Detecção de alvos baseada em aptâmero facilitada por uma reação de amplificação exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 estágios

Summary

O presente protocolo demonstra o uso de um ensaio rápido de amplificação exponencial baseado em aptâmeros de 3 estágios para detectar alvos. A preparação da amostra, a amplificação do sinal e o desenvolvimento da cor são abordados para implementar este sistema para reconhecer a presença de teofilina sobre a cafeína.

Abstract

Os aptâmeros são moléculas de reconhecimento de alvos que se ligam com alta afinidade e especificidade. Essas características podem ser aproveitadas para controlar outras moléculas com capacidade de geração de sinal. Para o sistema aqui descrito, o reconhecimento do alvo através de um domínio aptamérico, o Tronco II de uma ribozima de cabeça de martelo modificada, ativa a ribozima autoclivagante, estabilizando o construto inicialmente não estruturado. O RNA de clivagem cis atua na junção do Tronco III e do Tronco I, criando dois produtos de clivagem. O produto de clivagem mais longa prepara uma reação de amplificação exponencial isotérmica (EXPAR) dos dois G-quadruplexes cataliticamente ativos semelhantes. Esses produtos de amplificação resultantes catalisam a redução da peroxidase, que é acoplada à redução de um substrato colorimétrico com uma saída que o olho nu pode detectar. O sistema de 3 partes descrito no presente estudo melhora as modalidades de detecção, como ensaios imunoenzimáticos (ELISAs), produzindo um sinal visualmente detectável para indicar a presença de tão baixa quanto 0,5 μM de teofilina em apenas 15 minutos.

Introduction

Os aptâmeros são tipicamente DNA ou RNA de fita simples selecionados através de um processo evolutivo com alta afinidade e especificidade de ligação aos alvos^{desejados 1}. Além da capacidade de ligação, os aptâmeros podem ser ligados e controlar motivos com funções de saída de sinal^2,3, amplificando o referido sinal e melhorando a sensibilidade do sistema. O sistema G-quadruplex isothermal exponencial amplification reaction (GQ-EXPAR) é um sistema de três partes (Figura 1) que desenvolve um sinal visual à medida que componentes sucessivos são adicionados a um único vaso de reação para produzir uma saída visual⁴. Este sistema permite a detecção de um alvo específico, aqui teofilina, em uma determinada amostra dentro de 15 min usando um fluxo de trabalho simplificado para permitir a detecção rápida e específica de um alvo de interesse. Este método deve ser considerado para amostras em que a quantificação específica da concentração-alvo é uma preocupação menor do que a elevada especificidade da resposta num curto período de tempo.

Um riboswitch alostérico, uma molécula de RNA de mudança de estrutura (ribozima) que sofre autoclivagem, produz o sinal inicial. Este construto é baseado na ribozima martelo, com um domínio aptamérico introduzido no Tronco II como regulador da atividade de clivagem. Sua função de autoclivagem é ativada quando seu domínio aptamérico é estabilizado ao se ligar ao seu^alvo5. Caso contrário, o switch ficará inativo em seu estado nativo.

A reação de amplificação exponencial subsequente (EXPAR) utiliza a liberação da fita de RNA autoclivada do primeiro estágio para desencadear uma reação de amplificação isotérmica⁶. O produto amplificador do EXPAR possui atividade peroxidase⁷, atuando como base para o último estágio do sistema. Quando alguns substratos são oxidados em conjunto com a quebra de peróxido, eles produzem uma saída fluorescente que pode ser medida em vários instrumentos. Outros substratos comuns podem ser substituídos para produzir um produto colorido para detecção visual. O EXPAR e a atividade peroxidase de seus produtos de amplificação atuam como um intensificador de sinal em 2 estágios, aumentando a sensibilidade a níveis maiores em comparação com as estratégias convencionais ^7,8.

