Summary
Het huidige protocol beschrijft de besmetting van pyrrolizidine alkaloïden (PA's) in theemonsters van PA-producerend onkruid in theetuinen.
Abstract
Giftige pyrrolizidine-alkaloïden (PA's) worden aangetroffen in theemonsters, die een bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid. De bron en route van PA-besmetting in theemonsters zijn echter onduidelijk gebleven. In dit werk werd een adsorberende methode in combinatie met UPLC-MS/MS ontwikkeld om 15 PA's te bepalen in het onkruid Ageratum conyzoides L., A. conyzoides rhizospherische grond, verse theebladeren en gedroogde theemonsters . De gemiddelde terugvorderingen varieerden van 78% -111%, met relatieve standaardafwijkingen van 0,33% -14,8%. Vijftien paar A. conyzoides en A. conyzoides rhizosferische bodemmonsters en 60 verse theebladmonsters werden verzameld uit de Jinzhai-theetuin in de provincie Anhui, China, en geanalyseerd voor de 15 PA's . Niet alle 15 PA's werden gedetecteerd in verse theebladeren, behalve intermedine-N-oxide (ImNO) en senecionine (Sn). Het gehalte aan ImNO (34,7 μg/kg) was groter dan dat van Sn (9,69 μg/kg). Bovendien waren zowel ImNO als Sn geconcentreerd in de jonge bladeren van de theeplant, terwijl hun gehalte lager was in de oude bladeren. De resultaten gaven aan dat de PA's in thee werden overgedragen via het pad van PA-producerend onkruid-grond-verse theebladeren in theetuinen.
Introduction
Als secundaire metabolieten beschermen pyrrolizidine-alkaloïden (PA's) planten tegen herbivoren, insecten en ziekteverwekkers 1,2. Tot nu toe zijn meer dan 660 PA's en PA-N-oxiden (PANO's) met verschillende structuren gevonden in meer dan 6.000 plantensoorten wereldwijd 3,4. PA-producerende planten komen vooral voor in de families Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae en Apocynaceae 5,6. PA's worden gemakkelijk geoxideerd tot onstabiele dehydropyrrolizidine-alkaloïden, die een sterke elektrofielheid hebben en nucleofielen zoals DNA en eiwitten kunnen aanvallen, wat resulteert in levercelnecrose, veneuze occlusies, cirrose, ascites en andere symptomen 7,8. Het belangrijkste doelorgaan van PA-toxiciteit is de lever. PA's kunnen ook long-, nier- en andere orgaantoxiciteit en mutagene, carcinogene en ontwikkelingstoxiciteit veroorzaken 9,10.
Gevallen van menselijke en dierlijke vergiftiging zijn in veel landen gemeld door de inname van traditionele kruiden, supplementen of thee die PA's bevatten of de indirecte besmetting van voedingsmiddelen zoals melk, honing of vlees (giftig door inname van weidegrond die PA's bevat)11,12,13. De bevindingen van de Europese Autoriteit voor voedselveiligheid (EFSA) geven aan dat stoffen zoals (kruiden)thee een belangrijke bron van menselijke blootstelling aan PA's/PANO'szijn 14. Theemonsters produceren geen PA's, terwijl PA-producerende planten vaak worden aangetroffen in theetuinen (bijv. Emilia sonchifolia, Senecio angulatus en Ageratum conyzoides)15. Eerder werd vermoed dat de thee tijdens het plukken en verwerken besmet kon zijn met PA's uit hun producerende fabrieken. PA's werden echter ook gedetecteerd in sommige met de hand geplukte theebladeren (d.w.z. geen PA-producerende planten), wat suggereert dat er andere routes of bronnen van besmetting moeten zijn16. Een co-teeltexperiment van jakobskruiskruid (Senecio jacobaea) met melissa (Melissa officinalis), pepermunt (Mentha piperita), peterselie (Petroselinum crispum), kamille (Matricaria recutita) en nasturtium (Tropaeolum majus) planten werd uitgevoerd, en de resultaten toonden aan dat PA's werden gedetecteerd in al deze planten17. Er is geverifieerd dat PA's inderdaad worden overgedragen en uitgewisseld tussen levende planten via bodem18,19. Van Wyk et al.20 vonden dat rooibosthee (Aspalathus linearis) ernstig verontreinigd was op onkruidrijke locaties en PA's van hetzelfde type en dezelfde verhouding bevatte. Er werden echter geen PA's gedetecteerd in rooibosthee op onkruidvrije locaties.
