Summary
O presente protocolo descreve a contaminação de alcaloides pirrolizidínicos (APs) em amostras de chá de plantas daninhas produtoras de AP em jardins de chá.
Abstract
Alcaloides pirrolizidínicos tóxicos (APs) são encontrados em amostras de chá, que representam uma ameaça à saúde humana. No entanto, a origem e a via de contaminação por AP em amostras de chá permanecem obscuras. Neste trabalho, um método adsorvente combinado com UPLC-MS/MS foi desenvolvido para determinar 15 APs em plantas daninhas Ageratum conyzoides L., solo rizosférico de A. conyzoides, folhas de chá fresco e amostras de chá seco. As recuperações médias variaram de 78%-111%, com desvios-padrão relativos de 0,33%-14,8%. Quinze pares de A. conyzoides e A. conyzoides rhizospheric amostras de solo e 60 amostras de folhas de chá fresco foram coletadas no jardim de chá Jinzhai na província de Anhui, China, e analisadas para os 15 APs. Nem todos os 15 APs foram detectados em folhas de chá fresco, exceto N-óxido intermediário (ImNO) e senecionina (Sn). O conteúdo de ImNO (34,7 μg/kg) foi maior que o de Sn (9,69 μg/kg). Além disso, tanto o ImNO quanto o Sn concentraram-se nas folhas jovens da planta de chá, enquanto seu conteúdo foi menor nas folhas velhas. Os resultados indicaram que os APs no chá foram transferidos através do caminho de plantas daninhas produtoras de AF - solo e folhas frescas de chá em jardins de chá.
Introduction
Como metabólitos secundários, os alcaloides pirrolizidínicos (APs) protegem as plantas contra herbívoros, insetos e patógenos 1,2. Até o momento, mais de 660 APs e óxidos de AP-N (PANOs) com diferentes estruturas foram encontrados em mais de 6.000 espécies de plantas em todo o mundo 3,4. Plantas produtoras de AP são encontradas principalmente nas famílias Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae e Apocynaceae 5,6. Os APs são facilmente oxidados a alcaloides desidropirrolizidínicos instáveis, que apresentam forte eletrofilicidade e podem atacar nucleófilos como DNA e proteínas, resultando em necrose das células hepáticas, oclusões venosas, cirrose, ascite e outros sintomas 7,8. O principal órgão-alvo da toxicidade da AP é o fígado. Os APs também podem causar toxicidade pulmonar, renal e de outros órgãos e toxicidade mutagênica, carcinogênica e de desenvolvimento 9,10.
Casos de intoxicação humana e animal têm sido relatados em muitos países a partir da ingestão de ervas tradicionais, suplementos ou chás contendo APs ou da contaminação indireta de alimentos como leite, mel ou carne (tóxicos pela ingestão de pastagens contendo APs)11,12,13. As conclusões da Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA) indicam que substâncias como o chá (herbal) são uma importante fonte de exposição humana a APs/PANOs14. Amostras de chá não produzem APs, enquanto plantas produtoras de AF são comumente encontradas em jardins de chá (por exemplo, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus e Ageratum conyzoides)15. Suspeitava-se anteriormente que o chá poderia estar contaminado com APs de suas plantas produtoras durante a colheita e processamento. No entanto, APs também foram detectados em algumas folhas de chá escolhidas manualmente (ou seja, sem plantas produtoras de AF), sugerindo que deve haver outras rotas ou fontes de contaminação16. Foi conduzido um experimento de co-cultivo de plantas de trapoeraba (Senecio jacobaea) com plantas de melissa (Melissa officinalis), hortelã-pimenta (Mentha piperita), salsa (Petroselinum crispum), camomila (Matricaria recutita) e nasturtium (Tropaeolum majus), cujos resultados mostraram que APs foram detectados em todas essas plantas17. Verificou-se que os APs são, de fato, transferidos e trocados entre plantas vivas via solo18,19. Van Wyk et al.20 verificaram que o chá de rooibos (Aspalathus linearis) estava severamente contaminado em locais ricos em plantas daninhas e continha APs do mesmo tipo e proporção. No entanto, não foram detectados APs no chá de rooibos em locais livres de plantas daninhas.
