Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

مصدر وطريق تلوث قلويد بيروليزيدين في عينات الشاي

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64375
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1,3, 4, 3, 3, 1, 1
1Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province, School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, 2State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Agricultural University, 3Key Laboratory of Tea Quality and Safety & Risk Assessment, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture, 4Department of Molecular Biosciences and Bioengineering, University of Hawaii at Manoa

Summary

يصف هذا البروتوكول تلوث قلويدات بيروليزيدين (PAs) في عينات الشاي من الحشائش المنتجة للسلطة الفلسطينية في حدائق الشاي.

Abstract

تم العثور على قلويدات بيروليزيدين السامة (PAs) في عينات الشاي ، والتي تشكل تهديدا لصحة الإنسان. ومع ذلك ، ظل مصدر ومسار تلوث السلطة الفلسطينية في عينات الشاي غير واضح. في هذا العمل ، تم تطوير طريقة ماصة مدمجة مع UPLC-MS / MS لتحديد 15 PAs في الأعشاب Ageratum conyzoides L. ، A. conyzoides التربة الجذرية ، أوراق الشاي الطازجة ، وعينات الشاي المجفف . تراوح متوسط حالات التعافي بين 78٪ -111٪ ، مع انحرافات معيارية نسبية تتراوح بين 0.33٪ و 14.8٪. تم جمع خمسة عشر زوجا من عينات التربة الجذرية A. conyzoides و A. conyzoides و 60 عينة من أوراق الشاي الطازجة من حديقة شاي Jinzhai في مقاطعة Anhui ، الصين ، وتم تحليلها ل 15 PAs. لم يتم الكشف عن جميع المناطق المحمية ال 15 في أوراق الشاي الطازجة ، باستثناء إنترميدين-N-أكسيد (ImNO) وسينيسيونين (Sn). كان محتوى ImNO (34.7 ميكروغرام / كجم) أكبر من محتوى Sn (9.69 ميكروغرام / كجم). بالإضافة إلى ذلك ، تركز كل من ImNO و Sn في الأوراق الصغيرة لنبات الشاي ، بينما كان محتواها أقل في الأوراق القديمة. أشارت النتائج إلى أن المناطق المحمية في الشاي تم نقلها من خلال مسار أوراق الشاي الطازجة المنتجة للأعشاب الضارة في حدائق الشاي.

Introduction

كمستقلبات ثانوية ، تحمي قلويدات بيروليزيدين (PAs) النباتات من الحيوانات العاشبة والحشرات ومسببات الأمراض 1,2. حتى الآن ، تم العثور على أكثر من 660 PAs وأكاسيد PA-N (PANOs) ذات هياكل مختلفة في أكثر من 6000 نوع نباتي في جميع أنحاء العالم 3,4. توجد النباتات المنتجة للسلطة الفلسطينية بشكل رئيسي في عائلات Asteraceae و Boraginaceae و Fabaceae و Apocynaceae 5,6. تتأكسد المناطق المحمية بسهولة إلى قلويدات ديهيدروبيروليزيدين غير مستقرة ، والتي لها كهربية قوية ويمكن أن تهاجم النيوكليوفيليات مثل الحمض النووي والبروتينات ، مما يؤدي إلى نخر خلايا الكبد ، والانسداد الوريدي ، وتليف الكبد ، والاستسقاء ، وأعراض أخرى 7,8. الجهاز المستهدف الرئيسي لسمية السلطة الفلسطينية هو الكبد. يمكن أن تسبب المناطق المحمية أيضا سمية الرئة والكلى والأعضاء الأخرى والسمية المطفرة والمسرطنة والتنموية 9,10.