Op dit moment wordt ultra-high performance vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (UPLC-MS/MS) met hoge selectiviteit en gevoeligheid op grote schaal gebruikt bij de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van PA's in landbouwproducten en levensmiddelen21,22. De monsterbehandelingsmethode bestaat meestal uit vaste fase extractie (SPE) of de QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) reiniging van complexe voedselmatrices extracten, die de hoogst mogelijke gevoeligheid12,19 kunnen verkrijgen. Robuuste analysemethoden die de detectie en kwantificering van PA's in complexe matrices zoals aarde, onkruid en verse theebladeren mogelijk maken, ontbreken echter nog steeds.
Deze studie analyseerde 15 PA's in gedroogde theemonsters, verse theebladeren, onkruid en onkruid rhizosferische bodemmonsters met UPLC-MS / MS in combinatie met een adsorberende zuiveringsmethode. Bovendien werden 15 gepaarde onkruid- en onkruid rhizosferische bodemmonsters en 60 verse theebladmonsters verzameld van vijf bemonsteringslocaties in de Jinzhai-theetuin in de provincie Anhui, China, en werden geanalyseerd op 15 PA's. Deze resultaten kunnen een onderzoeksmethode en enige informatie over de bron en route van PA's (verontreiniging) in theemonsters opleveren om de kwaliteit en veiligheid van thee te waarborgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor dit onderzoek werden de volgende onkruidsoorten verzameld: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L., en Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore. De verse theebladeren werden geplukt uit de variëteit van Longjing 43 # theebomen en de gedroogde theemonsters waren commercieel verkrijgbare thee verwerkt volgens het productieproces van groene thee (zie tabel met materialen).
1. Monsterverzameling
- Verzamel 40 echte monsters.
- Verzamel 10 onkruiden, 10 bodems en 10 verse theebladeren willekeurig uit meerdere theetuinen.
OPMERKING: Voor dit onderzoek werd de grond bemonsterd op een diepte van 20 cm met een monsterhoeveelheid van 200 g. - Verzamel willekeurig 10 gedroogde theeproducten (250 g) uit een supermarkt.
- Verzamel 10 onkruiden, 10 bodems en 10 verse theebladeren willekeurig uit meerdere theetuinen.
- Verzamel monsters van onkruid, aarde en verse theebladeren om de besmettingsbron van PA's in thee te bestuderen.
- Stel vijf bemonsteringspunten in dezelfde theetuin in, met drie replica's op elk punt.
- Verzamel Ageratum conyzoides L. onkruidmonsters met het hoogste PA-gehalte dat vaak wordt aangetroffen in theetuinen.
OPMERKING: De steekproefhoeveelheid was 250 g voor dit onderzoek. - Verzamel de bodemmonsters.
OPMERKING: De bodemmonsters waren A. conyzoides rhizosferische grond op een diepte van 20 cm met een monsterhoeveelheid van 200 g. - Verzamel de verse theebladeren van verschillende delen van de theeplanten, waaronder een knop met twee bladeren, een knop met drie bladeren, een knop met vier bladeren en volwassen bladeren.
OPMERKING: De monsterhoeveelheid was 250 g.
2. Monsterbehandeling
- Behandel de monsters voor volgens de onderstaande stappen.
- Maal de gedroogde thee- en grondmonsters met een molen, haal de verpulverde monsters door een zeef met 200 mazen en bewaar ze bij −20 °C.
OPMERKING: De gedroogde thee was een in de handel verkrijgbaar theeproduct (zie tabel met materialen), dus het werd direct geplet en gezeefd voor opslag. De bodemmonsters (200 g) werden op een geventileerde plaats in het donker geplaatst om ongeveer een week aan de lucht te drogen. - Homogeniseer de wiet en verse theebladeren met een homogenisator en bewaar ze bij −20 °C.
- Maal de gedroogde thee- en grondmonsters met een molen, haal de verpulverde monsters door een zeef met 200 mazen en bewaar ze bij −20 °C.
- Voer een monsterbehandeling uit van de gedroogde theeproducten, verse theebladeren en onkruid.
- Weeg 1,00 g van elk monster af (gedroogde theeproducten, verse theebladeren en onkruid) en plaats het in een centrifugebuis van 50 ml.
