Summary
本协议描述了茶园中产生PA的杂草的茶样中吡咯里西啶生物碱（PA）的污染。
Abstract
在茶叶样品中发现了有毒的吡咯里西啶生物碱（PAs），对人体健康构成威胁。然而，茶叶样品中PA污染的来源和途径尚不清楚。本研究采用吸附剂方法结合UPLC-MS/MS测定了松 柏 根际土壤、圆 锥孢子草 根际土壤、新鲜茶叶和干茶样品中的15个PA。平均回收率为78%-111%，相对标准差为0.33%-14.8%。以安徽省金寨茶园为研究对象，采集了15对圆 锥苣 苔和 圆锥苣苔 根际土壤样品和60个鲜茶叶样品，并对15个茶叶进行了分析。并非所有15种PA都在新鲜茶叶中检测到，除了中间体-N-氧化物（ImNO）和Senecionine（Sn）。ImNO（34.7 μg/kg）的含量大于Sn（9.69 μg/kg）。此外，ImNO和Sn均集中在茶树的嫩叶中，而在老叶中含量较低。结果表明：茶叶中的PAs通过茶园产PA杂草-土壤-鲜茶叶的路径转移。
Introduction
作为次级代谢物，吡咯里西啶生物碱 （PA） 保护植物免受食草动物、昆虫和病原体的侵害1，2.到目前为止，已在全球6，000多种植物物种中发现了660多种具有不同结构的PA和PA-N-氧化物（PANO）3，4。产PA的植物主要分布在 菊科、 苜蓿科、 豆科和 顶生科5，6中。PAs易氧化成不稳定的脱氢吡咯里西啶生物碱，具有较强的亲电性，可攻击DNA和蛋白质等亲核试剂，导致肝细胞坏死、静脉闭塞、肝硬化、腹水等症状7，8。PA毒性的主要靶器官是肝脏。PA还可引起肺、肾和其他器官毒性以及致突变、致癌和发育毒性9，10。
许多国家报告了人类和动物中毒的病例，原因是摄入含有PAs的传统草药、补充剂或茶，或间接污染牛奶、蜂蜜或肉类等食物（摄入含有PAs的牧场有毒）11，12，13。欧洲食品安全局（EFSA）的调查结果显示，（草药）茶等物质是人类接触PAs/PANOs的重要来源14。茶样不产生PA，而产生PA的植物常见于茶园（例如，Emilia sonchifolia，Senecio angulatus和Ageratum conyzoides）15。以前怀疑茶叶可能在采摘和加工过程中被其生产植物的PA污染。然而，在一些手工采摘的茶叶中也检测到PAs（即没有产生PA的植物），这表明一定有其他途径或污染源16。对豚草（Senecio jacobaea）与Melissa（Melissa officinalis），薄荷（薄荷（薄荷），欧芹（Petrroselinum crispum），洋甘菊（Matricaria recutita）和金莲花（Tropaeolum majus）植物进行了共栽培实验，结果表明，在所有这些植物中都检测到PAs17。已经证实，PA确实通过土壤在活植物之间转移和交换18，19。Van Wyk等人20发现路易波士茶（Aspalathus linearis）在杂草丰富的地点受到严重污染，并且含有相同类型和比例的PA。然而，在无杂草地点的路易波士茶中没有检测到PA。
目前，具有高选择性和灵敏度的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）已广泛应用于农产品和食品中PAs的定性和定量分析21，22。样品处理方法通常包括固相萃取（SPE）或QuEChERS（快速简便廉价坚固安全）对复杂食品基质提取物的净化，可以获得尽可能高的灵敏度12，19。然而，仍然缺少能够检测和定量土壤、杂草和新鲜茶叶等复杂基质中的PA的稳健分析方法。
本研究采用UPLC-MS/MS结合吸附纯化方法分析了干茶样品、鲜茶叶、杂草和杂草根际土壤样品中的15种PA。此外，从安徽省金寨茶园的5个采样点采集了15个配对杂草和杂草根际土壤样品和60个新鲜茶叶样品，并对15个PA进行了分析。这些结果可以提供茶样中PAs（污染）来源和途径的调查方法和一些信息，以确保茶叶的质量和安全。
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Protocol
在本研究中，收集了以下杂草种类：路德维希亚匍匐罗克斯布，穆尔达尼亚特里克特拉（沃尔前C.B.克拉克）布鲁克，圆锥藜，藜藜，茉莉花气管（L.）莱姆，圆锥苣苔，艾米利亚松子（L.DC），圆锥苣苔L.和裂头螨 （本。S·摩尔。新鲜茶叶采摘自龙井43#茶树品种，干茶样品为市售茶叶，按绿茶制造工艺加工而成（见材料表）。
1. 样品采集
- 收集 40 个真实样本。
- 从多个茶园随机收集 10 根杂草、10 片土壤和 10 片新鲜茶叶。
注意：对于本研究，在20厘米的深度对土壤进行取样，取样量为200克。 - 从超市随机收集10种干茶产品（250克）。
- 从多个茶园随机收集 10 根杂草、10 片土壤和 10 片新鲜茶叶。
- 收集杂草，土壤和新鲜茶叶的样本，以研究茶叶中PA的污染源。
- 在同一茶园中设置五个采样点，每个点三个重复。
- 收集茶园中常见的PA含量最高的针 叶 松柏杂草样品。
注意：本研究的样品量为250克。 - 收集土壤样本。