A detecção de teofilina versus cafeína é utilizada como exemplo da especificidade dessa plataforma de detecção, pois diferem por apenas um grupo metila (Figura 2). Esta demonstração do sistema produz uma saída colorimétrica para detecção visual de pelo menos 500 nM teofilina.

Protocol

Ver quadro suplementar 1 (quadro de configuração das reacções) para a preparação dos tubos, incluindo os volumes e concentrações específicos dos componentes da reacção. O protocolo aqui demonstrado utiliza um kit de plataforma de detecção pré-montado, conforme descrito na Tabela de Materiais. Todos os componentes devem ser mantidos no gelo, salvo indicação em contrário.

1. Preparação da ribozima

NOTA: O componente primário de detecção é uma ribozima alostérica (regulada por aptâmero) que reconhece teofilina (ver Tabela Suplementar 2).

1. Coletar 5 U de polinucleotídeo quinase T4 (0,5 μL, ver Tabela de Materiais) em um tubo de PCR, que será usado para ativar os produtos de clivagem de ribozimas.
   NOTA: Este componente é adicionado primeiro para que o usuário possa ver a distribuição correta da enzima.
2. Adicionar 1 μL de tampão de ribozima 5x pré-preparado (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra (tubo de PCR).
3. Para efeitos de demonstração visual da especificidade, adicionar 1,5 μL de teofilina 2 mM (alvo) ou 2 mM de cafeína (controlo) (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra como amostras de ensaio.
   NOTA: Para estabelecer uma curva padrão, recomenda-se iniciar com 3,125 mM de analito e testar diluições de cinco vezes até 0,001 mM.
4. Misture bem cada tubo de amostra pipetando 5-10 vezes.
5. Adicionar 2 μL de ARN de 600 nM contendo um domínio aptamérico específico para o alvo (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra para obter uma concentração final de 240 nM em 5 μL de solução de ensaio, em seguida, misturar rapidamente por pipetagem e colocar num bloco frio para minimizar o sinal de fundo.
   NOTA: é importante preparar inicialmente todas as reações sem ribozima, pois a reação de autoclivagem começará imediatamente quando a ribozima for combinada com tampão ribozima e pode produzir fundo significativo.
6. Uma vez preparados todos os tubos de reação, incubar cada amostra (5 μL) à temperatura ambiente (23 °C) por exatamente 3 min usando um temporizador. Devolver imediatamente os tubos de amostra ao gelo (4 °C) após a incubação.

2. GQ-EXPAR

1. Adicionar 3,5 μL de mistura enzimática nickase-polimerase (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra e misturar bem.
   NOTA: As concentrações enzimáticas necessárias dependem das sequências de reconhecimento, tipos de enzimas e temperaturas de reação, cuja combinação foi determinada empiricamente.
2. Adicionar 31,5 μL de mistura de reacção EXPAR contendo molde, nucleótidos e tampão de reacção (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra e pipeta a misturar.
   NOTA: As concentrações dos componentes são otimizadas com base nas enzimas e sequências dos produtos da polimerase.
3. Uma vez preparadas todas as amostras, incubar cada amostra preparada (40 μL) a 55 °C durante exactamente 5 minutos utilizando um temporizador. Se possível, incubar em um termociclador, embora uma tampa aquecida seja desnecessária.
4. Devolver imediatamente os tubos de amostra ao gelo (4 °C) após a etapa de incubação.

3. Desenvolvimento de cores

1. Adicionar 2 μL de solução de hemina (25 uM, ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra e misturar bem.
2. Adicionar 58 μL da solução de TMB comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) a cada tubo de amostra e misturar bem.
3. Incubar a reação de desenvolvimento de cor (100 μL) à temperatura ambiente por pelo menos 3 min e até 30 min.
   NOTA: (Opcional) O desenvolvimento da cor pode ser interrompido pela adição de 20 μL de ácido sulfúrico 2 M.
4. Leia as amostras qualitativamente a olho nu, ou quantifique os resultados usando um leitor de placas de absorbância a 450 nm se as reações de desenvolvimento de cor forem interrompidas usando ácido sulfúrico.