تم الإبلاغ عن حالات التسمم البشري والحيواني في العديد من البلدان من تناول الأعشاب التقليدية أو المكملات الغذائية أو الشاي الذي يحتوي على المناطق المحمية أو التلوث غير المباشر للأغذية مثل الحليب أو العسل أو اللحوم (السامة من ابتلاع المراعي التي تحتوي على المناطق المحمية)11،12،13. تشير نتائج الهيئة الأوروبية لسلامة الأغذية (EFSA) إلى أن مواد مثل الشاي (العشبي) هي مصدر مهم للتعرض البشري ل PAs / PANOs14. لا تنتج عينات الشاي المناطق المحمية ، في حين توجد النباتات المنتجة للمناطق المحمية بشكل شائع في حدائق الشاي (على سبيل المثال ، إميليا سونشيفوليا ، وسينيسيو أنغولاتوس ، وأجيراتوم كونيزويدس)15. كان يشتبه سابقا في أن الشاي يمكن أن يكون ملوثا بالمناطق المحمية من مصانعها المنتجة أثناء الانتقاء والمعالجة. ومع ذلك ، تم اكتشاف المناطق المحمية أيضا في بعض أوراق الشاي المنتقاة يدويا (أي عدم وجود نباتات منتجة للمناطق المحمية) ، مما يشير إلى أنه يجب أن تكون هناك طرق أو مصادر أخرى للتلوث16. أجريت تجربة زراعة مشتركة لنباتات الراجورت (Senecio jacobaea) مع ميليسا (ميليسا أوفيسيناليس) والنعناع (Mentha piperita) والبقدونس (Petroselinum crispum) والبابونج (Matricaria recutita) ونباتات nasturtium (Tropaeolum majus) ، وأظهرت النتائج أنه تم اكتشاف المناطق المحمية في جميع هذه النباتات17. تم التحقق من أن المناطق المحمية يتم نقلها وتبادلها بالفعل بين النباتات الحية عبر التربة18,19. وجد Van Wyk et al.20 أن شاي الرويبوس (Aspalathus linearis) كان ملوثا بشدة في المواقع الغنية بالأعشاب الضارة ويحتوي على مناطق محمية من نفس النوع والنسبة. ومع ذلك ، لم يتم الكشف عن أي مناطق محمية في شاي الرويبوس في مواقع خالية من الأعشاب الضارة.

في الوقت الحاضر ، تم استخدام قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC-MS / MS) مع انتقائية وحساسية عالية على نطاق واسع في التحليل النوعي والكمي للمناطق المحمية في المنتجات الزراعية والأغذية21,22. تتكون طريقة معالجة العينة عادة إما من استخراج الطور الصلب (SPE) أو تنظيف QuEChERS (سريع سهل رخيص فعال وفعال وآمن وعرة) لمستخلصات مصفوفات الطعام المعقدة ، والتي يمكن أن تحصل على أعلى حساسية ممكنة12,19. ومع ذلك ، لا تزال الطرق التحليلية القوية التي تسمح باكتشاف المناطق المحمية وتحديدها كميا في المصفوفات المعقدة مثل التربة والأعشاب الضارة وأوراق الشاي الطازجة مفقودة.

حللت هذه الدراسة 15 PAs في عينات الشاي المجفف وأوراق الشاي الطازجة والأعشاب الضارة وعينات التربة الجذرية للأعشاب الضارة باستخدام UPLC-MS / MS جنبا إلى جنب مع طريقة تنقية الممتزة. علاوة على ذلك ، تم جمع 15 عينة من تربة جذور الحشائش والأعشاب الضارة و 60 عينة من أوراق الشاي الطازجة من خمسة مواقع لأخذ العينات في حديقة شاي Jinzhai في مقاطعة Anhui ، الصين ، وتم تحليلها ل 15 PAs. يمكن أن توفر هذه النتائج طريقة مسح وبعض المعلومات حول مصدر ومسار المناطق المحمية (التلوث) في عينات الشاي لضمان جودة وسلامة الشاي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بالنسبة للدراسة الحالية ، تم جمع أنواع الحشائش التالية: لودفيجيا بروستاتا روكسب ، موردانيا تريكيترا (وول. سابقا سي بي كلارك) بروكن ، أجيراتوم كونيزويدس إل ، تشينوبوديوم أمبروسيويدس ، القصبة الهوائية ياسمينويد (L.) ليم ، أجيراتوم كونيزويدس إل ، إميليا سونشيفوليا (L.) DC ، Ageratum conyzoides L. ، و Crassocephalum crepidioides (القاع.) س. مور. تم اختيار أوراق الشاي الطازجة من مجموعة متنوعة من أشجار الشاي Longjing 43 # ، وكانت عينات الشاي المجفف متاحة تجاريا لمعالجة الشاي وفقا لعملية تصنيع الشاي الأخضر (انظر جدول المواد).