注：土壤样品为20厘米深度的A . conyzoides 根际土壤，样品量为200克。 - 从茶树的不同部位收集新鲜的茶叶，包括一个芽两叶，一个芽三叶，一个芽四叶和成熟叶。
注意：样品量为250克。
2. 样品处理
- 按照以下步骤对样品进行预处理。
- 用研磨机研磨干燥的茶和土壤样品，将粉碎的样品通过200目筛，并将其储存在-20°C。
注意：干茶是市售的茶产品（见 材料表），因此直接粉碎并过筛储存。将土壤样品（200 g）置于通风处避光风干约一周。 - 用均质机均质杂草和新鲜茶叶，并将其储存在-20°C。
- 用研磨机研磨干燥的茶和土壤样品，将粉碎的样品通过200目筛，并将其储存在-20°C。
- 对干茶产品、新鲜茶叶和杂草进行样品处理。
- 称取每个样品（干茶产品、新鲜茶叶和杂草）的 1.00 g，并将其放入 50 mL 离心管中。
- 加入 10 mL 的 0.1 mol/L 硫酸溶液并涡旋 2 分钟进行固相萃取（使用 SPE 柱，参见 材料表）和 1 分钟进行吸附剂纯化。进行超声提取2315 分钟，然后在室温下以9，390× g 的速度离心10分钟。
注意：超声波振荡器的功率为290 W，振荡频率为35 kHz，温度设置为30°C。 - 将上清液转移到带有塑料尖端滴管的 50 mL 离心管中。
- 按照上述步骤重复提取一次。合并两个上清液。
- 用 5 mL 甲醇和 5 mL 去离子水激活 SPE 滤芯。向预活化的柱中加入 10 mL 上清液并进行样品净化。
- 样品溶液液位达到上层柱后，用5 mL 1%甲酸溶液和5 mL甲醇洗脱分析物。丢弃洗脱液。
- 用5 mL甲醇（含0.5%氨水）洗脱，通过0.22 μm膜过滤器过滤洗脱液，并通过UPLC-MS/MS分析（见 材料表）。
- 使用吸附剂进行样品净化。
- 取2mL上清液（步骤2.2.4）放入装有GCB：PSA：C18吸附剂（10mg：20mg：15mg，见 材料表）吸附剂的10mL离心管中，涡旋1分钟，室温下以9，390× g 离心8分钟。
- 在通过UPLC-MS/MS分析之前，将1 mL上清液通过0.22 μm膜过滤器。
- 对土壤样品进行处理。
- 称取 1.00 克土壤样品。将其放入50 mL离心管中，加入0.1 mL的0.1mol/L柠檬酸三钠溶液（见 材料表），将土壤pH值调节至6.0。
- 静置2分钟，然后加入10mL0.1mol/L硫酸甲醇溶液，涡旋2分钟，摇动30分钟，然后进行超声提取30分钟。
- 以 9，390 x g 离心 10 分钟，并将上清液转移到带有塑料尖端滴管的 50 mL 离心管中。
- 按照上述步骤重复提取并合并上清液两次。
注：纯化方法与步骤2.2.5.1和步骤2.2.5.2相同。
3. 仪器分析
- 使用市售UPLC-MS/MS系统（2.1 mm x 100 mm，1.8 μm）检测干茶样品、新鲜茶叶、杂草和土壤（步骤2中的样品）中的15种PA（参见 材料表）。
- 将柱温设置为40°C，流速设置为0.250 mL/min，进样体积设置为3 μL。
- 设置流动相A：甲醇（含0.1%甲酸+1毫摩尔/L甲酸铵），流动相B：水（含0.1%甲酸+1毫摩尔/升甲酸铵）。
- 设置梯度洗脱程序：0.0分钟至0.25分钟为10%A，0.25分钟至6.0分钟为10%-30%A，6.0分钟至9.0分钟为30%-40%A，9.0分钟至9.01分钟为40%-98%A，保持1.9分钟，98%-100%A从11.0分钟至11.1分钟保持2.9分钟。
- 设置质谱仪参数：电离模式、电喷雾正离子源（ESI+）;雾化器压力，7.0巴;毛细管电压，4.0 kV;锥孔反吹流量，150升/小时;溶剂气体流量，800升/小时;溶解温度，400°C;冲击气体流量，0.25 毫升/分钟
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Representative Results
建立了对干茶样品、鲜茶叶、杂草和土壤中15种PA的优化吸附纯化分析方法，并与常用的SPE滤芯纯化方法进行了比较。结果表明，使用SPE滤芯的干茶样品、杂草和鲜茶叶中15个PA的回收率为72%-120%，而使用吸附剂纯化为78%-98%（图1）。使用吸附剂纯化对土壤中15种PA的回收率为79%-111%（图1）。随机收集四十（40）个真实样品以检测PA的含量，以比较两种净化方法（补充表1-7）。使用吸附剂法在所有10个干茶样品中检测到含量为1.3-22μg/kg的Heliotrine （He），而使用SPE柱的SPE柱仅在3个干茶样品中检测到含量为1.8-24.6μg/kg（补充表3-4）。
采用吸附纯化方法（GCB：PSA：C18）检测茶园杂草、杂草根际土壤和鲜茶叶中的PA。在金寨的一个茶园中选择了五个采样点。除雅各宾（Jb）、烯茶碱（Sp）、烯茶碱N-氧化（SpNO）和森基金（Sk）外，在杂草A . conyzoides中共检测到11个PA，其中PAs含量最高的是中间体（Im）（2，006-2，970 μg/kg）、日光晶-N-氧化物（HeNO）（2，446-2，731 μg/kg）和中间体-N-氧化物（ImNO）（13，535-17，345 μg/kg）（表1）。在土壤中，在采样点5仅检测到ImNO，含量为6.05μg/kg（补充表8）。在五个采样点的新鲜茶叶中检测到ImNO和Sn（图2）。在茶树不同部位检测到ImNO，其含量在4.36—26.5 μg/kg之间，均大于Sn，但采样点1和采样点2的成熟叶片未检测到Sn。在其他采样点的茶树不同部位检测到Sn，含量范围为1.0-3.14μg/kg（图2）。