Representative Results

A plataforma de detecção representada na Figura 1 converte o reconhecimento do alvo aptamérico em diferenças visualmente distintas entre as preparações da amostra (alvo versus não-alvo, Figura 2) em um curto período de tempo. Uma ribozima alostérica identificada por Soukup et ^al.5 serviu como ponto de partida para a criação de uma sequência menos ruidosa com resposta ao alvo sobre as amostras controle e negativas. O construto otimizado foi capaz de reconhecer apenas 500 nM de teofilina em 30 min (Figura 3) - as preparações de amostra expostas ao alvo produzem uma cor azul na etapa 3, enquanto as amostras que não contêm nenhum alvo permanecem incolores. Se necessário, esses resultados podem ser quantificados primeiro interrompendo a reação de desenvolvimento de cor conforme descrito na etapa 3.4 e, em seguida, lendo a absorbância do produto resultante a 450 nm para medir a concentração inicial do alvo presente. Os resultados típicos desse processo são apresentados na Tabela 1, que pode ser ajustada a uma regressão não linear para estimar quantitativamente a concentração do alvo presente na amostra inicial (Figura 4).

Figura 1: O sistema GQ-EXPAR. Mecanismos do sistema de detecção e amplificação de sinais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Alvo e contra-alvo do Aptamer. Estrutura molecular da teofilina (alvo) e cafeína (controle contra-alvo) como demonstração de especificidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados visuais do GQ-EXPAR. Resultados representativos do sistema de detecção de várias concentrações de teofilina após 3 min e 30 min de desenvolvimento de cor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Curva padrão representativa da teofilina. Curva padrão do sinal do sistema medida em A450 após 30 min de desenvolvimento de cores. Os dados brutos estão apresentados na Tabela 1, N = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

[Teofilina] (mM)	Julgamento 1 (A450)	Julgamento 2 (A450)	Julgamento 3 (A450)	Média (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Sem Ribozyme	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tabela 1: Dados brutos representativos da curva padrão da teofilina. Resultados do sistema para detecção de várias concentrações de teofilina após 30 min de desenvolvimento da cor. Amostras sem ribozima também foram avaliadas, N = 3.

Tabela suplementar 1: Configuração do GQ-EXPAR. Resumo dos volumes de reagentes GQ-EXPAR e ordem de adição conforme descrito no protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 2: Sequências de oligonucleotídeos GQ-EXPAR. Sequências das moléculas de DNA e RNA utilizadas nas reações de detecção. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O método aqui apresentado aproveita a transição entre uma estrutura secundária inicialmente desordenada em uma ribozima alostérica e a estabilidade adicional conferida pela ligação do alvo ao domínio aptamérico para ativar a ribozima cis-cleave. A estabilidade da ribozima foi ajustada para minimizar a atividade catalítica na ausência do alvo, permitindo a ligação do alvo para restaurar a estrutura ativa. Além disso, deve-se tomar cuidado para equilibrar os tampões das múltiplas enzimas necessárias para facilitar o desenvolvimento do EXPAR e da cor. Finalmente, considerando que este é um sistema de 3 estágios, a combinação de tempos de incubação e temperaturas juntamente com as concentrações dos componentes da reação fez com que maximizar o sinal e minimizar o ruído não fosse um desafio pequeno.