1. جمع العينات

  1. جمع 40 عينة حقيقية.
    1. اجمع 10 أعشاب و 10 تربة و 10 أوراق شاي طازجة بشكل عشوائي من حدائق شاي متعددة.
      ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم أخذ عينات من التربة على عمق 20 سم بكمية عينة 200 جم.
    2. اجمع بشكل عشوائي 10 منتجات شاي مجفف (250 جم) من سوبر ماركت.
  2. اجمع عينات من الحشائش والتربة وأوراق الشاي الطازجة لدراسة مصدر تلوث المناطق المحمية في الشاي.
    1. ضع خمس نقاط لأخذ العينات في نفس حديقة الشاي ، مع ثلاث نسخ متماثلة في كل نقطة.
    2. اجمع عينات الأعشاب الضارة Ageratum conyzoides L. التي تحتوي على أعلى محتوى PA الموجود عادة في حدائق الشاي.
      ملاحظة: كانت كمية العينة 250 جم للدراسة الحالية.
    3. جمع عينات التربة.
      ملاحظة: كانت عينات التربة عبارة عن تربة A. conyzoides الجذرية على عمق 20 سم مع كمية عينة 200 جم.
    4. اجمع أوراق الشاي الطازجة من أجزاء مختلفة من نباتات الشاي ، بما في ذلك برعم واحد بورقتين ، وبرعم واحد بثلاث أوراق ، وبرعم واحد بأربع أوراق ، وأوراق ناضجة.
      ملاحظة: كانت كمية العينة 250 جم.

2. علاج العينة

  1. قم بمعالجة العينات باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بطحن عينات الشاي والتربة المجففة بمطحنة ، وقم بتمرير العينات المسحوقة من خلال غربال 200 شبكة ، وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: كان الشاي المجفف منتجا تجاريا للشاي (انظر جدول المواد) ، لذلك تم سحقه وغربله مباشرة للتخزين. تم وضع عينات التربة (200 جم) في مكان جيد التهوية في الظلام لتجف في الهواء لمدة أسبوع تقريبا.
    2. تجانس الحشائش وأوراق الشاي الطازجة مع الخالط وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. قم بإجراء معالجة عينة من منتجات الشاي المجفف وأوراق الشاي الطازجة والأعشاب الضارة.
    1. قم بوزن 1.00 جم من كل عينة (منتجات الشاي المجفف وأوراق الشاي الطازجة والأعشاب الضارة) وضعها في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل.
    2. أضف 10 مل من محلول حمض الكبريتيك 0.1 مول / لتر ودوامة لمدة 2 دقيقة لاستخراج الطور الصلب (باستخدام خرطوشة SPE ، انظر جدول المواد) و 1 دقيقة لتنقية الممتزات. قم بإجراء الاستخراج بالموجات فوق الصوتية23 لمدة 15 دقيقة ، ثم الطرد المركزي لمدة 10 دقائق بسرعة 9390 × جم في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: كانت قوة المذبذب بالموجات فوق الصوتية 290 واط ، وكان تردد التذبذب 35 كيلو هرتز ، وتم ضبط درجة الحرارة على 30 درجة مئوية.
    3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام قطارة بلاستيكية.
    4. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه لتكرار الاستخراج مرة واحدة. الجمع بين اثنين من الطافات.
      1. قم بتنشيط خراطيش SPE باستخدام 5 مل من الميثانول و 5 مل من الماء منزوع الأيونات. أضف 10 مل من المادة الطافية إلى الخرطوشة التي تم تنشيطها مسبقا وقم بإجراء تنظيف العينة.
      2. بعد أن يصل مستوى محلول العينة إلى الطبقة العليا من الخراطيش ، قم بإزالة المواد المراد تحليلها باستخدام 5 مل من محلول حمض الفورميك 1٪ ثم 5 مل من الميثانول. تخلص من الشطاف.
      3. Elute مع 5 مل من الميثانول (يحتوي على 0.5٪ ماء الأمونيا) ، قم بتصفية الشطف من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر ، وقم بالتحليل بواسطة UPLC-MS / MS (انظر جدول المواد).
    5. قم بإجراء تنظيف العينة باستخدام الممتزات .
      1. خذ 2 مل من المادة الطافية (الخطوة 2.2.4) في أنبوب طرد مركزي سعة 10 مل مملوء بمواد ماصة GCB: PSA: C18 (10 مجم: 20 مجم: 15 مجم ، انظر جدول المواد) ، دوامة لمدة دقيقة واحدة ، وأجهزة طرد مركزي عند 9,390 × جم لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      2. مرر 1 مل من المادة الطافية من خلال مرشح غشاء 0.22 ميكرومتر قبل التحليل بواسطة UPLC-MS / MS.
  3. إجراء معالجة عينات التربة.
    1. وزن عينة تربة 1.00 جرام. ضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، وأضف 0.1 مل من محلول سترات ثلاثي الصوديوم 0.1 مول / لتر (انظر جدول المواد) لضبط قيمة الرقم الهيدروجيني للتربة إلى 6.0.
    2. السماح للوقوف لمدة 2 دقيقة ، ثم إضافة 10 مل من 0.1 مول / لتر محلول الميثانول حمض الكبريتيك ، دوامة لمدة 2 دقيقة ويهز لمدة 30 دقيقة ، ثم إجراء استخراج بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة.
    3. جهاز طرد مركزي عند 9,390 × جم لمدة 10 دقائق ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مع قطارة بلاستيكية.
    4. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه لتكرار الاستخراج والجمع بين المادة الطافية مرتين.
      ملاحظة: كانت طريقة التنقية هي نفسها الواردة في الخطوة 2-2-5-1 والخطوة 2-2-5-2.