在采样点5，显示了PAs在杂草，杂草根际土壤和新鲜茶叶之间的转移现象（图3）。11株PAs杂草中，土壤中仅检测到ImNO，含量为6.05 μg/kg，而在茶树不同部位检测到ImNO和Sn。两片叶一芽中ImNO含量最高，为12.6 μg/kg（图3）。
图 1：恢复比较。 比较（A）新鲜茶叶，（B）干茶样品，（C）杂草和（D）土壤样品中15种PA（吡咯里西啶生物碱）的回收率，使用吸附剂（加标水平= 0.02 mg / kg）和SPE滤芯（混合阳离子交换固相萃取柱，加标水平= 0.01 mg / kg）清理后的土壤样品。误差条显示标准差，显著性检验通过方差分析进行。 请点击此处查看此图的大图。
图2：从五个采样点收集的茶树不同部位PAs（吡咯里西啶生物碱）的含量和类型。 （一）取样地点 1.（二）取样地点 2.（三）取样地点 3.（四）取样地点 4.（五）取样地点 5.误差条显示标准差，显著性检验通过方差分析进行。 请点击此处查看此图的大图。
图3：杂草中所含的PAs及其向土壤和新鲜茶叶的转移 。 （A）在杂草，土壤和新鲜茶叶中检测到的PA（吡咯里西啶生物碱）的含量和类型。（B）在杂草中检测到的PA的含量和类型。误差条显示标准差，显著性检验通过方差分析进行。 请点击此处查看此图的大图。
| 采样站点 | 单个PA的平均含量（±相对标准偏差），μg/kg | 总PA的含量（微克/千克） | |||||||||||||||||||||||||||
| 他 | 嘿嘿 | 我 | 不 | Jb | JbNO | 再 | 雷诺 | 锡 | 无 | 斯普 | 斯普 不 |
欧盟 | 欧盟否 | 斯克 | |||||||||||||||
| 1 | 97.4 (2.43) | 2731.1 (2.04) | 2424.9 (1.84) | 13754 (0.56) | ND | 1.92 (1.54) | 21.2 (10.45) | 4.01 (5.72) | 58.4 (2.52) | 17.2 (9.03) | ND | ND | 224.0 (1.75) | 6.9 (2.02) | ND | 19341.03 | |||||||||||||
| 2 | 83.9 (1.21) | 2518.6 (0.81) | 2476.5 (1.15) | 13945 (0.30) | ND | 2.60 (2.52) | 28.8 (1.51) | 4.82 (3.66) | 63.7 (3.52) | 19.8 (10.2) | ND | ND | 248.6 (1.48) | 7.0 (1.58) | ND | 19399.32 | |||||||||||||
| 3 | 96.6 (1.67) | 2470.4 (1.08) | 2969.7 (1.02) | 16829 (0.36) | ND | 2.12 (1.08) | 20.9 (9.30) | 2.94 (1.08) | 51.0 (7.50) | 14.9 (8.25) | ND | ND | 252.1 (3.17) | 5.91 (0.35) | ND | 22715.57 | |||||||||||||
| 4 | 91.4 (1.98) | 2638.6 (2.75) | 2882.4 (1.98) | 17345 (0.76) | ND | 2.42 (10.59) | 15.4 (6.99) | 2.67 (10.59) | 51.6 (6.73) | 15.0 (0.92) | ND | ND | 281.3 (2.36) | 6.78 (2.15) | ND | 23332.57 | |||||||||||||
| 5 | 83.4 (3.79) | 2446.7 (6.0) | 2005.5 (3.79) | 13535 (1.96) | ND | 1.68 (4.94) | 15.2 (0.91) | 2.70 (4.94) | 49.4 (8.78) | 16.9 (10.7) | ND | ND | 215.2 (2.47) | 5.99 (3.76) | ND | 18377.67 | |||||||||||||
表1：五个采样点杂草的单个和总PA（吡咯里西啶生物碱）含量。 ND 表示未检测到。
补充表1：吸附法纯化的新鲜茶叶中单个和总PA的含量。ND 表示未检测到。 请按此下载此表格。
补充表2：SPE纯化的新鲜茶叶中单个和总PA的含量。ND 表示未检测到。 请按此下载此表格。
补充表3：吸附法纯化的干茶中单个和总PAs的含量。ND 表示未检测到。 请按此下载此表格。