Durante a preparação da ribozima (passo 1), a ligação do alvo ao domínio aptamérico estabiliza a estrutura da ribozima autoclivante. Apesar disso, a ribozima será capaz de clivar uma vez introduzida no tampão da ribozima, mesmo na ausência de um alvo. Assim, para minimizar o sinal de fundo, é vital manter as reações no gelo até que estejam prontas para a incubação definida. A ligação bem sucedida do alvo ao domínio aptamérico e o evento de clivagem resultante produzem dois produtos de clivagem, como mostrado na Figura 1, estágio 1: um segmento curto do Tronco I e um segmento recém-exposto do Tronco III com um fosfato cíclico terminal⁸. A polinucleotídeo quinase T4 presente na mistura de amostras remove o fosfato cíclico do produto da clivagem do Tronco III, que atua como primer para a reação de amplificação no estágio 2. As concentrações e volumes dos reagentes utilizados neste sistema foram otimizados com base em experimentos para avaliar o sinal de fundo versus a resposta específica⁴ e precisarão ser otimizados a partir de qualquer mudança pontual que seja feita. Além disso, teofilina 3.125 mM é recomendada como a maior concentração para o estabelecimento de uma curva padrão, uma vez que o desenvolvimento da cor resultante desta amostra é próximo da absorção máxima possível a 450 nm (Figura 4). Uma regressão não linear por mínimos quadrados ordinários é usada para determinar a curva padrão para esta preparação do sistema GQ-EXPAR.

O GQ-EXPAR, realizado na etapa 2, utiliza dois modelos de DNA: um que é preparado pelo produto de clivagem do Tronco III e produz G-quadruplex, e outro que é preparado por G-quadruplex e produz G-quadruplex. A primeira reação é mais importante do que a segunda, pois a tradução do produto da clivagem do Tronco III em G-quadruplexes é necessária para produzir uma saída colorimétrica, enquanto a auto-amplificação G-quadruplex aumenta o sinal já presente. A Bst 2.0 DNA polimerase realiza a amplificação isotérmica e tem atividade de deslocamento de fita, enquanto a nickase Nt. BstNBI cliva antes da sequência G-quadruplex para permitir que Bst 2.0 desloque o produto gerado anteriormente e produza mais amplicon G-quadruplex . O tampão também fornece K⁺, o que permite que o produto de amplificação se dobre na forma G-quadruplex ativa. Diferentes nickases têm diferentes sequências de reconhecimento para ligação e corte, e enzimas específicas terão diferentes eficiências de corte; Alterar a sequência no site de reconhecimento/nicking exigirá uma mudança no nickase e reotimizar a etapa 2.

Na etapa 3, os G-quadruplexes podem funcionar como DNAzymes com atividade de peroxidase, especialmente quando associados à hemina⁷. A redução do peróxido é acoplada com a oxidação do substrato como TMB para produzir um sinal detectável para visualização ou quantificação.

A principal limitação neste sistema é o ruído que a ribozima alostérica pode gerar. Embora a estrutura ativa de autoclivagem não seja estável na ausência do alvo (no caso, teofilina), o RNA tem a oportunidade de amostrar diferentes configurações e pode acessar inadvertidamente a configuração ativa⁴. Isso, combinado com a amplificação do sinal encontrado nos estágios 2 e 3, pode gerar um sinal falso positivo. Assim, é vital reduzir ao máximo a atividade do sistema por meio da otimização das quantidades de RNA, tampão e enzima, bem como minimizar os tempos e temperaturas de incubação para limitar a produção de eventos de clivagem de RNA que não são mediados por alvo.

Apesar da dificuldade em otimizar um fluxo de trabalho GQ-EXPAR, o sistema pode ser bastante versátil uma vez estabelecido. Várias ribozimas alostéricas controladas por aptâmeros já foram identificadas⁹ e podem ser otimizadas para a funcionalidade desejada⁵. Também houve progresso no desenvolvimento de DNAzymes alostéricos modulados por aptâmeros¹⁰, expandindo as químicas que podem ser integradas a esta plataforma. Essas opções para alterar o reconhecimento de alvos do sistema não foram avaliadas e seriam foco de estudos futuros. Além disso, componentes-chave do sistema podem ser trocados por materiais equivalentes com diferentes requisitos de atividade, como temperaturas de incubação mais baixas para a polimerase ou diferentes sequências de reconhecimento para a nickase. A flexibilidade e modularidade deste sistema permitem que ele se adapte a uma ampla gama de entradas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.