3. التحليل الآلي

  1. اكتشف 15 PAs في عينات الشاي المجفف وأوراق الشاي الطازجة والأعشاب الضارة والتربة (عينات من الخطوة 2) باستخدام نظام UPLC-MS / MS المتاح تجاريا (2.1 مم × 100 مم ، 1.8 ميكرومتر) (انظر جدول المواد).
  2. اضبط درجة حرارة العمود على 40 درجة مئوية ، ومعدل التدفق على 0.250 مل / دقيقة ، وحجم الحقن على 3 ميكرولتر.
  3. اضبط المرحلة المتنقلة A: الميثانول (يحتوي على 0.1٪ حمض الفورميك + 1 مليمول / لتر فورمات الأمونيوم) ، والمرحلة المتنقلة B: الماء (الذي يحتوي على 0.1٪ حمض الفورميك + 1 مليمول / لتر فورمات الأمونيوم).
  4. اضبط إجراء شطف التدرج: 10٪ أ من 0.0 دقيقة إلى 0.25 دقيقة ، 10٪ -30٪ أ من 0.25 دقيقة إلى 6.0 دقيقة ، 30٪ -40٪ أ من 6.0 دقيقة إلى 9.0 دقيقة ، 40٪ -98٪ أ من 9.0 دقيقة إلى 9.01 دقيقة تم الاحتفاظ بها لمدة 1.9 دقيقة ، و 98٪ -100٪ أ من 11.0 دقيقة إلى 11.1 دقيقة تم الاحتفاظ بها لمدة 2.9 دقيقة.
  5. اضبط معلمات مطياف الكتلة: وضع التأين ، مصدر الأيونات الموجبة للرش الكهربائي (ESI +) ؛ ضغط البخاخة ، 7.0 بار ؛ الجهد الشعري ، 4.0 كيلو فولت ؛ تفتق ثقب الظهر تهب التدفق ، 150 لتر / ساعة ؛ تدفق غاز المذيبات ، 800 لتر / ساعة ؛ درجة حرارة المذيب ، 400 °C ؛ تدفق الغاز الصدمي ، 0.25 مل / دقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إنشاء طريقة تنقية وتحليل الممتزات المحسنة ل 15 PAs في عينات الشاي المجفف وأوراق الشاي الطازجة والأعشاب الضارة والتربة ومقارنتها بطريقة التنقية شائعة الاستخدام باستخدام خرطوشة SPE. أظهرت النتائج أن عمليات استرداد 15 PAs في عينات الشاي المجفف والأعشاب الضارة وأوراق الشاي الطازجة باستخدام خرطوشة SPE كانت 72٪ -120٪ ، بينما كان استخدام تنقية الممتزات 78٪ -98٪ (الشكل 1). كانت عمليات استرداد 15 PAs في التربة باستخدام تنقية الممتزات 79٪ -111٪ (الشكل 1). تم جمع أربعين (40) عينة حقيقية عشوائيا للكشف عن محتوى المناطق المحمية لمقارنة طريقتي التنظيف (الجداول التكميلية 1-7). واكتشف الهليوترين (He) في جميع عينات الشاي المجفف العشر باستخدام طريقة الممتزات التي يتراوح محتواها بين 1.3 و22 ميكروغرام/كغ، في حين لم يكتشف إلا في ثلاث عينات من الشاي المجفف باستخدام خرطوشة SPE التي يتراوح محتواها بين 1.8 و24.6 ميكروغرام/كغ (الجداول التكميلية 3-4).