补充表4：SPE纯化的干茶中单个和总PA的含量。 ND 表示未检测到。 请按此下载此表格。
补充表5：吸附剂法纯化的杂草中单个和总PA的含量。 ND 表示未检测到。 请按此下载此表格。
补充表6：SPE纯化的杂草中单个和总PA的含量。 ND 表示未检测到。 请按此下载此表格。
补充表7：吸附法纯化的土壤中单个和总PA的含量。 ND 表示未检测到。 请按此下载此表格。
补充表8：五个采样点土壤的单个和总PA含量。 ND 表示未检测到。 请按此下载此表格。
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Discussion
本工作旨在开发一种有效、灵敏的方法来探索茶叶样品中PA的污染途径和来源，以及PAs在茶树不同部位的分布。然而，在这项研究中，色谱柱上仅成功分离了15个PA，与植物物种3，4中的大量生物碱相比，这是一个非常小的数字。这不仅与色谱柱本身的堆积特性有关，还与所检查茶样品的复杂基质有关。因此，更好的分离纯化方法检测多PA仍需进一步探索。
SPE滤芯和吸附剂方法已被应用于检测多种样品基质中的多PA，但在茶叶的复杂基质中，尚未报道吸附剂法24。因此，本工作开发了GCB：PSA：C18（10 mg：20 mg：15 mg）配比的吸附剂方法，15 种PA的回收率满足不同样品基质中PA的检测要求。相比之下，使用SPE滤芯净化干茶后，ImNO、Eu和Re的平均回收率分别为119%、120%和115%，显示出显著的基质效应。此外，与SPE柱相比，吸附剂（GCB：PSA：C18）方法具有更短的样品处理时间，更低的成本和更好的PA分析回收率（图1B）。建立对干茶样、鲜茶叶、杂草和土壤中15种PAs的检测方法，为探索茶样中PAs的污染源提供了一种有效的检测方法。此外，根据现有知识，本研究首次建立了土壤多PA检测方法。
研究了茶园系统中PAs的转移路线。研究表明， 金 寨茶园中总PA含量最高的杂草之一，生长在茶树旁边。因此，收集金寨某茶园5个采样点的松 柏、 圆锥菌 根际土壤及鲜茶叶不同部位，对15个PA进行分析。 图3 显示，在 松果苣苔中产生的11个PAs中，只有松果 苣 苔根际土壤中检测到ImNO，而在新鲜茶叶中检测到ImNO和Sn。这表明，并非所有在 A. conyzoides 中产生的PAs含量都可以通过土壤介质 转运 到茶树中。转移到土壤中的PA的某些含量可能会被土壤微生物降解。
ImNO和Sn主要分布在一芽两叶和一芽三叶，成熟叶片PAs含量相对较低。在采样点4，两片叶的一个芽中ImNO含量达到26.5 μg/kg，而其他部分的ImNO含量在7.14-10.4 μg/kg之间。在采样点1和采样点2的成熟叶片中未检测到Sn。这表明茶树中PAs的富集部分主要集中在幼叶中，含量远低于欧盟设定的茶样PAs的最大残留限量（成人150μg/kg，婴幼儿75μg/kg）25。结果表明，茶样中的PA可能来自茶园中通过土壤 产生 PA的杂草。此外，结果证实了PAs在植物之间的转移和交换17。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（32102244），国家农产品质量安全与风险评估项目（GJFP2021001），安徽省自然科学基金（19252002）和美国农业部（HAW05020H）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115197 | CAS No:75-05-8 |
| Ammonia (25%-28%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 181210 | CAS No:1336-21-6 |
| Ammonium formate (97.0%) | Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) | G0860050 | CAS No:540-69-2 |
| Carbon-GCB | CNW | B7760030 | 120-400 MESH, 10g. per box |
| Centrifuge Z 36 HK | HERMLE | Z36HK | 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm |
| Commercially available tea product | Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun | loose tea | Green tea |
| Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) | BioCrick | 323256 | CAS No:65582-53-8 |
| Europine (Eu) (98.0%) | BioCrick | 98222 | CAS No:570-19-4 |
| Formate (98.0%) | Aladdin | E2022005 | CAS No:64-18-6 |