Atualmente, a cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (UPLC-MS/MS) com alta seletividade e sensibilidade tem sido amplamente utilizada na análise qualitativa e quantitativa de APs em produtos agrícolas ealimentícios21,22. O método de tratamento da amostra é geralmente composto por extração em fase sólida (SPE) ou limpeza QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) de extratos de matrizes alimentares complexas, que podem obter a maior sensibilidade possível12,19. No entanto, métodos analíticos robustos que permitam a detecção e quantificação de APs em matrizes complexas como solo, plantas daninhas e folhas de chá fresco ainda estão ausentes.
Este estudo analisou 15 APs em amostras de chá seco, folhas de chá fresco, plantas daninhas e amostras de solo rizosférico de plantas daninhas com UPLC-MS/MS combinado com um método de purificação por adsorvente. Além disso, 15 amostras pareadas de solo rizosférico de plantas daninhas e plantas daninhas e 60 amostras de folhas de chá fresco foram coletadas de cinco pontos de amostragem no jardim de chá Jinzhai na província de Anhui, China, e foram analisadas para 15 APs. Estes resultados podem fornecer um método de levantamento e algumas informações sobre a origem e rota de APs (contaminação) em amostras de chá para garantir a qualidade e segurança do chá.
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Protocol
Para o presente estudo, foram coletadas as seguintes espécies de plantas daninhas: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. e Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore. As folhas de chá fresco foram colhidas da variedade de árvores de chá Longjing 43#, e as amostras de chá seco foram comercialmente disponíveis chá processado de acordo com o processo de fabricação do chá verde (ver Tabela de Materiais).
1. Coleta de amostras
- Coletar 40 amostras reais.
- Colete 10 ervas daninhas, 10 solos e 10 folhas de chá fresco aleatoriamente de vários jardins de chá.
OBS: Para o presente estudo, o solo foi amostrado na profundidade de 20 cm com uma quantidade de amostra de 200 g. - Recolha aleatoriamente 10 produtos de chá seco (250 g) de um supermercado.
- Colete 10 ervas daninhas, 10 solos e 10 folhas de chá fresco aleatoriamente de vários jardins de chá.
- Coletar amostras de ervas daninhas, solo e folhas de chá fresco para estudar a fonte de contaminação de APs no chá.
- Defina cinco pontos de amostragem no mesmo jardim de chá, com três repetições em cada ponto.
- Coletar amostras de plantas daninhas de Ageratum conyzoides L. com maior teor de PA comumente encontrado em jardins de chá.
OBS: A quantidade amostral foi de 250 g para o presente estudo. - Coletar as amostras de solo.
NOTA: As amostras de solo foram de A. conyzoides rhizospheric na profundidade de 20 cm com uma quantidade de amostra de 200 g. - Colete as folhas de chá fresco de diferentes partes das plantas de chá, incluindo um botão com duas folhas, um botão com três folhas, um botão com quatro folhas e folhas maduras.
NOTA: A quantidade de amostra foi de 250 g.
2. Tratamento da amostra
- Pré-trate as amostras seguindo os passos abaixo.
- Triture as amostras secas de chá e solo com um moedor, passe as amostras pulverizadas por uma peneira de 200 malhas e armazene-as a -20 °C.
NOTA: O chá seco era um produto de chá disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais), por isso foi diretamente triturado e peneirado para armazenamento. As amostras de solo (200 g) foram colocadas em local ventilado no escuro para secar ao ar por cerca de uma semana. - Homogeneizar a erva daninha e as folhas de chá fresco com um homogeneizador e armazená-las a -20 °C.