- Voeg 10 ml zwavelzuuroplossing van 0,1 mol/l en vortex toe gedurende 2 minuten voor vastefase-extractie (met behulp van SPE-patroon, zie materiaaltabel) en 1 minuut voor adsorbenszuivering. Voer ultrasone extractie23 uit gedurende 15 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten met een snelheid van 9.390 x g bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het vermogen van de ultrasone oscillator was 290 W, de oscillatiefrequentie was 35 kHz en de temperatuur was ingesteld op 30 °C. - Breng het supernatant over in een centrifugebuis van 50 ml met een druppelaar met plastic punt.
- Volg de bovenstaande stappen om de extractie eenmaal te herhalen. Combineer de twee supernatanten.
- Activeer de SPE-patronen met 5 ml methanol en 5 ml gedeïoniseerd water. Voeg 10 ml supernatant toe aan de vooraf geactiveerde patroon en voer het monsterreiniging uit.
- Nadat het niveau van de monsteroplossing de bovenste laag patronen heeft bereikt, elueert u de analyten met 5 ml 1% mierenzuuroplossing en vervolgens 5 ml methanol. Gooi het eluaat weg.
- Elueer met 5 ml methanol (met 0,5% ammoniakwater), filtreer het eluaat door een membraanfilter van 0,22 μm en analyseer met UPLC-MS/MS (zie materiaaltabel).
- Voer het opschonen van monsters uit met adsorbentia.
- Neem 2 ml van het supernatant (stap 2.2.4) in een centrifugebuis van 10 ml gevuld met de adsorbentia van GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg, zie materiaaltabel), vortex gedurende 1 minuut en centrifugeer gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur bij 9.390 x g .
- Laat 1 ml van het supernatant door een membraanfilter van 0,22 μm lopen vóór analyse door UPLC-MS/MS.
- Voer de behandeling van de bodemmonsters uit.
- Weeg een bodemmonster van 1,00 g af. Plaats het in een centrifugebuis van 50 ml en voeg 0,1 ml 0,1 mol/l trinatriumcitraatoplossing toe (zie materiaaltabel) om de pH-waarde van de bodem aan te passen naar 6,0.
- Laat 2 minuten staan en voeg vervolgens 10 ml 0,1 mol / L zwavelzuur-methanoloplossing, vortex gedurende 2 minuten en schud gedurende 30 minuten toe en voer vervolgens ultrasone extractie gedurende 30 minuten uit.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten op 9.390 x g en breng het supernatant over in een centrifugebuis van 50 ml met een druppelaar met plastic punt.
- Volg de bovenstaande stappen om de extractie te herhalen en combineer het supernatant twee keer.
OPMERKING: De zuiveringsmethode was dezelfde als in stap 2.2.5.1 en stap 2.2.5.2.
3. Instrumentele analyse
- Detecteer de 15 PA's in gedroogde theemonsters, verse theebladeren, wiet en aarde (monsters uit stap 2) met behulp van een in de handel verkrijgbaar UPLC-MS/MS-systeem (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) (zie materiaaltabel).
- Stel de kolomtemperatuur in op 40 °C, het debiet op 0,250 ml/min en het injectievolume op 3 μl.
- Stel de mobiele fase A in: methanol (met 0,1% mierenzuur + 1 mmol/L ammoniumformiaat) en mobiele fase B: water (met 0,1% mierenzuur + 1 mmol/L ammoniumformiaat).
- Stel een gradiëntretrelutieprocedure in: 10% A van 0,0 min tot 0,25 min, 10%-30% A van 0,25 min tot 6,0 min, 30%-40% A van 6,0 min tot 9,0 min, 40%-98% A van 9,0 min tot 9,01 min die 1,9 min werd vastgehouden en 98%-100% A van 11,0 min tot 11,1 min die 2,9 min werd vastgehouden.
