Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Kontamination von Pyrrolizidinalkaloiden (PAs) in Teeproben von PA-produzierenden Unkräutern in Teegärten.
Abstract
In Teeproben werden giftige Pyrrolizidinalkaloide (PAs) gefunden, die eine Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellen. Die Quelle und der Weg der PA-Kontamination in Teeproben blieben jedoch unklar. In dieser Arbeit wurde eine Adsorptionsmethode in Kombination mit UPLC-MS/MS entwickelt, um 15 PAs im Unkraut Ageratum conyzoides L., A. conyzoides rhizosphärischem Boden, frischen Teeblättern und getrockneten Teeproben zu bestimmen . Die durchschnittlichen Gewinnungsraten lagen zwischen 78 % und 111 %, mit relativen Standardabweichungen von 0,33 % bis 14,8 %. Fünfzehn Paare rhizosphärischer Bodenproben von A. conyzoides und A. conyzoides sowie 60 frische Teeblattproben wurden aus dem Teegarten Jinzhai in der Provinz Anhui, China, entnommen und auf die 15 PAs analysiert . Nicht alle 15 PAs wurden in frischen Teeblättern nachgewiesen, mit Ausnahme von Intermedin-N-oxid (ImNO) und Senecionin (Sn). Der Gehalt an ImNO (34,7 μg/kg) war höher als der von Sn (9,69 μg/kg). Darüber hinaus konzentrierten sich sowohl ImNO als auch Sn in den jungen Blättern der Teepflanze, während ihr Gehalt in den alten Blättern geringer war. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PAs im Tee über den Weg von PA-produzierenden Unkräutern-Boden-frischen Teeblättern in Teegärten übertragen wurden.
Introduction
Als Sekundärmetaboliten schützen Pyrrolizidinalkaloide (PAs) Pflanzen vor Pflanzenfressern, Insekten und Krankheitserregern 1,2. Bisher wurden in mehr als 6.000 Pflanzenarten weltweit über 660 PAs und PA-N-Oxide (PANOs) mit unterschiedlichen Strukturen gefunden 3,4. PA-produzierende Pflanzen kommen hauptsächlich in den Familien Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae und Apocynaceaevor 5,6. PAs werden leicht zu instabilen Dehydropyrrolizidinalkaloiden oxidiert, die eine starke Elektrophilie aufweisen und Nukleophile wie DNA und Proteine angreifen können, was zu Leberzellnekrosen, Venenverschlüssen, Zirrhose, Aszites und anderen Symptomen führt 7,8. Das Hauptzielorgan der PA-Toxizität ist die Leber. PAs können auch Lungen-, Nieren- und andere Organtoxizität sowie erbgutverändernde, krebserregende und entwicklungsbedingte Toxizität verursachen 9,10.
In vielen Ländern wurden Fälle von Vergiftungen bei Mensch und Tier gemeldet, die auf den Verzehr traditioneller Kräuter, Nahrungsergänzungsmittel oder Tees zurückzuführen sind, die PA enthalten, oder auf die indirekte Kontamination von Lebensmitteln wie Milch, Honig oder Fleisch (giftig durch den Verzehr von PAshaltigen Weideflächen)11,12,13. Die Ergebnisse der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) deuten darauf hin, dass Stoffe wie (Kräuter-)Tee eine wichtige Quelle für die Exposition des Menschen gegenüber PAs/PANOs sind14. Teeproben produzieren keine PAs, während PA-produzierende Pflanzen häufig in Teegärten zu finden sind (z. B. Emilia sonchifolia, Senecio angulatus und Ageratum conyzoides)15. Bisher wurde vermutet, dass der Tee bei der Ernte und Verarbeitung mit PAs aus den produzierenden Werken verunreinigt sein könnte. PAs wurden jedoch auch in einigen handgepflückten Teeblättern (d. h. in keinen PA-produzierenden Pflanzen) nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass es andere Kontaminationswege oder -quellen geben muss16. Es wurde ein Co-Kultivierungsexperiment von Kreuzkraut (Senecio jacobaea) mit Melisse (Melissa officinalis), Pfefferminze (Mentha piperita), Petersilie (Petroselinum crispum), Kamille (Matricaria recutita) und Kapuzinerkresse (Tropaeolum majus) durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass PAs in all diesen Pflanzen nachgewiesen wurden17. Es wurde nachgewiesen, dass PAs tatsächlich über den Boden zwischen lebenden Pflanzen übertragen und ausgetauscht werden18,19. Van Wyk et al.20 fanden heraus, dass Rooibos-Tee (Aspalathus linearis) an unkrautreichen Standorten stark kontaminiert war und PAs der gleichen Art und des gleichen Anteils enthielt. Es wurden jedoch keine PAs in Rooibos-Tee an unkrautfreien Standorten nachgewiesen.
Gegenwärtig wird die Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) mit hoher Selektivität und Sensitivität häufig bei der qualitativen und quantitativen Analyse von PA in landwirtschaftlichen Erzeugnissen und Lebensmitteln eingesetzt21,22. Die Probenbehandlungsmethode besteht in der Regel entweder aus der Festphasenextraktion (SPE) oder der QuEChERS-Aufreinigung (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) von Extrakten komplexer Lebensmittelmatrices, mit denen die höchstmögliche Empfindlichkeit erreicht werden kann12,19. Es fehlen jedoch noch robuste Analysemethoden, die den Nachweis und die Quantifizierung von PAs in komplexen Matrices wie Erde, Unkraut und frischen Teeblättern ermöglichen.
In dieser Studie wurden 15 PAs in getrockneten Teeproben, frischen Teeblättern, Unkräutern und rhizosphärischen Bodenproben mit UPLC-MS/MS in Kombination mit einer Adsorptionsmittelreinigungsmethode analysiert. Darüber hinaus wurden 15 gepaarte unkraut- und unkrautrhizosphärische Bodenproben und 60 frische Teeblattproben an fünf Probenahmestellen im Teegarten Jinzhai in der Provinz Anhui, China, entnommen und auf 15 PAs analysiert. Diese Ergebnisse können eine Erhebungsmethode und einige Informationen über die Quelle und den Weg von PAs (Kontamination) in Teeproben liefern, um die Qualität und Sicherheit des Tees zu gewährleisten.
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Protocol
Für die vorliegende Studie wurden folgende Unkrautarten gesammelt: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. und Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore. Die frischen Teeblätter wurden von der Sorte Longjing 43# Teebäume gepflückt, und die getrockneten Teeproben waren kommerziell erhältlicher Tee, der nach dem Herstellungsverfahren für grünen Tee verarbeitet wurde (siehe Materialtabelle).
1. Probenentnahme
- Sammle 40 echte Proben.
- Sammle zufällig 10 Unkraut, 10 Erde und 10 frische Teeblätter aus mehreren Teegärten.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde der Boden in einer Tiefe von 20 cm mit einer Probenmenge von 200 g beprobt. - Sammle nach dem Zufallsprinzip 10 getrocknete Teeprodukte (250 g) aus einem Supermarkt.
- Sammle zufällig 10 Unkraut, 10 Erde und 10 frische Teeblätter aus mehreren Teegärten.
- Sammle Proben von Unkraut, Erde und frischen Teeblättern, um die Kontaminationsquelle von PAs im Tee zu untersuchen.
- Legen Sie fünf Probenahmepunkte im selben Teegarten fest, mit drei Wiederholungen an jedem Punkt.
- Sammeln Sie Ageratum conyzoides L. Unkrautproben mit dem höchsten PA-Gehalt, der üblicherweise in Teegärten zu finden ist.
HINWEIS: Die Probenmenge betrug für die vorliegende Studie 250 g. - Sammeln Sie die Bodenproben.
HINWEIS: Bei den Bodenproben handelte es sich um rhizosphärischen Boden von A. conyzoides in einer Tiefe von 20 cm mit einer Probenmenge von 200 g. - Sammle die frischen Teeblätter von verschiedenen Teilen der Teepflanzen, darunter eine Knospe mit zwei Blättern, eine Knospe mit drei Blättern, eine Knospe mit vier Blättern und reife Blätter.
HINWEIS: Die Probenmenge betrug 250 g.
2. Probenbehandlung
- Behandeln Sie die Proben vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Mahlen Sie die getrockneten Tee- und Bodenproben mit einer Mühle, passieren Sie die pulverisierten Proben durch ein 200-Mesh-Sieb und lagern Sie sie bei −20 °C.
HINWEIS: Der getrocknete Tee war ein handelsübliches Teeprodukt (siehe Materialtabelle), daher wurde er zur Lagerung direkt zerkleinert und gesiebt. Die Bodenproben (200 g) wurden an einem belüfteten Ort im Dunkeln etwa eine Woche lang an der Luft getrocknet. - Homogenisieren Sie das Gras und die frischen Teeblätter mit einem Homogenisator und lagern Sie sie bei −20 °C.
- Mahlen Sie die getrockneten Tee- und Bodenproben mit einer Mühle, passieren Sie die pulverisierten Proben durch ein 200-Mesh-Sieb und lagern Sie sie bei −20 °C.
- Führen Sie eine Probebehandlung der getrockneten Teeprodukte, der frischen Teeblätter und des Unkrauts durch.
- Wiegen Sie 1,00 g jeder Probe (getrocknete Teeprodukte, frische Teeblätter und Unkraut) ab und geben Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 10 ml 0,1 mol/l Schwefelsäurelösung hinzu und wirbeln Sie 2 min lang für die Festphasenextraktion (mit SPE-Kartusche, siehe Materialtabelle) und 1 min für die Adsorptionsmittelreinigung. Führen Sie die Ultraschallextraktion23 15 Minuten lang durch und zentrifugieren Sie dann 10 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 9.390 x g bei Raumtemperatur.
Anmerkungen: Die Leistung des Ultraschalloszillators betrug 290 W, die Schwingungsfrequenz 35 kHz und die Temperatur war auf 30 °C eingestellt. - Übertragen Sie den Überstand in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit einer Pipette mit Kunststoffspitze.
- Befolgen Sie die obigen Schritte, um die Extraktion einmal zu wiederholen. Kombinieren Sie die beiden Überstände.
- Aktivieren Sie die SPE-Kartuschen mit 5 ml Methanol und 5 ml deionisiertem Wasser. Geben Sie 10 ml Überstand in die voraktivierte Kartusche und führen Sie eine Probenreinigung durch.
- Nachdem der Füllstand der Probenlösung die obere Schicht der Kartuschen erreicht hat, werden die Analyten mit 5 mL 1%iger Ameisensäurelösung und dann 5 mL Methanol eluiert. Verwerfen Sie das Eluat.
- Mit 5 mL Methanol (mit 0,5 % Ammoniakwasser) eluiert, das Eluat durch einen 0,22 μm Membranfilter filtrieren und mittels UPLC-MS/MS analysieren (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie eine Probenreinigung mit Adsorptionsmitteln durch.
- 2 ml des Überstandes (Schritt 2.2.4) werden in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, das mit den Adsorptionsmitteln von GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg, siehe Materialtabelle) gefüllt ist, 1 min lang vortexiert und bei 9.390 x g 8 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
- 1 ml des Überstands wird vor der Analyse mittels UPLC-MS/MS durch einen 0,22 μm Membranfilter geleitet.
- Führen Sie eine Behandlung der Bodenproben durch.
- Wiegen Sie eine 1,00 g Bodenprobe. Geben Sie es in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 0,1 ml 0,1 mol/l Trinatriumcitratlösung hinzu (siehe Materialtabelle), um den pH-Wert des Bodens auf 6,0 einzustellen.
- 2 Minuten stehen lassen und dann 10 ml 0,1 mol/l Schwefelsäure-Methanollösung hinzufügen, 2 Minuten lang wirbeln und 30 Minuten schütteln und dann 30 Minuten lang eine Ultraschallextraktion durchführen.
- Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 9.390 x g und übertragen Sie den Überstand mit einer Pipette mit Kunststoffspitze in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Befolgen Sie die obigen Schritte, um die Extraktion zu wiederholen und den Überstand zweimal zu kombinieren.
ANMERKUNG: Die Reinigungsmethode war die gleiche wie in Schritt 2.2.5.1 und Schritt 2.2.5.2.
3. Instrumentelle Analyse
- Nachweis der 15 PAs in getrockneten Teeproben, frischen Teeblättern, Gras und Erde (Proben aus Schritt 2) mit einem handelsüblichen UPLC-MS/MS-System (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie die Säulentemperatur auf 40 °C, die Durchflussrate auf 0,250 ml/min und das Injektionsvolumen auf 3 μl ein.
- Stellen Sie die mobile Phase A ein: Methanol (enthält 0,1 % Ameisensäure + 1 mmol/l Ammoniumformiat) und die mobile Phase B: Wasser (enthält 0,1 % Ameisensäure + 1 mmol/l Ammoniumformiat).
- Stellen Sie ein Gradientenelutionsverfahren ein: 10 % A von 0,0 min bis 0,25 min, 10 %-30 % A von 0,25 min bis 6,0 min, 30 %-40 % A von 6,0 min bis 9,0 min, 40 %-98 % A von 9,0 min bis 9,01 min, das 1,9 min gehalten wurde, und 98 %-100 % A von 11,0 min bis 11,1 min, das 2,9 min gehalten wurde.
- Stellen Sie die Parameter des Massenspektrometers ein: Ionisationsmodus, Elektrospray-positive Ionenquelle (ESI+); Zerstäuberdruck, 7,0 bar; Kapillarspannung, 4,0 kV; Kegelloch-Rückblasstrom, 150 l/h; Lösemittelgasdurchfluss, 800 l/h; Lösemitteltemperatur, 400 °C; Aufprallgasstrom, 0,25 ml/min.
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Representative Results
Die optimierte Adsorptionsmittelreinigungs- und Analysemethode von 15 PAs in getrockneten Teeproben, frischen Teeblättern, Unkräutern und Erde wurde etabliert und mit der üblicherweise verwendeten Reinigungsmethode unter Verwendung der SPE-Kartusche verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Wiederfindungsraten der 15 PAs in getrockneten Teeproben, Gras und frischen Teeblättern unter Verwendung der SPE-Kartusche 72 % bis 120 % betrugen, während die Wiederfindung unter Verwendung der Adsorptionsmittelreinigung 78 % bis 98 % betrug (Abbildung 1). Die Wiederfindungsraten der 15 PA im Boden mittels Adsorptionsmittelreinigung betrugen 79 % bis 111 % (Abbildung 1). Vierzig (40) reale Proben wurden nach dem Zufallsprinzip entnommen, um den Gehalt an PAs zu ermitteln und die beiden Aufreinigungsmethoden zu vergleichen (ergänzende Tabellen 1-7). Heliotrin (He) wurde in allen 10 getrockneten Teeproben mit der Adsorptionsmethode mit einem Gehalt von 1,3-22 μg/kg nachgewiesen, während es nur in drei getrockneten Teeproben mit der SPE-Kartusche mit einem Gehalt von 1,8-24,6 μg/kg nachgewiesen wurde (Ergänzende Tabellen 3-4).
Die Adsorptionsmittelreinigungsmethode (GCB:PSA:C18) wurde ausgewählt, um PAs in Unkräutern, unkrautrhizosphärischen Böden und frischen Teeblättern in Teeplantagensystemen nachzuweisen. Fünf Probenahmestellen wurden in einem Teegarten in Jinzhai ausgewählt. Neben Jacobin (Jb), Seneciphyllin (Sp), Seneciphyllin-N-oxid (SpNO) und Senkirkin (Sk) wurden im Unkraut A. conyzoides insgesamt 11 PA nachgewiesen, von denen der höchste Gehalt an PA Intermedin (Im) (2.006-2.970 μg/kg), Heliotrin-N-oxid (HeNO) (2.446-2.731 μg/kg) und Intermedin-N-oxid (ImNO) (13.535-17.345 μg/kg) war (Tabelle 1). Im Boden wurde an der Probenahmestelle 5 nur ImNO mit einem Gehalt von 6,05 μg/kg nachgewiesen (Ergänzende Tabelle 8). ImNO und Sn wurden in den frischen Teeblättern der fünf Probenahmestellen nachgewiesen (Abbildung 2). ImNO wurde in verschiedenen Teilen der Teepflanzen nachgewiesen und sein Gehalt lag zwischen 4,36 und 26,5 μg/kg, was höher war als der von Sn, mit der Ausnahme, dass Sn in reifen Blättern von Probenahmestelle 1 und Probenahmestelle 2 nicht nachgewiesen wurde. Sn wurde in verschiedenen Teilen der Teepflanzen an den anderen Probenahmestellen nachgewiesen, und der Gehalt lag zwischen 1,0 und 3,14 μg/kg (Abbildung 2).
An der Probenahmestelle 5 wurde das Transferphänomen von PAs zwischen den Unkräutern, dem unkrautrhizosphärischen Boden und den frischen Teeblättern gezeigt (Abbildung 3). Von den 11 PAs-Unkräutern wurde nur ImNO mit einem Gehalt von 6,05 μg/kg im Boden nachgewiesen, während ImNO und Sn in verschiedenen Teilen der Teepflanzen nachgewiesen wurden. Der ImNO-Gehalt in einer Knospe mit zwei Blättern war mit 12,6 μg/kg am höchsten (Abbildung 3).
Abbildung 1: Vergleich der Wiederherstellung. Vergleich der Wiederfindungsraten von 15 PA (Pyrrolizidinalkaloide) in Extrakten aus (A) frischen Teeblättern, (B) getrockneten Teeproben, (C) Unkraut- und (D) Bodenproben nach der Reinigung mit dem Adsorptionsmittel (Spitzenwert = 0,02 mg/kg) und SPE-Kartuschen (Mischkationenaustauscher-Festphasenextraktionssäulen, Spitzenwert = 0,01 mg/kg). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an, und der Signifikanztest wurde mittels Varianzanalyse durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Gehalt und Art von PA (Pyrrolizidinalkaloiden) in verschiedenen Teilen der Teepflanzen, die an den fünf Probenahmestellen gesammelt wurden. (A) Probenahmestelle 1. (B) Probenahmestelle 2. C) Probenahmestelle 3. D) Probenahmestelle 4. (E) Probenahmestelle 5. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an, und der Signifikanztest wurde mittels Varianzanalyse durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: In Unkräutern enthaltene PA und ihre Übertragung auf den Boden und frische Teeblätter . (A) Der Gehalt und die Art der PAs (Pyrrolizidinalkaloide), die in den Unkräutern, im Boden und in frischen Teeblättern nachgewiesen wurden. (B) Der Gehalt und die Art der im Unkraut nachgewiesenen PA. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an, und der Signifikanztest wurde mittels Varianzanalyse durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Probenahmestelle | Der mittlere Gehalt einzelner PAs (± relative Standardabweichungen), μg/kg | Der Gehalt an Gesamt-PAs (μg/kg) | |||||||||||||||||||||||||||
| Er | HeNO | Im | ImNO | Jb | JbNO | Re | Reno | Sn | SnNO | Sp | Sp NEIN |
EU | EuNO | Sk | |||||||||||||||
| 1 | 97.4 (2.43) | 2731.1 (2.04) | 2424.9 (1.84) | 13754 (0.56) | ND | 1.92 (1.54) | 21.2 (10.45) | 4.01 (5.72) | 58.4 (2.52) | 17.2 (9.03) | ND | ND | 224.0 (1.75) | 6.9 (2.02) | ND | 19341.03 | |||||||||||||
| 2 | 83.9 (1.21) | 2518.6 (0.81) | 2476.5 (1.15) | 13945 (0.30) | ND | 2.60 (2.52) | 28.8 (1.51) | 4.82 (3.66) | 63.7 (3.52) | 19.8 (10.2) | ND | ND | 248.6 (1.48) | 7.0 (1.58) | ND | 19399.32 | |||||||||||||
| 3 | 96.6 (1.67) | 2470.4 (1.08) | 2969.7 (1.02) | 16829 (0.36) | ND | 2.12 (1.08) | 20.9 (9.30) | 2.94 (1.08) | 51.0 (7.50) | 14.9 (8.25) | ND | ND | 252.1 (3.17) | 5.91 (0.35) | ND | 22715.57 | |||||||||||||
| 4 | 91.4 (1.98) | 2638.6 (2.75) | 2882.4 (1.98) | 17345 (0.76) | ND | 2.42 (10.59) | 15.4 (6.99) | 2.67 (10.59) | 51.6 (6.73) | 15.0 (0.92) | ND | ND | 281.3 (2.36) | 6.78 (2.15) | ND | 23332.57 | |||||||||||||
| 5 | 83.4 (3.79) | 2446.7 (6.0) | 2005.5 (3.79) | 13535 (1.96) | ND | 1.68 (4.94) | 15.2 (0.91) | 2.70 (4.94) | 49.4 (8.78) | 16.9 (10.7) | ND | ND | 215.2 (2.47) | 5.99 (3.76) | ND | 18377.67 | |||||||||||||
Tabelle 1: Gehalt an einzelnen und gesamten PA (Pyrrolizidinalkaloiden) von Unkräutern an den fünf Probenahmestellen. ND steht für keine.
Ergänzende Tabelle 1: Der Gehalt an Einzel- und Gesamt-PA in frischen Teeblättern, die mit der Adsorptionsmethode gereinigt wurden. ND steht für keine. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Der Gehalt an Einzel- und Gesamt-PA in frischen Teeblättern, die durch SPE gereinigt wurden. ND steht für keine. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 3: Der Gehalt an Einzel- und Gesamt-PA in getrocknetem Tee, der mit der Adsorptionsmethode gereinigt wurde. ND steht für keine. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 4: Der Gehalt an Einzel- und Gesamt-PA in getrocknetem Tee, der durch SPE gereinigt wurde. ND steht für keine. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 5: Der Gehalt an einzelnen und gesamten PA in Unkräutern, die mit der Adsorptionsmethode gereinigt wurden. ND steht für keine. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 6: Der Gehalt an einzelnen und gesamten PA in Unkräutern, die mit SPE gereinigt wurden. ND steht für keine. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 7: Der Gehalt an einzelnen und gesamten PA in Böden, die mit der Adsorptionsmethode gereinigt wurden. ND steht für keine. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 8: Gehalt der einzelnen und der gesamten PA der Böden an den fünf Probenahmestellen. ND steht für keine. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine effektive, sensitive Methode zu entwickeln, um die Kontaminationswege und Quellen von PAs in Teeproben sowie die Verteilung von PAs in verschiedenen Teilen der Teepflanzen zu untersuchen. In dieser Studie konnten jedoch nur 15 PAs erfolgreich auf der chromatographischen Säule abgetrennt werden, was im Vergleich zu der großen Anzahl von Alkaloiden in Pflanzenarten eine sehr geringe Anzahl ist 3,4. Dies bezog sich nicht nur auf die Packungseigenschaften der Säule selbst, sondern auch auf die komplexe Matrix der untersuchten Teeproben. Daher müssen bessere Trenn- und Reinigungsmethoden zum Nachweis von Multi-PAs noch weiter erforscht werden.
SPE-Kartuschen und Adsorptionsmittelmethoden wurden zum Nachweis von Multi-PAs in einer Vielzahl von Probenmatrizes eingesetzt, aber in der komplexen Matrix von Tee wurde die Adsorptionsmethode nicht berichtet24. Daher wurde in dieser Arbeit die Adsorptionsmethode mit einem Verhältnis von GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg) entwickelt, und die Wiederfindungsraten von 15 PAs erfüllten die Nachweisanforderungen für PAs in verschiedenen Probenmatrices. Im Gegensatz dazu betrugen ImNO-, Eu- und Re-Wiederfindungen durchschnittlich 119 %, 120 % bzw. 115 % in getrocknetem Tee nach der Reinigung mit SPE-Kartuschen, die einen signifikanten Matrixeffekt zeigten. Darüber hinaus hatte die Adsorptionsmittelmethode (GCB:PSA:C18) im Vergleich zu SPE-Kartuschen eine kürzere Probenbehandlungszeit, geringere Kosten und bessere Wiederfindungsraten für die PA-Analyse (Abbildung 1B). Die Etablierung von Nachweismethoden für 15 PAs in getrockneten Teeproben, frischen Teeblättern, Unkräutern und Erde stellte eine effektive Nachweismethode zur Untersuchung der Kontaminationsquelle von PAs in Teeproben dar. Darüber hinaus wurde nach derzeitigem Kenntnisstand in dieser Studie erstmalig eine Multi-PA-Detektionsmethode im Boden etabliert.
Der Transferweg von PAs im Teeplantagensystem wurde untersucht. Unsere Studien deuten darauf hin, dass A. conyzoides eines der Unkräuter mit dem höchsten Gesamt-PA-Gehalt im Teegarten von Jinzhai war und neben den Teepflanzen wuchs. Daher wurden A. conyzoides, A. conyzoides rhizosphärischer Boden und die verschiedenen Teile frischer Teeblätter von den fünf Probenahmestellen in einem Teegarten in Jinzhai gesammelt, um die 15 PAs zu analysieren. Abbildung 3 zeigt, dass von den 11 PAs, die in A. conyzoides produziert wurden, nur ImNO im rhizosphärischen Boden von A. conyzoides nachgewiesen wurde, während ImNO und Sn in frischen Teeblättern nachgewiesen wurden. Dies deutet darauf hin, dass nicht der gesamte Gehalt der in A. conyzoides produzierten PAs über das Bodenmedium in die Teepflanzen transportiert werden konnte. Ein Teil der in den Boden übertragenen PA kann von Bodenmikroorganismen abgebaut werden.
ImNO und Sn wurden hauptsächlich in einer Knospe mit zwei Blättern und einer Knospe mit drei Blättern verteilt, während der Gehalt an PAs in reifen Blättern relativ gering war. An der Probenahmestelle 4 erreichte der ImNO-Gehalt in einer Knospe mit zwei Blättern 26,5 μg/kg, während der Gehalt an ImNO in anderen Teilen der Teepflanze zwischen 7,14 und 10,4 μg/kg lag. Sn wurde in reifen Blättern an Probenahmestelle 1 und Probenahmestelle 2 nicht nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass die angereicherten Anteile an PA in Teepflanzen hauptsächlich in den jungen Blättern konzentriert waren und der Gehalt weit unter dem von der Europäischen Union festgelegten Rückstandshöchstwert für PA in Teeproben lag (150 μg/kg für Erwachsene, 75 μg/kg für Säuglinge und Kleinkinder)25. Die Ergebnisse zeigen, dass die PAs in Teeproben über den Boden von PA-produzierenden Unkräutern in Teegärten stammen können. Darüber hinaus bestätigen die Ergebnisse den Transfer und Austausch von PAs zwischen Pflanzen17.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Natural Scientific Foundation of China (32102244), dem National Agricultural Products Quality and Safety and Risk Assessment Project (GJFP2021001), der Natural Scientific Foundation of Anhui Province (19252002) und dem USDA (HAW05020H) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115197 | CAS No:75-05-8 |
| Ammonia (25%-28%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 181210 | CAS No:1336-21-6 |
| Ammonium formate (97.0%) | Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) | G0860050 | CAS No:540-69-2 |
| Carbon-GCB | CNW | B7760030 | 120-400 MESH, 10g. per box |
| Centrifuge Z 36 HK | HERMLE | Z36HK | 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm |
| Commercially available tea product | Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun | loose tea | Green tea |
| Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) | BioCrick | 323256 | CAS No:65582-53-8 |
| Europine (Eu) (98.0%) | BioCrick | 98222 | CAS No:570-19-4 |
| Formate (98.0%) | Aladdin | E2022005 | CAS No:64-18-6 |
| HC-C18 | CNW | D2110060 | 40-63 μm,100g.per box |
| Heliotrine (He) (98.0%) | BioCrick | 906426 | CAS No:303-33-3 |
| Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) | BioCrick | 22581 | CAS No:6209-65-0 |
| High speed centrifuge TG16-WS | cence | 203158000 | Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL |
| HSS T3 column | Waters | 186004976 | ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm) |
| Intermedine (Im) (98.0%) | BioCrick | 114843 | CAS No:10285-06-0 |
| Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) | BioCrick | 340066 | CAS No:95462-14-9 |
| Jacobine (Jb) (98.0%) | BioCrick | 132282048 | CAS No:6870-67-3 |
| Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) | ChemFaces | CFN00461 | CAS No:38710-25-7 |
| Methyl Alcohol (99.9%) | Tedia Company,Inc. | 21115100 | CAS No:67-56-1 |
| PSA | Agela | P19-00833 | 40-60 μm, 60 Å 100g.per box |
| Retrorsine (Re) (98.0%) | BioCrick | 5281743 | CAS No:480-54-6 |
| Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) | BioCrick | 5281734 | CAS No:15503-86-3 |
| Senecionine (Sc) (98.0%) | BioCrick | 5280906 | CAS No:130-01-8 |
| Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) | BioCrick | 5380876 | CAS No:13268-67-2 |
| Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) | BioCrick | 6442619 | CAS No:38710-26-8 |
| Seneciphylline (Sp) (98.0%) | BioCrick | 5281750 | CAS No:480-81-9 |
| Senkirkine (Sk) (98.0%) | BioCrick | 5281752 | CAS No:2318-18-5 |
| SPE PCX | Agilent Technologies | 12108206 | Cation Mixed Mode, 6 mL |
| Sulfuric acid (97%) | Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. | 1003019 | CAS No:7664-93-9 |
| Trisodium citrate | Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 20121009 | CAS No:6132-04-3 |
| Ultrasonic cleaner | Supmile | KQ-600B | Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L |
| UPLC-xevoTQMS | Waters | ZPLYY-003 | Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System |
| Water bath thermostat oscillator | Guoyu instrument | SHY-2AHS | Oscillation times: 60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C |
References
- Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498 (2019).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed. EFSA Journal. 9 (11), 134 (2011).
- Ma, C., et al. Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).
- Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. Encyclopedia of Food Chemistry. Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. 1, Elsevier. 348-355 (2019).
- Huang, D. Y., et al. Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea. Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).
- Liang, A. H., Ye, Z. G. General situation of the toxicity researches on Senecio. China Journal of Chinese Materia Medica. 31 (2), 93-97 (2006).
- Li, Y. H., et al. Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats. Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).
- Jia, Z. J., et al. Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity. The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).
- Yang, M., et al. First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans. Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).
- Chen, Z., Huo, J. R. Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).
- Mattocks, A. R. Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloid. , Academic Press. London, UK. (1986).
- Picron, J. F., Herman, M., Van Hoeck, E., Goscinny, S. Analytical strategies for the determination of pyrrolizidine alkaloids in plant based food and examination of the transfer rate during the infusion process. Food Chemistry. 266, 514-523 (2018).
- Kowalczyk, E., Kwiatek, K. Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas. Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).
- EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA Journal. 15 (7), 04908 (2017).
- Han, H., et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk. Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).
- Nowak, M., et al. Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities. Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).
- Selmar, D., et al. Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations. Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).
- Izcara, S., et al. Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs. Food Chemistry. 380, 132189 (2022).
- Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples. Foods. 9 (9), 1319 (2020).
- Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis). South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).
- Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).
- Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea. Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).
- Han, H. L., et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds. Food control. 132, 108518 (2022).
- Bodi, D., et al. Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey. Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).
- European Union Commission. Commission Regulation (EU) 2020/2040 of 11 December 2020 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of pyrrolizidine alkaloids in certain foodstuffs. Official Journal of the European Union. 14 (12), 1-4 (2020).