- Triture as amostras secas de chá e solo com um moedor, passe as amostras pulverizadas por uma peneira de 200 malhas e armazene-as a -20 °C.
- Realizar o tratamento de amostra dos produtos de chá seco, folhas de chá fresco e ervas daninhas.
- Pesar 1,00 g de cada amostra (produtos secos de chá, folhas de chá fresco e ervas daninhas) e colocá-lo em tubos de centrífuga de 50 mL.
- Adicionar 10 ml de solução de ácido sulfúrico 0,1 mol/L e vórtice durante 2 minutos para extracção em fase sólida (utilizando cartucho SPE, ver Tabela de Materiais) e 1 min para purificação do adsorvente. Realizar extração ultra-sônica23 por 15 min e, em seguida, centrifugar por 10 min a uma velocidade de 9.390 x g à temperatura ambiente.
NOTA: A potência do oscilador ultra-sônico foi de 290 W, a frequência de oscilação foi de 35 kHz e a temperatura foi ajustada para 30 °C. - Transfira o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 mL com um conta-gotas de plástico.
- Siga as etapas acima para repetir a extração uma vez. Combine os dois sobrenadantes.
- Ativar os cartuchos SPE com 5 mL de metanol e 5 mL de água deionizada. Adicionar 10 ml de sobrenadante ao cartucho pré-ativado e efectuar a limpeza da amostra.
- Após o nível da solução da amostra atingir a camada superior dos cartuchos, eluir os analitos com 5 mL de solução de ácido fórmico a 1% e, em seguida, 5 mL de metanol. Descarte o eluato.
- Eluir com 5 mL de metanol (contendo 0,5% de água de amônia), filtrar o eluato através de um filtro de membrana de 0,22 μm e analisar por UPLC-MS/MS (ver Tabela de Materiais).
- Realizar a limpeza da amostra usando adsorventes.
- Tomar 2 ml do sobrenadante (passo 2.2.4) num tubo de centrifugação de 10 ml preenchido com os adsorventes de GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg, ver Tabela de Materiais), vórtice durante 1 minuto e centrifugar a 9.390 x g durante 8 minutos à temperatura ambiente.
- Passar 1 mL do sobrenadante através de um filtro de membrana de 0,22 μm antes da análise por UPLC-MS/MS.
- Realizar tratamento das amostras de solo.
- Pesar uma amostra de solo de 1,00 g. Colocá-lo num tubo de centrifugação de 50 ml e adicionar 0,1 ml de solução de citrato trissódico 0,1 mol/L (ver Tabela de Materiais) para ajustar o valor de pH do solo para 6,0.
- Deixe repousar por 2 minutos e, em seguida, adicione 10 mL de solução de metanol de ácido sulfúrico 0,1 mol/L, vórtice por 2 min e agite por 30 minutos e, em seguida, execute a extração ultra-sônica por 30 min.
- Centrifugar a 9.390 x g por 10 min e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 mL com conta-gotas de plástico.
- Siga os passos acima para repetir a extração e combinar o sobrenadante duas vezes.
NOTA: O método de purificação foi o mesmo que nas etapas 2.2.5.1 e 2.2.5.2.
3. Análise instrumental
- Detectar os 15 PAs em amostras de chá seco, folhas de chá fresco, ervas daninhas e solo (amostras da etapa 2) usando um sistema UPLC-MS/MS disponível comercialmente (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) (consulte a Tabela de Materiais).
- Ajuste a temperatura da coluna para 40 °C, o fluxo para 0,250 mL/min e o volume de injeção para 3 μL.
- Definir a fase móvel A: metanol (contendo 0,1% de ácido fórmico + 1 mmol/L de formato de amônio) e a fase móvel B: água (contendo 0,1% de ácido fórmico + 1 mmol/L de formato de amônio).