| HC-C18 | CNW | D2110060 | 40-63 μm,100g.per box |
| Heliotrine (He) (98.0%) | BioCrick | 906426 | CAS No:303-33-3 |
| Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) | BioCrick | 22581 | CAS No:6209-65-0 |
| High speed centrifuge TG16-WS | cence | 203158000 | Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL |
| HSS T3 column | Waters | 186004976 | ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm) |
| Intermedine (Im) (98.0%) | BioCrick | 114843 | CAS No:10285-06-0 |
| Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) | BioCrick | 340066 | CAS No:95462-14-9 |
| Jacobine (Jb) (98.0%) | BioCrick | 132282048 | CAS No:6870-67-3 |
| Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) | ChemFaces | CFN00461 | CAS No:38710-25-7 |
| Methyl Alcohol (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115100 | CAS No:67-56-1 |
| PSA | Agela | P19-00833 | 40-60 μm, 60 Å 100g.per box |
| Retrorsine (Re) (98.0%) | BioCrick | 5281743 | CAS No:480-54-6 |
| Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) | BioCrick | 5281734 | CAS No:15503-86-3 |
| Senecionine (Sc) (98.0%) | BioCrick | 5280906 | CAS No:130-01-8 |
| Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) | BioCrick | 5380876 | CAS No:13268-67-2 |
| Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) | BioCrick | 6442619 | CAS No:38710-26-8 |
| Seneciphylline (Sp) (98.0%) | BioCrick | 5281750 | CAS No:480-81-9 |
| Senkirkine (Sk) (98.0%) | BioCrick | 5281752 | CAS No:2318-18-5 |
| SPE PCX | Agilent Technologies | 12108206 | Cation Mixed Mode, 6 mL |
| Sulfuric acid (97%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 1003019 | CAS No:7664-93-9 |
| Trisodium citrate | Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20121009 | CAS No:6132-04-3 |
| Ultrasonic cleaner | Supmile | KQ-600B | Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L |
| UPLC-xevoTQMS | Waters | ZPLYY-003 | Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System |
| Water bath thermostat oscillator | Guoyu instrument | SHY-2AHS | Oscillation times: 60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C |
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