- Stel de massaspectrometerparameters in: ionisatiemodus, elektrospraypositieve ionenbron (ESI +); verstuiver druk, 7,0 bar; capillaire spanning, 4,0 kV; taps toelopend gat terugblaasstroom, 150 L/h; oplosmiddelgasstroom, 800 l/h; temperatuur van het oplosmiddel, 400 °C; impactgasstroom, 0,25 ml/min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De geoptimaliseerde adsorberende zuiverings- en analysemethode van 15 PA's in gedroogde theemonsters, verse theebladeren, onkruid en aarde werd vastgesteld en vergeleken met de veelgebruikte zuiveringsmethode met behulp van de SPE-cartridge. De resultaten toonden aan dat de terugwinningen van de 15 PA's in gedroogde theemonsters, wiet en verse theebladeren met behulp van de SPE-patroon 72% -120% waren, terwijl die met adsorbenszuivering 78% -98% was (figuur 1). De terugwinningen van de 15 PA's in de bodem met behulp van adsorberende zuivering waren 79%-111% (figuur 1). Veertig (40) echte monsters werden willekeurig verzameld om de inhoud van PA's te detecteren om de twee opruimmethoden te vergelijken (aanvullende tabellen 1-7). Heliotrine (He) werd gedetecteerd in alle 10 gedroogde theemonsters met behulp van de adsorbensmethode met een inhoud van 1,3-22 μg / kg, terwijl het alleen werd gedetecteerd in drie gedroogde theemonsters met behulp van de SPE-patroon met een inhoud van 1,8-24,6 μg / kg (aanvullende tabellen 3-4).
De adsorberende zuiveringsmethode (GCB:PSA:C18) werd geselecteerd om PA's te detecteren in onkruid, onkruid rhizosferische bodems en verse theebladeren in theeplantagesystemen. Vijf bemonsteringslocaties werden gekozen in één theetuin in Jinzhai. Naast jacobine (Jb), seneciphylline (Sp), seneciphylline N-oxid (SpNO) en senkirkine (Sk) werden in totaal 11 PA's gedetecteerd in het onkruid A. conyzoides, waarvan het hoogste gehalte aan PA's intermedine (Im) (2.006-2.970 μg/kg), heliotrine-N-oxide (HeNO) (2.446-2.731 μg/kg) en intermedine-N-oxide (ImNO) (13.535-17.345 μg/kg) was (tabel 1). In de bodem werd alleen ImNO aangetroffen op bemonsteringsplaats 5, met een gehalte van 6,05 μg/kg (aanvullende tabel 8). ImNO en Sn werden gedetecteerd in de verse theebladeren van de vijf bemonsteringslocaties (figuur 2). ImNO werd gedetecteerd in verschillende delen van de theeplanten en het gehalte varieerde van 4,36-26,5 μg / kg, wat groter was dan dat van Sn, behalve dat Sn niet werd gedetecteerd in volwassen bladeren van bemonsteringsplaats 1 en bemonsteringsplaats 2. Sn werd gedetecteerd in verschillende delen van de theeplanten in de andere bemonsteringsplaatsen en het gehalte varieerde van 1,0-3,14 μg / kg (figuur 2).
Op bemonsteringslocatie 5 werd het overdrachtsfenomeen van PA's tussen het onkruid, de wortelgrond van onkruid en verse theebladeren getoond (figuur 3). Van de 11 PA's onkruid werd alleen ImNO gedetecteerd in de bodem, met een gehalte van 6,05 μg / kg, terwijl ImNO en Sn werden gedetecteerd in verschillende delen van de theeplanten. Het gehalte aan ImNO in één knop met twee bladeren was het hoogst, namelijk 12,6 μg/kg (figuur 3).