- Defina um procedimento de eluição de gradiente: 10% A de 0,0 min a 0,25 min, 10%-30% A de 0,25 min a 6,0 min, 30%-40% A de 6,0 min a 9,0 min, 40%-98% A de 9,0 min a 9,01 min que foi mantido por 1,9 min e 98%-100% A de 11,0 min a 11,1 min que foi mantido por 2,9 min.
- Definir os parâmetros do espectrômetro de massa: modo de ionização, fonte de íons positivos por eletrospray (ESI+); pressão do atomizador, 7,0 bar; tensão capilar, 4,0 kV; fluxo de sopro de volta do furo de cone, 150 L/h; fluxo de gás solvente, 800 L/h; temperatura de dissolução, 400 °C; fluxo de gás de impacto, 0,25 mL/min.
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Representative Results
O método otimizado de purificação e análise de adsorventes de 15 APs em amostras de chá seco, folhas de chá fresco, plantas daninhas e solo foi estabelecido e comparado com o método de purificação comumente usado usando o cartucho SPE. Os resultados mostraram que a recuperação dos 15 APs em amostras de chá seco, plantas daninhas e folhas de chá fresco usando o cartucho de SPE foi de 72%-120%, enquanto que com purificação de adsorvente foi de 78%-98% (Figura 1). As recuperações dos 15 APs no solo utilizando purificação adsorvente foram de 79%-111% (Figura 1). Quarenta (40) amostras reais foram coletadas aleatoriamente para detectar o conteúdo de APs para comparar os dois métodos de limpeza (Tabelas Suplementares 1-7). A heliotrina (He) foi detectada em todas as 10 amostras de chá seco usando o método adsorvente com um teor de 1,3-22 μg/kg, enquanto foi detectada apenas em três amostras de chá seco usando o cartucho SPE com um conteúdo de 1,8-24,6 μg/kg (Tabelas Suplementares 3-4).
O método de purificação por adsorvente (GCB:PSA:C18) foi selecionado para detectar APs em plantas daninhas, solos rizosféricos de plantas daninhas e folhas de chá fresco em sistemas de plantio de chá. Cinco pontos de amostragem foram escolhidos em um jardim de chá em Jinzhai. Além de jacobina (Jb), senecifilina (Sp), N-óxido de senecifilina (SpNO) e senquerquina (Sk), um total de 11 APs foi detectado na planta daninha A. conyzoides, dos quais os maiores teores de APs foram intermedino (Im) (2.006-2.970 μg/kg), heliotrina-N-óxido (HeNO) (2.446-2.731 μg/kg) e intermediário-N-óxido (ImNO) (13.535-17.345 μg/kg) (Tabela 1). No solo, apenas a ImNO foi detectada no ponto 5, com teor de 6,05 μg/kg (Tabela Suplementar 8). ImNO e Sn foram detectados nas folhas de chá fresco dos cinco pontos de amostragem (Figura 2). O ImNO foi detectado em diferentes partes das plantas de chá, e seu conteúdo variou de 4,36-26,5 μg/kg, que foi maior do que o de Sn, exceto que Sn não foi detectado em folhas maduras do ponto de amostragem 1 e do local de amostragem 2. Sn foi detectado em diferentes partes das plantas de chá nos outros pontos de amostragem, e o conteúdo variou de 1,0-3,14 μg/kg (Figura 2).
No ponto de amostragem 5, foi mostrado o fenômeno de transferência de APs entre as plantas daninhas, solo rizosférico das plantas daninhas e folhas frescas de chá (Figura 3). Entre as 11 plantas daninhas APs, apenas ImNO foi detectada no solo, com teor de 6,05 μg/kg, enquanto ImNO e Sn foram detectados em diferentes partes das plantas de chá. O teor de ImNO em uma gema com duas folhas foi o mais elevado, de 12,6 μg/kg (Figura 3).