تم اختيار طريقة تنقية الممتزات (GCB: PSA: C18) للكشف عن المناطق المحمية في الأعشاب الضارة والتربة الجذرية للأعشاب الضارة وأوراق الشاي الطازجة في أنظمة مزارع الشاي. تم اختيار خمسة مواقع لأخذ العينات في حديقة شاي واحدة في جينتشاي. بالإضافة إلى اليعقوبين (Jb) ، و seneciphylline (Sp) ، و seneciphylline N-oxid (SpNO) ، و senkirkine (Sk) ، تم اكتشاف ما مجموعه 11 PAs في الأعشاب A. conyzoides ، والتي كان أعلى محتوى من المناطق المحمية هو intermedine (Im) (2,006-2,970 ميكروغرام / كجم) ، وأكسيد الهليوترين N (HeNO) (2,446-2,731 ميكروغرام / كجم) ، وأكسيد إنترميدين-N (ImNO) (13,535-17,345 ميكروغرام / كجم) (الجدول 1). وفي التربة، لم يكتشف سوى ImNO في موقع أخذ العينات 5، بمحتوى قدره 6.05 ميكروغرام/كغ (الجدول التكميلي 8). تم اكتشاف ImNO و Sn في أوراق الشاي الطازجة من مواقع أخذ العينات الخمسة (الشكل 2). تم اكتشاف ImNO في أجزاء مختلفة من نباتات الشاي ، وتراوح محتواه من 4.36-26.5 ميكروغرام / كجم ، وهو أكبر من Sn ، باستثناء أنه لم يتم اكتشاف Sn في الأوراق الناضجة من موقع أخذ العينات 1 وموقع أخذ العينات 2. تم الكشف عن Sn في أجزاء مختلفة من نباتات الشاي في مواقع أخذ العينات الأخرى ، وتراوح المحتوى من 1.0-3.14 ميكروغرام / كجم (الشكل 2).

في موقع أخذ العينات 5 ، تم عرض ظاهرة انتقال المناطق المحمية بين الأعشاب الضارة وتربة جذور الحشائش وأوراق الشاي الطازجة (الشكل 3). من بين 11 حشائش PAs ، تم اكتشاف ImNO فقط في التربة ، بمحتوى 6.05 ميكروغرام / كجم ، بينما تم اكتشاف ImNO و Sn في أجزاء مختلفة من نباتات الشاي. كان محتوى ImNO في برعم واحد مع ورقتين هو الأعلى ، والذي كان 12.6 ميكروغرام / كجم (الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1: مقارنة الاسترداد. مقارنة عمليات استرداد 15 PAs (قلويدات بيروليزيدين) في مستخلصات من (أ) أوراق الشاي الطازجة ، (ب) عينات الشاي المجفف ، (ج) الأعشاب الضارة ، و (د) عينات التربة عند التنظيف مع الممتزات (مستوى مسنن = 0.02 ملغم / كغم) وخراطيش SPE (أعمدة استخراج الطور الصلب لتبادل الكاتيون المختلط ، مستوى مسنن = 0.01 ملغم / كغم). تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ، وتم إجراء اختبار الأهمية عن طريق تحليل التباين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: محتوى وأنواع PAs (قلويدات بيروليزيدين) في أجزاء مختلفة من نباتات الشاي التي تم جمعها من مواقع أخذ العينات الخمسة. (أ) موقع أخذ العينات 1. (ب) موقع أخذ العينات 2. (ج) موقع أخذ العينات 3. (د) موقع أخذ العينات 4. (ه) موقع أخذ العينات 5. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ، وتم إجراء اختبار الأهمية عن طريق تحليل التباين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: المناطق المحمية الموجودة في الحشائش ونقلها إلى التربة وأوراق الشاي الطازجة. (أ) محتوى ونوع المناطق المحمية (قلويدات بيروليزيدين) المكتشفة في الأعشاب الضارة والتربة وأوراق الشاي الطازجة. (ب) محتوى ونوع المناطق المحمية المكتشفة في الأعشاب الضارة. تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري ، وتم إجراء اختبار الأهمية عن طريق تحليل التباين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