Figuur 1: Herstelvergelijking. Vergelijking van de terugwinningen van 15 PA's (pyrrolizidine-alkaloïden) in extracten van (A) verse theebladeren, (B) gedroogde theemonsters, (C) wiet en (D) bodemmonsters bij reiniging met het adsorbens (piekniveau = 0,02 mg / kg) en SPE-patronen (gemengde kationenuitwisseling vaste-fase extractiekolommen, piekniveau = 0,01 mg / kg). De foutbalken tonen de standaarddeviatie en de significantietest werd uitgevoerd door variantieanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het gehalte en de soorten PA's (pyrrolizidine-alkaloïden) in verschillende delen van de theeplanten verzameld op de vijf bemonsteringsplaatsen. A) Bemonsteringsplaats 1. B) Bemonsteringsplaats 2. C) Bemonsteringsplaats 3. D) Bemonsteringsplaats 4. E) Bemonsteringsplaats 5. De foutbalken tonen de standaarddeviatie en de significantietest werd uitgevoerd door variantieanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: PA's in onkruid en hun overdracht naar grond en verse theebladeren. (A) Het gehalte en type PA's (pyrrolizidine-alkaloïden) gedetecteerd in het onkruid, de grond en verse theebladeren. (B) Het gehalte en het type PA's dat in het onkruid wordt aangetroffen. De foutbalken tonen de standaarddeviatie en de significantietest werd uitgevoerd door variantieanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Samp-ling site | Het gemiddelde gehalte aan afzonderlijke BO's (± relatieve standaardafwijkingen), μg/kg | Het gehalte aan totale BO's (μg/kg) | |||||||||||||||||||||||||||
| Hij | Heno | Im | Imno | Jb | JbNO | Re | Reno | Sn | Snno | Sp | Sp NEE |
EU | Euno | Sk | |||||||||||||||
| 1 | 97.4 (2.43) | 2731.1 (2.04) | 2424.9 (1.84) | 13754 (0.56) | ND | 1.92 (1.54) | 21.2 (10.45) | 4.01 (5.72) | 58.4 (2.52) | 17.2 (9.03) | ND | ND | 224.0 (1.75) | 6.9 (2.02) | ND | 19341.03 | |||||||||||||
| 2 | 83.9 (1.21) | 2518.6 (0.81) | 2476.5 (1.15) | 13945 (0.30) | ND | 2.60 (2.52) | 28.8 (1.51) | 4.82 (3.66) | 63.7 (3.52) | 19.8 (10.2) | ND | ND | 248.6 (1.48) | 7.0 (1.58) | ND | 19399.32 | |||||||||||||
| 3 | 96.6 (1.67) | 2470.4 (1.08) | 2969.7 (1.02) | 16829 (0.36) | ND | 2.12 (1.08) | 20.9 (9.30) | 2.94 (1.08) | 51.0 (7.50) | 14.9 (8.25) | ND | ND | 252.1 (3.17) | 5.91 (0.35) | ND | 22715.57 | |||||||||||||
| 4 | 91.4 (1.98) | 2638.6 (2.75) | 2882.4 (1.98) | 17345 (0.76) | ND | 2.42 (10.59) | 15.4 (6.99) | 2.67 (10.59) | 51.6 (6.73) | 15.0 (0.92) | ND | ND | 281.3 (2.36) | 6.78 (2.15) | ND | 23332.57 | |||||||||||||
| 5 | 83.4 (3.79) | 2446.7 (6.0) | 2005.5 (3.79) | 13535 (1.96) | ND | 1.68 (4.94) | 15.2 (0.91) | 2.70 (4.94) | 49.4 (8.78) | 16.9 (10.7) | ND | ND | 215.2 (2.47) | 5.99 (3.76) | ND | 18377.67 | |||||||||||||
Tabel 1: Het gehalte aan enkelvoudige en totale PA's (pyrrolizidine-alkaloïden) van onkruid in de vijf bemonsteringsplaatsen. ND staat voor geen gedetecteerd.
Aanvullende tabel 1: Het gehalte aan afzonderlijke en totale BO's in verse theebladeren die volgens de adsorbensmethode zijn gezuiverd. ND staat voor geen gedetecteerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Het gehalte aan afzonderlijke en totale BO's in verse theebladeren gezuiverd door SPE. ND staat voor geen gedetecteerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 3: Het gehalte aan afzonderlijke en totale BO's in gedroogde thee die volgens de adsorbensmethode is gezuiverd. ND staat voor geen gedetecteerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 4: Het gehalte aan afzonderlijke en totale BO's in gedroogde thee gezuiverd door SPE. ND staat voor geen gedetecteerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 5: Het gehalte aan enkelvoudige en totale BO's in onkruiden die volgens de adsorbensmethode zijn gezuiverd. ND staat voor geen gedetecteerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 6: Het gehalte aan afzonderlijke en totale BO's in onkruid dat door SPE is gezuiverd. ND staat voor geen gedetecteerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 7: Het gehalte aan afzonderlijke en totale BO's in bodems die zijn gezuiverd met behulp van de adsorbensmethode. ND staat voor geen gedetecteerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 8: Het gehalte aan afzonderlijke en totale BO's van bodems in de vijf bemonsteringslocaties. ND staat voor geen gedetecteerd. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige werk was bedoeld om een effectieve, gevoelige methode te ontwikkelen om de besmettingsroutes en bronnen van PA's in theemonsters te onderzoeken, evenals de distributie van PA's in verschillende delen van de theeplanten. In deze studie werden echter slechts 15 PA's met succes gescheiden op de chromatografische kolom, wat een zeer klein aantal is in vergelijking met het grote aantal alkaloïden in plantensoorten 3,4. Dit had niet alleen te maken met de verpakkingseigenschappen van de kolom zelf, maar ook met de complexe matrix van de onderzochte theemonsters. Daarom moeten betere scheidings- en zuiveringsmethoden voor het detecteren van multi-PA's nog verder worden onderzocht.
