruplex-Sequenz spaltet, damit Bst 2.0 das zuvor erzeugte Produkt verdrängen und mehr G-Quadruplex-Amplikon produzieren kann. Der Puffer liefert auch K⁺, wodurch sich das Amplifikationsprodukt in die aktive G-Quadruplex-Form falten kann. Verschiedene Nickasen haben unterschiedliche Erkennungssequenzen für Bindung und Schneiden, und bestimmte Enzyme haben unterschiedliche Schneideeffizienzen. Das Ändern der Reihenfolge in der Erkennungs-/Nicking-Site erfordert eine Änderung der Nickase und eine Neuoptimierung Schritt 2.

In Schritt 3 können G-Quadruplexe als DNAzyme mit Peroxidaseaktivität fungieren, insbesondere wenn sie mit Hämin⁷ assoziiert sind. Die Reduktion von Peroxid wird mit der Oxidation des Substrats wie TMB gekoppelt, um ein detektierbares Signal zur Visualisierung oder Quantifizierung zu erzeugen.

Die Haupteinschränkung in diesem System ist das Rauschen, das das allosterische Ribozym erzeugen kann. Obwohl die aktive, selbstspaltende Struktur in Abwesenheit des Ziels (in diesem Fall Theophyllin) nicht stabil ist, hat die RNA die Möglichkeit, verschiedene Konfigurationen abzutasten und kann versehentlich auf die aktive Konfiguration^{zugreifen 4}. In Kombination mit der Verstärkung des Signals in Stufe 2 und Stufe 3 kann dies ein falsch positives Signal erzeugen. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, die Aktivität des Systems so weit wie möglich zu reduzieren, indem die RNA-, Puffer- und Enzymmengen optimiert sowie die Inkubationszeiten und -temperaturen minimiert werden, um die Produktion von RNA-Spaltungsereignissen zu begrenzen, die nicht zielgerichtet vermittelt sind.

Trotz der Schwierigkeit, einen GQ-EXPAR-Workflow zu optimieren, kann das System, sobald es eingerichtet ist, sehr vielseitig sein. Verschiedene Aptamer-kontrollierte allosterische Ribozyme wurden bereits identifiziert⁹ und können für die gewünschte Funktionalität⁵ optimiert werden. Fortschritte wurden auch bei der Entwicklung allosterischer DNAzyme erzielt, die durch Aptamere¹⁰ moduliert werden, wodurch die Chemie, die in diese Plattform integriert werden kann, erweitert wurde. Diese Optionen zur Veränderung der Zielerkennung des Systems wurden noch nicht evaluiert und würden im Fokus zukünftiger Studien stehen. Darüber hinaus können Schlüsselkomponenten des Systems gegen äquivalente Materialien mit unterschiedlichen Aktivitätsanforderungen ausgetauscht werden, wie z. B. niedrigere Inkubationstemperaturen für die Polymerase oder unterschiedliche Erkennungssequenzen für die Nickase. Die Flexibilität und Modularität dieses Systems ermöglichen es, sich an eine Vielzahl von Eingängen anzupassen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.