موقع سامب لينغ المحتوى المتوسط للمناطق المحمية المفردة (± الانحرافات المعيارية النسبية)، ميكروغرام/كغ محتوى إجمالي المناطق المحمية (ميكروغرام / كجم)
هو هينو الدردشه ايم نو جي بي JbNO اعاده رينو Sn سنو س س
لا		 الاتحاد الأوروبي إيونو كورونا
1 97.4 (2.43) 2731.1 (2.04) 2424.9 (1.84) 13754 (0.56) إن دي 1.92 (1.54) 21.2 (10.45) 4.01 (5.72) 58.4 (2.52) 17.2 (9.03) إن دي إن دي 224.0 (1.75) 6.9 (2.02) إن دي 19341.03
2 83.9 (1.21) 2518.6 (0.81) 2476.5 (1.15) 13945 (0.30) إن دي 2.60 (2.52) 28.8 (1.51) 4.82 (3.66) 63.7 (3.52) 19.8 (10.2) إن دي إن دي 248.6 (1.48) 7.0 (1.58) إن دي 19399.32
3 96.6 (1.67) 2470.4 (1.08) 2969.7 (1.02) 16829 (0.36) إن دي 2.12 (1.08) 20.9 (9.30) 2.94 (1.08) 51.0 (7.50) 14.9 (8.25) إن دي إن دي 252.1 (3.17) 5.91 (0.35) إن دي 22715.57
4 91.4 (1.98) 2638.6 (2.75) 2882.4 (1.98) 17345 (0.76) إن دي 2.42 (10.59) 15.4 (6.99) 2.67 (10.59) 51.6 (6.73) 15.0 (0.92) إن دي إن دي 281.3 (2.36) 6.78 (2.15) إن دي 23332.57
5 83.4 (3.79) 2446.7 (6.0) 2005.5 (3.79) 13535 (1.96) إن دي 1.68 (4.94) 15.2 (0.91) 2.70 (4.94) 49.4 (8.78) 16.9 (10.7) إن دي إن دي 215.2 (2.47) 5.99 (3.76) إن دي 18377.67

الجدول 1: محتوى المناطق المحمية المفردة والكلية (قلويدات بيروليزيدين) للأعشاب الضارة في مواقع أخذ العينات الخمسة. يمثل ND لم يتم اكتشاف أي شيء.

الجدول التكميلي 1: محتوى المناطق المحمية المفردة والكلية في أوراق الشاي الطازجة المنقاة بطريقة الممتز. يمثل ND لم يتم اكتشاف أي شيء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 2: محتوى المناطق المحمية المفردة والكلية في أوراق الشاي الطازجة المنقاة بواسطة SPE. يمثل ND لم يتم اكتشاف أي شيء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 3: محتوى المناطق المحمية المفردة والكلية في الشاي المجفف المنقى بطريقة الممتز. يمثل ND لم يتم اكتشاف أي شيء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 4: محتوى المناطق المحمية المفردة والكلية في الشاي المجفف المنقى بواسطة SPE. يمثل ND لم يتم اكتشاف أي شيء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 5: محتوى المناطق المحمية المفردة والكلية في الحشائش المنقاة بطريقة الممتزات. يمثل ND لم يتم اكتشاف أي شيء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 6: محتوى المناطق المحمية المفردة والكلية في الحشائش التي تنقيها SPE. يمثل ND لم يتم اكتشاف أي شيء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 7: محتوى المناطق المحمية المفردة والكلية في التربة المنقاة بطريقة الممتز. يمثل ND لم يتم اكتشاف أي شيء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول التكميلي 8: محتوى المناطق المحمية المفردة والكلية للتربة في مواقع أخذ العينات الخمسة. يمثل ND لم يتم اكتشاف أي شيء. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تصميم العمل الحالي لتطوير طريقة فعالة وحساسة لاستكشاف طرق التلوث ومصادر المناطق المحمية في عينات الشاي وكذلك توزيع المناطق المحمية في أجزاء مختلفة من نباتات الشاي. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، تم فصل 15 PAs فقط بنجاح على العمود الكروماتوغرافي ، وهو عدد صغير جدا مقارنة بالعدد الكبير من قلويدات في الأنواع النباتية 3,4. لم يكن هذا مرتبطا فقط بخصائص التعبئة للعمود نفسه ولكن أيضا بالمصفوفة المعقدة لعينات الشاي التي تم فحصها. لذلك ، لا تزال طرق الفصل والتنقية الأفضل للكشف عن المناطق المحمية المتعددة بحاجة إلى مزيد من الاستكشاف.