SPE-patronen en adsorberende methoden zijn toegepast om multi-PA's in verschillende monstermatrices te detecteren, maar in de complexe matrix van thee is de adsorberende methode niet gerapporteerd24. Daarom werd in dit werk de adsorbensmethode met een verhouding van GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg) ontwikkeld en voldeden de terugvorderingen van 15 PA's aan de detectievereisten voor PA's in verschillende monstermatrices. ImNO-, Eu- en Re-terugwinningen daarentegen bedroegen gemiddeld respectievelijk 119%, 120% en 115% in gedroogde thee na het opruimen met SPE-cartridges, wat een significant matrixeffect vertoonde. Bovendien had de adsorberende (GCB:PSA:C18)-methode in vergelijking met SPE-patronen een kortere monsterbehandelingstijd, lagere kosten en betere terugwinningen voor PA-analyse (figuur 1B). Het vaststellen van detectiemethoden voor 15 PA's in gedroogde theemonsters, verse theebladeren, onkruid en grond bood een effectieve detectiemethode voor het onderzoeken van de besmettingsbron van PA's in theemonsters. Bovendien is volgens de huidige kennis in deze studie voor het eerst een multi-PA detectiemethode in de bodem vastgesteld.
De overdrachtsroute van PA's in het theeplantagesysteem werd bestudeerd. Onze studies geven aan dat A. conyzoides een van de onkruiden was met het hoogste totale PA-gehalte in de Jinzhai-theetuin en het groeide naast de theeplanten. Daarom werden A. conyzoides, A. conyzoides rhizospherische grond en de verschillende delen van verse theebladeren verzameld van de vijf bemonsteringslocaties in één theetuin in Jinzhai om de 15 PA's te analyseren. Figuur 3 laat zien dat van de 11 PA's geproduceerd in A. conyzoides, alleen ImNO werd gedetecteerd in A. conyzoides rhizospherische grond, terwijl ImNO en Sn werden gedetecteerd in verse theebladeren. Dit geeft aan dat niet alle inhoud van de PA's geproduceerd in A. conyzoides via het bodemmedium in de theeplanten kan worden getransporteerd. Een deel van de inhoud van de BO's die in de bodem worden overgebracht, kan door bodemmicro-organismen worden afgebroken.
ImNO en Sn werden voornamelijk verdeeld in één knop met twee bladeren en één knop met drie bladeren, terwijl het gehalte aan PA's in volwassen bladeren relatief laag was. Op bemonsteringsplaats 4 bereikte het gehalte aan ImNO in één knop met twee bladeren 26,5 μg/kg, terwijl dat in andere delen van de theeplant varieerde van 7,14-10,4 μg/kg. Sn werd niet gedetecteerd in volwassen bladeren op bemonsteringsplaats 1 en bemonsteringsplaats 2. Dit geeft aan dat de verrijkte delen van PA's in theeplanten voornamelijk geconcentreerd waren in de jonge bladeren en dat het gehalte ver onder de door de Europese Unie vastgestelde maximale residulimiet van PA's in theemonsters lag (150 μg/kg voor volwassenen, 75 μg/kg voor zuigelingen en jonge kinderen)25. De resultaten laten zien dat de PA's in theemonsters afkomstig kunnen zijn van PA-producerend onkruid in theetuinen via de bodem. Bovendien bevestigen de resultaten de overdracht en uitwisseling van PA's tussen planten17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Scientific Foundation of China (32102244), het National Agricultural Products Quality and Safety and Risk Assessment Project (GJFP2021001), de Natural Scientific Foundation of Anhui Province (19252002) en de USDA (HAW05020H).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115197 | CAS No:75-05-8 |
| Ammonia (25%-28%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 181210 | CAS No:1336-21-6 |
| Ammonium formate (97.0%) | Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) | G0860050 | CAS No:540-69-2 |
| Carbon-GCB | CNW | B7760030 | 120-400 MESH, 10g. per box |
| Centrifuge Z 36 HK | HERMLE | Z36HK | 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm |
| Commercially available tea product | Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun | loose tea | Green tea |
| Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) | BioCrick | 323256 | CAS No:65582-53-8 |
| Europine (Eu) (98.0%) | BioCrick | 98222 | CAS No:570-19-4 |
| Formate (98.0%) | Aladdin | E2022005 | CAS No:64-18-6 |
| HC-C18 | CNW | D2110060 | 40-63 μm,100g.per box |
| Heliotrine (He) (98.0%) | BioCrick | 906426 | CAS No:303-33-3 |
| Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) | BioCrick | 22581 | CAS No:6209-65-0 |
| High speed centrifuge TG16-WS | cence | 203158000 | Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL |
| HSS T3 column | Waters | 186004976 | ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm) |
| Intermedine (Im) (98.0%) | BioCrick | 114843 | CAS No:10285-06-0 |
| Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) | BioCrick | 340066 | CAS No:95462-14-9 |
| Jacobine (Jb) (98.0%) | BioCrick | 132282048 | CAS No:6870-67-3 |
| Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) | ChemFaces | CFN00461 | CAS No:38710-25-7 |
| Methyl Alcohol (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115100 | CAS No:67-56-1 |
| PSA | Agela | P19-00833 | 40-60 μm, 60 Å 100g.per box |
| Retrorsine (Re) (98.0%) | BioCrick | 5281743 | CAS No:480-54-6 |
| Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) | BioCrick | 5281734 | CAS No:15503-86-3 |
| Senecionine (Sc) (98.0%) | BioCrick | 5280906 | CAS No:130-01-8 |
| Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) | BioCrick | 5380876 | CAS No:13268-67-2 |
| Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) | BioCrick | 6442619 | CAS No:38710-26-8 |
| Seneciphylline (Sp) (98.0%) | BioCrick | 5281750 | CAS No:480-81-9 |
| Senkirkine (Sk) (98.0%) | BioCrick | 5281752 | CAS No:2318-18-5 |
| SPE PCX | Agilent Technologies | 12108206 | Cation Mixed Mode, 6 mL |
| Sulfuric acid (97%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 1003019 | CAS No:7664-93-9 |
| Trisodium citrate | Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20121009 | CAS No:6132-04-3 |
| Ultrasonic cleaner | Supmile | KQ-600B | Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L |
| UPLC-xevoTQMS | Waters | ZPLYY-003 | Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System |
| Water bath thermostat oscillator | Guoyu instrument | SHY-2AHS | Oscillation times: 60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C |
References
- Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498 (2019).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed. EFSA Journal. 9 (11), 134 (2011).
- Ma, C., et al. Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).
- Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. Encyclopedia of Food Chemistry. Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. 1, Elsevier. 348-355 (2019).
- Huang, D. Y., et al. Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea. Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).
- Liang, A. H., Ye, Z. G. General situation of the toxicity researches on Senecio. China Journal of Chinese Materia Medica. 31 (2), 93-97 (2006).
- Li, Y. H., et al. Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats. Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).
- Jia, Z. J., et al. Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity. The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).
- Yang, M., et al. First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans. Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).
- Chen, Z., Huo, J. R. Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).
- Mattocks, A. R. Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloid. , Academic Press. London, UK. (1986).
- Picron, J. F., Herman, M., Van Hoeck, E., Goscinny, S. Analytical strategies for the determination of pyrrolizidine alkaloids in plant based food and examination of the transfer rate during the infusion process. Food Chemistry. 266, 514-523 (2018).
- Kowalczyk, E., Kwiatek, K. Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas. Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA Journal. 15 (7), 04908 (2017).
- Han, H., et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk. Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).
- Nowak, M., et al. Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities. Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).
- Selmar, D., et al. Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations. Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).
- Izcara, S., et al. Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs. Food Chemistry. 380, 132189 (2022).
- Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples. Foods. 9 (9), 1319 (2020).
- Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis). South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).
- Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).
- Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea. Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).
- Han, H. L., et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds. Food control. 132, 108518 (2022).
- Bodi, D., et al. Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey. Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).
- European Union Commission. Commission Regulation (EU) 2020/2040 of 11 December 2020 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of pyrrolizidine alkaloids in certain foodstuffs. Official Journal of the European Union. 14 (12), 1-4 (2020).