Figura 1: Comparação de recuperação. Comparação das recuperações de 15 APs (alcaloides pirrolizidínicos) em extratos de (A) folhas de chá fresco, (B) amostras de chá seco, (C) plantas daninhas e (D) amostras de solo após limpeza com o adsorvente (nível fortificado = 0,02 mg/kg) e cartuchos de SPE (colunas mistas de extração em fase sólida de troca catiônica, nível fortificado = 0,01 mg/kg). As barras de erro mostram o desvio padrão, e o teste de significância foi realizado por análise de variância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Conteúdo e tipos de APs (alcaloides pirrolizidínicos) em diferentes partes das plantas de chá coletadas nos cinco locais de amostragem . (A) Local de amostragem 1. (B) Local de amostragem 2. (C) Local de amostragem 3. (D) Local de amostragem 4. (E) Local de amostragem 5. As barras de erro mostram o desvio padrão, e o teste de significância foi realizado por análise de variância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: APs contidos nas plantas daninhas e sua transferência para o solo e folhas frescas de chá. (A) O teor e o tipo de APs (alcaloides pirrolizidínicos) detectados nas plantas daninhas, no solo e nas folhas frescas de chá. (B) O teor e o tipo de APs detectados nas plantas daninhas. As barras de erro mostram o desvio padrão, e o teste de significância foi realizado por análise de variância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Local de amostragem | O conteúdo médio de APs simples (± desvio padrão relativo), μg/kg | O conteúdo de APs totais (μg/kg) | |||||||||||||||||||||||||||
| Ele | HeNO | Im | ImNO | Jb | JbNO | Re | Reno | Sn | SnNÃO | Sp | Sp NÃO |
UE | EuNO | Sk | |||||||||||||||
| 1 | 97.4 (2.43) | 2731.1 (2.04) | 2424.9 (1.84) | 13754 (0.56) | ND | 1.92 (1.54) | 21.2 (10.45) | 4.01 (5.72) | 58.4 (2.52) | 17.2 (9.03) | ND | ND | 224.0 (1.75) | 6.9 (2.02) | ND | 19341.03 | |||||||||||||
| 2 | 83.9 (1.21) | 2518.6 (0.81) | 2476.5 (1.15) | 13945 (0.30) | ND | 2.60 (2.52) | 28.8 (1.51) | 4.82 (3.66) | 63.7 (3.52) | 19.8 (10.2) | ND | ND | 248.6 (1.48) | 7.0 (1.58) | ND | 19399.32 | |||||||||||||
| 3 | 96.6 (1.67) | 2470.4 (1.08) | 2969.7 (1.02) | 16829 (0.36) | ND | 2.12 (1.08) | 20.9 (9.30) | 2.94 (1.08) | 51.0 (7.50) | 14.9 (8.25) | ND | ND | 252.1 (3.17) | 5.91 (0.35) | ND | 22715.57 | |||||||||||||
| 4 | 91.4 (1.98) | 2638.6 (2.75) | 2882.4 (1.98) | 17345 (0.76) | ND | 2.42 (10.59) | 15.4 (6.99) | 2.67 (10.59) | 51.6 (6.73) | 15.0 (0.92) | ND | ND | 281.3 (2.36) | 6.78 (2.15) | ND | 23332.57 | |||||||||||||
| 5 | 83.4 (3.79) | 2446.7 (6.0) | 2005.5 (3.79) | 13535 (1.96) | ND | 1.68 (4.94) | 15.2 (0.91) | 2.70 (4.94) | 49.4 (8.78) | 16.9 (10.7) | ND | ND | 215.2 (2.47) | 5.99 (3.76) | ND | 18377.67 | |||||||||||||
Tabela 1: Teor de APs simples e totais (alcaloides pirrolizidínicos) das plantas daninhas nos cinco pontos de amostragem. ND representa nenhum detectado.