تم تطبيق خراطيش SPE وطرق الممتزات للكشف عن المناطق المحمية المتعددة في مجموعة متنوعة من مصفوفات العينات ، ولكن في مصفوفة الشاي المعقدة ، لم يتم الإبلاغ عن طريقة الممتزات24. لذلك ، تم تطوير طريقة الممتزات بنسبة GCB: PSA: C18 (10 مجم: 20 مجم: 15 مجم) في هذا العمل ، واستوفت عمليات استرداد 15 PAs متطلبات الكشف عن المناطق المحمية في مصفوفات عينات مختلفة. في المقابل ، بلغ متوسط استرداد ImNO و Eu و Re 119٪ و 120٪ و 115٪ على التوالي في الشاي المجفف عند التنظيف باستخدام خراطيش SPE ، والتي أظهرت تأثيرا كبيرا للمصفوفة. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع خراطيش SPE ، فإن طريقة الممتزات (GCB: PSA: C18) كان لها وقت معالجة أقصر للعينة ، وتكلفة أقل ، واسترداد أفضل لتحليل PA (الشكل 1 ب). قدم إنشاء طرق الكشف عن 15 PAs في عينات الشاي المجفف وأوراق الشاي الطازجة والأعشاب الضارة والتربة طريقة كشف فعالة لاستكشاف مصدر تلوث المناطق المحمية في عينات الشاي. علاوة على ذلك ، وفقا للمعرفة الحالية ، تم إنشاء طريقة للكشف عن المناطق المحمية المتعددة في التربة لأول مرة في هذه الدراسة.

تمت دراسة مسار نقل المناطق المحمية في نظام مزارع الشاي. تشير دراساتنا إلى أن A. conyzoides كانت واحدة من الحشائش التي تحتوي على أعلى محتوى إجمالي من PA في حديقة شاي Jinzhai ، ونمت بجانب نباتات الشاي. لذلك ، تم جمع A. conyzoides ، A. conyzoides التربة الجذرية ، والأجزاء المختلفة من أوراق الشاي الطازجة من مواقع أخذ العينات الخمسة في حديقة شاي واحدة في Jinzhai لتحليل 15 PAs. يوضح الشكل 3 أنه من بين 11 PAs المنتجة في A. conyzoides ، تم اكتشاف ImNO فقط في التربة الجذرية A. conyzoides ، بينما تم اكتشاف ImNO و Sn في أوراق الشاي الطازجة. يشير هذا إلى أنه لا يمكن نقل كل محتوى المناطق المحمية المنتجة في A. conyzoides إلى نباتات الشاي عبر وسط التربة. قد يتحلل بعض محتوى المناطق المحمية المنقولة إلى التربة بواسطة الكائنات الحية الدقيقة في التربة.