Tabela suplementar 1: Teor de APs simples e totais em folhas de chá fresco purificadas pelo método adsorvente. ND representa nenhum detectado. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela suplementar 2: Teor de APs simples e totais em folhas de chá fresco purificadas por SPE. ND representa nenhum detectado. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela Suplementar 3: Teor de APs simples e totais no chá seco purificado pelo método adsorvente. ND representa nenhum detectado. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela Suplementar 4: Teor de APs simples e totais no chá seco purificado por SPE. ND representa nenhum detectado. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela Complementar 5: Teor de APs simples e totais em plantas daninhas purificadas pelo método adsorvente. ND representa nenhum detectado. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela Complementar 6: Teor de APs simples e totais em plantas daninhas purificadas por SPE. ND representa nenhum detectado. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela Complementar 7: Teor de APs simples e totais em solos purificados pelo método adsorvente. ND representa nenhum detectado. Clique aqui para baixar esta tabela.
Quadro complementar 8: Teor de UC simples e total dos solos nos cinco pontos de amostragem. ND representa nenhum detectado. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
O presente trabalho foi projetado para desenvolver um método eficaz e sensível para explorar as rotas de contaminação e fontes de APs em amostras de chá, bem como a distribuição de APs em diferentes partes das plantas de chá. No entanto, neste estudo, apenas 15 APs foram separados com sucesso na coluna cromatográfica, o que é um número muito pequeno em comparação com o grande número de alcaloides nas espécies vegetais 3,4. Isso não só foi relacionado às propriedades de empacotamento da coluna em si, mas também à matriz complexa das amostras de chá examinadas. Portanto, melhores métodos de separação e purificação para detectar multi-PAs ainda precisam ser mais explorados.
Cartuchos de SPE e métodos adsorventes têm sido aplicados para detectar multi-PAs em uma variedade de matrizes de amostras, mas na matriz complexa de chá, o método adsorvente não foi relatado24. Portanto, o método adsorvente com uma proporção de GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg) foi desenvolvido neste trabalho, e as recuperações de 15 APs atenderam aos requisitos de detecção para APs em diferentes matrizes amostrais. Em contraste, as recuperações de ImNO, Eu e Re foram em média de 119%, 120% e 115%, respectivamente, no chá seco após limpeza com cartuchos SPE, que mostraram um efeito de matriz significativo. Além disso, comparado com os cartuchos de SPE, o método adsorvente (GCB:PSA:C18) apresentou menor tempo de tratamento da amostra, menor custo e melhores recuperações para análise de PA (Figura 1B). O estabelecimento de métodos de detecção para 15 APs em amostras de chá seco, folhas de chá fresco, plantas daninhas e solo forneceu um método de detecção eficaz para explorar a fonte de contaminação de APs em amostras de chá. Além disso, de acordo com o conhecimento atual, um método de detecção multi-PA no solo foi estabelecido pela primeira vez neste estudo.
A via de transferência de APs no sistema de plantio de chá foi estudada. Nossos estudos indicam que A. conyzoides foi uma das plantas daninhas com maior teor de PA total no jardim de chá Jinzhai e cresceu ao lado das plantas de chá. Portanto, A. conyzoides, A. conyzoides rhizospheric soil e as diferentes partes das folhas de chá fresco foram coletadas dos cinco pontos de amostragem em um jardim de chá em Jinzhai para analisar os 15 PAs . A Figura 3 mostra que, entre os 11 APs produzidos em A. conyzoides, apenas ImNO foi detectado em solo rizosférico de A. conyzoides, enquanto ImNO e Sn foram detectados em folhas frescas de chá . Isso indica que nem todo o conteúdo dos APs produzidos em A. conyzoides pôde ser transportado para dentro das plantas de chá através do meio do solo. Alguns teores de UCs transferidos para o solo podem ser degradados por microrganismos do solo.
ImNO e Sn foram distribuídos principalmente em uma gema com duas folhas e uma gema com três folhas, enquanto o conteúdo de APs em folhas maduras foi relativamente baixo. No ponto de amostragem 4, o teor de ImNO em uma gema com duas folhas atingiu 26,5 μg/kg, enquanto que em outras partes da planta de chá variou de 7,14-10,4 μg/kg. Sn não foi detectado em folhas maduras no ponto de amostragem 1 e no ponto de amostragem 2. Isso indica que as partes enriquecidas de APs nas plantas de chá estavam concentradas principalmente nas folhas jovens, e o conteúdo estava muito abaixo do limite máximo de resíduos de APs em amostras de chá estabelecido pela União Europeia (150 μg/kg para adultos, 75 μg/kg para lactentes e crianças pequenas)25. Os resultados revelam que os APs nas amostras de chá podem ser provenientes de plantas daninhas produtoras de AF em jardins de chá via solo. Além disso, os resultados confirmam a transferência e troca de APs entre plantas17.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Scientific Foundation of China (32102244), pelo National Agricultural Products Quality and Safety and Risk Assessment Project (GJFP2021001), pela Natural Scientific Foundation of Anhui Province (19252002) e pelo USDA (HAW05020H).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115197 | CAS No:75-05-8 |
| Ammonia (25%-28%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 181210 | CAS No:1336-21-6 |
| Ammonium formate (97.0%) | Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) | G0860050 | CAS No:540-69-2 |
| Carbon-GCB | CNW | B7760030 | 120-400 MESH, 10g. per box |
| Centrifuge Z 36 HK | HERMLE | Z36HK | 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm |
| Commercially available tea product | Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun | loose tea | Green tea |
| Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) | BioCrick | 323256 | CAS No:65582-53-8 |
| Europine (Eu) (98.0%) | BioCrick | 98222 | CAS No:570-19-4 |
| Formate (98.0%) | Aladdin | E2022005 | CAS No:64-18-6 |
| HC-C18 | CNW | D2110060 | 40-63 μm,100g.per box |
| Heliotrine (He) (98.0%) | BioCrick | 906426 | CAS No:303-33-3 |
| Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) | BioCrick | 22581 | CAS No:6209-65-0 |
| High speed centrifuge TG16-WS | cence | 203158000 | Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL |
| HSS T3 column | Waters | 186004976 | ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm) |
| Intermedine (Im) (98.0%) | BioCrick | 114843 | CAS No:10285-06-0 |
| Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) | BioCrick | 340066 | CAS No:95462-14-9 |
| Jacobine (Jb) (98.0%) | BioCrick | 132282048 | CAS No:6870-67-3 |
| Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) | ChemFaces | CFN00461 | CAS No:38710-25-7 |
| Methyl Alcohol (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115100 | CAS No:67-56-1 |
| PSA | Agela | P19-00833 | 40-60 μm, 60 Å 100g.per box |
| Retrorsine (Re) (98.0%) | BioCrick | 5281743 | CAS No:480-54-6 |
| Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) | BioCrick | 5281734 | CAS No:15503-86-3 |
| Senecionine (Sc) (98.0%) | BioCrick | 5280906 | CAS No:130-01-8 |
| Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) | BioCrick | 5380876 | CAS No:13268-67-2 |
| Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) | BioCrick | 6442619 | CAS No:38710-26-8 |
| Seneciphylline (Sp) (98.0%) | BioCrick | 5281750 | CAS No:480-81-9 |
| Senkirkine (Sk) (98.0%) | BioCrick | 5281752 | CAS No:2318-18-5 |
| SPE PCX | Agilent Technologies | 12108206 | Cation Mixed Mode, 6 mL |
| Sulfuric acid (97%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 1003019 | CAS No:7664-93-9 |
| Trisodium citrate | Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20121009 | CAS No:6132-04-3 |
| Ultrasonic cleaner | Supmile | KQ-600B | Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L |
| UPLC-xevoTQMS | Waters | ZPLYY-003 | Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System |
| Water bath thermostat oscillator | Guoyu instrument | SHY-2AHS | Oscillation times: 60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C |
References
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