تم توزيع ImNO و Sn بشكل أساسي في برعم واحد بورقتين وبرعم واحد بثلاث أوراق ، بينما كان محتوى المناطق المحمية في الأوراق الناضجة منخفضا نسبيا. في موقع أخذ العينات 4 ، بلغ محتوى ImNO في برعم واحد مع ورقتين 26.5 ميكروغرام / كجم ، بينما تراوح محتوى في أجزاء أخرى من نبات الشاي من 7.14-10.4 ميكروغرام / كجم. لم يتم الكشف عن Sn في الأوراق الناضجة في موقع أخذ العينات 1 وموقع أخذ العينات 2. ويشير ذلك إلى أن الأجزاء المخصبة من المناطق المحمية في نباتات الشاي تتركز أساسا في الأوراق الصغيرة، وأن المحتوى كان أقل بكثير من الحد الأقصى المسموح به لبقايا المناطق المحمية في عينات الشاي التي حددها الاتحاد الأوروبي (150 ميكروغرام/كغ للبالغين، و75 ميكروغرام/كغ للرضع وصغار)25. تكشف النتائج أن المناطق المحمية في عينات الشاي قد تأتي من الأعشاب المنتجة للسلطة الفلسطينية في حدائق الشاي عبر التربة. علاوة على ذلك ، تؤكد النتائج نقل وتبادل المناطق المحمية بين النباتات17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32102244) ، والمشروع الوطني لجودة وسلامة المنتجات الزراعية وتقييم المخاطر (GJFP2021001) ، والمؤسسة العلمية الطبيعية لمقاطعة آنهوي (19252002) ، ووزارة الزراعة الأمريكية (HAW05020H).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115197 CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 181210 CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%) Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) G0860050 CAS No:540-69-2
Carbon-GCB CNW B7760030 120-400 MESH, 10g. per box 
Centrifuge Z 36 HK HERMLE Z36HK 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea product Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun loose tea Green tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) BioCrick 323256 CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%) BioCrick 98222 CAS No:570-19-4
Formate (98.0%) Aladdin E2022005 CAS No:64-18-6
HC-C18 CNW D2110060 40-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%) BioCrick 906426 CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) BioCrick 22581 CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WS cence 203158000 Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 column Waters 186004976 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%) BioCrick 114843 CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) BioCrick 340066 CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%) BioCrick 132282048 CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) ChemFaces CFN00461 CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115100 CAS No:67-56-1
PSA Agela P19-00833 40-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%) BioCrick 5281743 CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) BioCrick 5281734 CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%) BioCrick 5280906 CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) BioCrick 5380876 CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) BioCrick 6442619 CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%) BioCrick 5281750 CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%) BioCrick 5281752 CAS No:2318-18-5
SPE PCX Agilent Technologies 12108206 Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 1003019 CAS No:7664-93-9
Trisodium citrate Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. 20121009 CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleaner Supmile KQ-600B Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMS Waters ZPLYY-003 Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillator Guoyu instrument SHY-2AHS Oscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498 (2019).
  2. EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed. EFSA Journal. 9 (11), 134 (2011).
  3. Ma, C., et al. Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).
  4. Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. Encyclopedia of Food Chemistry. Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. 1, Elsevier. 348-355 (2019).
  5. Huang, D. Y., et al. Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea. Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).
  6. Liang, A. H., Ye, Z. G. General situation of the toxicity researches on Senecio. China Journal of Chinese Materia Medica. 31 (2), 93-97 (2006).
  7. Li, Y. H., et al. Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats. Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).
  8. Jia, Z. J., et al. Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity. The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).
  9. Yang, M., et al. First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans. Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).
  10. Chen, Z., Huo, J. R. Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).
  11. Mattocks, A. R. Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloid. , Academic Press. London, UK. (1986).
  12. Picron, J. F., Herman, M., Van Hoeck, E., Goscinny, S. Analytical strategies for the determination of pyrrolizidine alkaloids in plant based food and examination of the transfer rate during the infusion process. Food Chemistry. 266, 514-523 (2018).
  13. Kowalczyk, E., Kwiatek, K. Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas. Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).
  14. EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA Journal. 15 (7), 04908 (2017).
  15. Han, H., et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk. Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).
  16. Nowak, M., et al. Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities. Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).
  17. Selmar, D., et al. Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations. Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).
  18. Izcara, S., et al. Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs. Food Chemistry. 380, 132189 (2022).
  19. Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples. Foods. 9 (9), 1319 (2020).
  20. Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis). South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).
  21. Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).
  22. Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea. Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).
  23. Han, H. L., et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds. Food control. 132, 108518 (2022).
  24. Bodi, D., et al. Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey. Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).
  25. European Union Commission. Commission Regulation (EU) 2020/2040 of 11 December 2020 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of pyrrolizidine alkaloids in certain foodstuffs. Official Journal of the European Union. 14 (12), 1-4 (2020).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 187 ، المصدر ، التلوث ، حديقة الشاي ، بيروليزيدين ، قلويدات ، ممتز
مصدر وطريق تلوث قلويد بيروليزيدين في عينات الشاي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiao, W., Shen, T., Wang, L., Zhu,… More

Jiao, W., Shen, T., Wang, L., Zhu, L., Li, Q. X., Wang, C., Chen, H., Hua, R., Wu, X. Source and Route of Pyrrolizidine Alkaloid Contamination in Tea Samples. J. Vis. Exp. (187), e64375, doi:10.3791/64375 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter