Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Источник и путь загрязнения алкалоидами пирролизидина в образцах чая

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64375
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1,3, 4, 3, 3, 1, 1
1Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province, School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, 2State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Agricultural University, 3Key Laboratory of Tea Quality and Safety & Risk Assessment, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture, 4Department of Molecular Biosciences and Bioengineering, University of Hawaii at Manoa

Summary

В настоящем протоколе описывается контаминация пирролизидиновыми алкалоидами (ПА) в образцах чая из сорняков, продуцирующих ПА, на чайных плантациях.

Abstract

В образцах чая обнаружены токсичные пирролизидиновые алкалоиды (ПА), которые представляют угрозу для здоровья человека. Однако источник и путь загрязнения ПА в образцах чая остались неясными. В данной работе был разработан метод адсорбента в сочетании с UPLC-MS/MS для определения 15 PA в корневищной почве сорняков Ageratum conyzoides L., A. conyzoides, свежих чайных листьях и образцах сушеного чая. Среднее выздоровление варьировало от 78% до 111% с относительными стандартными отклонениями 0,33%-14,8%. Пятнадцать пар образцов ризосферной почвы A. conyzoides и A. conyzoides и 60 образцов свежего чайного листа были собраны в чайном саду Цзиньчжай в провинции Аньхой, Китай, и проанализированы на наличие 15 ПА. Не все 15 PA были обнаружены в свежих чайных листьях, за исключением интермедина-N-оксида (ImNO) и сенеционина (Sn). Содержание ImNO (34,7 мкг/кг) было больше, чем Sn (9,69 мкг/кг). Кроме того, и ImNO, и Sn были сосредоточены в молодых листьях чайного растения, в то время как их содержание было ниже в старых листьях. Результаты показали, что ПА в чае переносились по пути сорняков, продуцирующих ПА, почвы и свежих чайных листьев в чайных садах.

Introduction

В качестве вторичных метаболитов пирролизидиновые алкалоиды (ПА) защищают растения от травоядных, насекомых и патогенов 1,2. На сегодняшний день более 660 PA и PA-N-оксидов (PANO) с различной структурой были обнаружены в более чем 6,000 видах растений по всему миру 3,4. Растения, продуцирующие ПА, в основном встречаются в семействах Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae и Apocynaceae 5,6. ПА легко окисляются до нестабильных алкалоидов дегидропирролизидина, которые обладают сильной электрофильностью и могут атаковать нуклеофилы, такие как ДНК и белки, что приводит к некрозу клеток печени, венозным окклюзиям, циррозу, асциту и другим симптомам 7,8. Основным органом-мишенью токсичности ПА является печень. ПА также могут вызывать токсичность легких, почек и других органов, а также мутагенную, канцерогенную токсичность и токсичность для развития 9,10.

Во многих странах сообщалось о случаях отравления людей и животных в результате употребления в пищу традиционных трав, добавок или чаев, содержащих ПА, или косвенного загрязнения пищевых продуктов, таких как молоко, мед или мясо (токсичных при употреблении в пищу пастбищ, содержащих ПА)11,12,13. Результаты Европейского агентства по безопасности пищевых продуктов (EFSA) указывают на то, что такие вещества, как (травяной) чай, являются важным источником воздействия на человека PA/PANO14. Образцы чая не производят ПА, тогда как растения, продуцирующие ПА, обычно встречаются в чайных садах (например, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus и Ageratum conyzoides)15. Ранее подозревалось, что чай может быть загрязнен PA с заводов-производителей во время сбора и переработки. Тем не менее, ПА также были обнаружены в некоторых собранных вручную чайных листьях (т.е. без растений, продуцирующих ПА), что позволяет предположить, что должны существовать другие пути или источники загрязнения16. Был проведен эксперимент по совместному выращиванию растений полыни (Senecio jacobaea) с мелиссой (Melissa officinalis), мятой перечной (Mentha piperita), петрушкой (Petroselinum crispum), ромашкой (Matricaria recutita) и настурцией (Tropaeolum majus), и результаты показали, что ПА были обнаружены во всех этих растениях17. Было подтверждено, что ПА действительно передаются и обмениваются между живыми растениями через почву18,19. Van Wyk et al.20 обнаружили, что чай ройбуш (Aspalathus linearis) был сильно загрязнен на участках, богатых сорняками, и содержал ПА того же типа и пропорции. Тем не менее, ПА не были обнаружены в чае ройбуш на участках, свободных от сорняков.

В настоящее время тандемная масс-спектрометрия со сверхвысокой эффективностью жидкостной хроматографии (UPLC-MS/MS) с высокой селективностью и чувствительностью широко используется в качественном и количественном анализе ПА в сельскохозяйственной продукции и пищевых продуктах21,22. Метод обработки образцов обычно состоит либо из твердофазной экстракции (SPE), либо из очистки QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) сложных экстрактов пищевых матриц, которые позволяют получить максимально возможную чувствительность12,19. Однако надежные аналитические методы, позволяющие обнаруживать и количественно определять ПА в сложных матрицах, таких как почва, сорняки и свежие чайные листья, по-прежнему отсутствуют.

В этом исследовании было проанализировано 15 ПА в образцах сушеного чая, свежих чайных листьях, сорняках и ризосферных образцах почвы сорняков с помощью UPLC-MS / MS в сочетании с методом очистки адсорбента. Кроме того, 15 парных образцов почвы сорняков и ризосферных сорняков и 60 образцов свежих чайных листьев были собраны на пяти участках отбора проб в чайном саду Цзиньчжай в провинции Аньхой, Китай, и были проанализированы на наличие 15 ПА. Эти результаты могут предоставить метод обследования и некоторую информацию об источнике и пути ПА (загрязнения) в образцах чая для обеспечения качества и безопасности чая.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Для настоящего исследования были собраны следующие виды сорняков: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. и Crassocephalum crepidioides (Бент.) С. Мур. Свежие чайные листья были собраны из сорта чайных деревьев Longjing 43 #, а образцы сушеного чая были коммерчески доступными чайными изделиями, обработанными в соответствии с процессом производства зеленого чая (см. Таблицу материалов).

1. Сбор образцов

  1. Соберите 40 реальных образцов.
    1. Соберите 10 сорняков, 10 почв и 10 свежих чайных листьев случайным образом из нескольких чайных садов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящего исследования отбор проб почвы проводился на глубине 20 см с количеством пробы 200 г.
    2. Случайным образом соберите 10 сушеных чайных продуктов (250 г) из супермаркета.
  2. Соберите образцы сорняков, почвы и свежих чайных листьев, чтобы изучить источник загрязнения ПА в чае.
    1. Установите пять точек отбора проб в одном чайном саду, по три повторения в каждой точке.
    2. Соберите образцы сорняков Ageratum conyzoides L. с самым высоким содержанием PA, обычно встречающимся на чайных плантациях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образца составило 250 г для настоящего исследования.
    3. Соберите образцы почвы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы почвы представляли собой ризосферную почву A. conyzoides на глубине 20 см с количеством образца 200 г.
    4. Соберите свежие чайные листья из разных частей чайных растений, в том числе одну почку с двумя листьями, одну почку с тремя листьями, одну почку с четырьмя листьями и зрелые листья.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образца составило 250 г.

2. Обработка образцов

  1. Предварительно обработайте образцы, выполнив следующие действия.
    1. Измельчите высушенный чай и образцы почвы с помощью измельчителя, пропустите измельченные образцы через сито с ячейкой 200 меш и храните их при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеный чай был коммерчески доступным чайным продуктом (см. Таблицу материалов), поэтому его непосредственно измельчали и просеивали для хранения. Образцы почвы (200 г) помещали в проветриваемое место в темноте для сушки на воздухе в течение примерно одной недели.
    2. Гомогенизируйте сорняки и свежие чайные листья с помощью гомогенизатора и храните их при температуре -20 ° C.
  2. Проведите пробную обработку высушенных чайных продуктов, свежих чайных листьев и сорняков.
    1. Взвесьте 1,00 г каждого образца (сушеные чайные продукты, свежие чайные листья и сорняки) и поместите его в центрифужные пробирки объемом 50 мл.
    2. Добавьте 10 мл 0,1 моль/л раствора серной кислоты и встряхните в течение 2 мин для твердофазной экстракции (с использованием картриджа SPE, см. Таблицу материалов) и 1 мин для очистки адсорбента. Выполняют ультразвуковую экстракцию23 в течение 15 мин, а затем центрифугу в течение 10 мин со скоростью 9,390 x g при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность ультразвукового генератора составляла 290 Вт, частота колебаний составляла 35 кГц, а температура была установлена на 30 °C.
    3. Перенесите надосадочную жидкость в центрифужную пробирку объемом 50 мл с капельницей с пластиковым наконечником.
    4. Выполните описанные выше действия, чтобы повторить извлечение один раз. Соедините две надосадочные жидкости.
      1. Активируйте картриджи SPE 5 мл метанола и 5 мл деионизированной воды. Добавьте 10 мл надосадочной жидкости в предварительно активированный картридж и выполните очистку образца.
      2. После того, как уровень раствора образца достиг верхнего слоя картриджей, разбавляют аналиты 5 мл 1% раствора муравьиной кислоты, а затем 5 мл метанола. Откажитесь от элюата.
      3. Поливают 5 мл метанола (содержащего 0,5% аммиачной воды), фильтруют элюат через мембранный фильтр 0,22 мкм и анализируют с помощью UPLC-MS/MS (см. Таблицу материалов).
    5. Выполните очистку проб с помощью адсорбентов.
      1. Возьмите 2 мл надосадочной жидкости (этап 2.2.4) в центрифужную пробирку объемом 10 мл, заполненную адсорбентами GCB:PSA:C18 (10 мг:20 мг:15 мг, см. Таблицу материалов), встряхните в течение 1 мин и центрифугу при 9,390 x g в течение 8 мин при комнатной температуре.
      2. Пропустите 1 мл надосадочной жидкости через мембранный фильтр 0,22 мкм перед анализом с помощью UPLC-MS/MS.
  3. Проведите обработку образцов почвы.
    1. Взвесьте 1,00 г образца почвы. Поместите его в центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте 0,1 мл 0,1 моль/л раствора тринатрийцитрата 0,1 моль/л (см. Таблицу материалов), чтобы отрегулировать значение pH почвы до 6,0.
    2. Дайте постоять в течение 2 минут, а затем добавьте 10 мл раствора метанола серной кислоты 0,1 моль / л, встряхните в течение 2 минут и встряхните в течение 30 минут, а затем выполните ультразвуковую экстракцию в течение 30 минут.
    3. Центрифугу при 9,390 x g в течение 10 мин и перенесите надосадочную жидкость в центрифужную пробирку объемом 50 мл с капельницей с пластиковым наконечником.
    4. Выполните описанные выше шаги, чтобы повторить экстракцию и дважды смешать надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метод очистки был таким же, как и на шагах 2.2.5.1 и 2.2.5.2.

3. Инструментальный анализ

  1. Определите 15 PA в образцах сушеного чая, свежих чайных листьях, сорняках и почве (образцы из шага 2) с помощью коммерчески доступной системы UPLC-MS/MS (2,1 мм x 100 мм, 1,8 мкм) (см. Таблицу материалов).
  2. Установите температуру колонки на 40 °C, скорость потока на 0,250 мл/мин и объем впрыска на 3 мкл.
  3. Установите подвижную фазу А: метанол (содержащий 0,1% муравьиной кислоты + 1 ммоль/л формиата аммония) и подвижную фазу В: вода (содержащую 0,1% муравьиной кислоты + 1 ммоль/л формиата аммония).
  4. Установите процедуру градиентного элюирования: 10% А от 0,0 мин до 0,25 мин, 10%-30% А от 0,25 мин до 6,0 мин, 30%-40% А от 6,0 мин до 9,0 мин, 40%-98% А от 9,0 мин до 9,01 мин, которые удерживались в течение 1,9 мин, и 98%-100% А от 11,0 мин до 11,1 мин, которые удерживались в течение 2,9 мин.
  5. Установка параметров масс-спектрометра: режим ионизации, источник положительных ионов электрораспылением (ESI+); давление в распылителе, 7,0 бар; капиллярное напряжение, 4,0 кВ; расход обратного продувочного отверстия конического отверстия, 150 л/ч; расход газообразного растворителя, 800 л/ч; температура растворителя, 400 °C; расход ударного газа, 0,25 мл/мин.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Был установлен оптимизированный метод очистки и анализа адсорбента 15 ПА в образцах сухого чая, свежих чайных листьях, сорняках и почве и сопоставлен с широко используемым методом очистки с использованием картриджа SPE. Результаты показали, что извлечение 15 ПА в образцах сушеного чая, сорняков и свежих чайных листьев с использованием картриджа SPE составило 72-120%, в то время как при очистке адсорбента - 78-98% (рис. 1). Извлечение 15 ПА в почве с помощью адсорбентной очистки составило 79-111% (рис. 1). Сорок (40) реальных образцов были случайным образом собраны для определения содержания ООПТ для сравнения двух методов очистки (дополнительные таблицы 1-7). Гелиотрин (He) был обнаружен во всех 10 образцах сухого чая с использованием метода адсорбента с содержанием 1,3-22 мкг/кг, в то время как он был обнаружен только в трех образцах сушеного чая с использованием картриджа SPE с содержанием 1,8-24,6 мкг/кг (дополнительные таблицы 3-4).

Метод очистки адсорбента (GCB:PSA:C18) был выбран для обнаружения ПА в сорняках, ризосферных почвах сорняков и свежих чайных листьях в системах чайных плантаций. Пять мест отбора проб были выбраны в одном чайном саду в Цзиньчжае. В дополнение к якобину (Jb), сенецифиллину (Sp), сенецифиллину N-оксиду (SpNO) и сенкиркину (Sk) в сорняках A. conyzoides было обнаружено в общей сложности 11 ПА, из которых наибольшее содержание ПА было интермедином (Im) (2,006-2,970 мкг/кг), гелиотрин-N-оксидом (HeNO) (2,446-2,731 мкг/кг) и интермедин-N-оксидом (ImNO) (13,535-17,345 мкг/кг) (таблица 1). В почве на участке отбора проб 5 был обнаружен только ImNO с содержанием 6,05 мкг/кг (дополнительная таблица 8). ImNO и Sn были обнаружены в свежих чайных листьях с пяти участков отбора проб (рис. 2). ImNO был обнаружен в разных частях чайных растений, и его содержание варьировалось в пределах 4,36-26,5 мкг/кг, что было больше, чем у Sn, за исключением того, что Sn не был обнаружен в зрелых листьях из участка отбора проб 1 и участка отбора проб 2. Sn был обнаружен в разных частях чайных растений на других участках отбора проб, и его содержание варьировалось от 1,0 до 3,14 мкг/кг (рис. 2).

На участке отбора проб 5 было показано явление переноса ПА между сорняками, корнесферной почвой сорняков и свежими чайными листьями (рис. 3). Среди 11 сорняков PA в почве был обнаружен только ImNO с содержанием 6,05 мкг/кг, в то время как ImNO и Sn были обнаружены в разных частях чайных растений. Содержание ImNO в одном бутоне с двумя листьями было самым высоким – 12,6 мкг/кг (рис. 3).

Figure 1
Рисунок 1: Сравнение восстановления. Сравнение извлечения 15 ПА (пирролизидиновых алкалоидов) в экстрактах из (А) свежих чайных листьев, (Б) высушенных образцов чая, (С) сорняков и (D) образцов почвы после очистки адсорбентом (пиковый уровень = 0,02 мг/кг) и картриджами SPE (смешанные катионообменные твердофазные экстракционные колонны, пиковый уровень = 0,01 мг/кг). Полосы погрешности показывают стандартное отклонение, а проверка значимости была выполнена путем дисперсионного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Содержание и типы ПА (пирролизидиновых алкалоидов) в различных частях чайных растений, собранных на пяти участках отбора проб. (A) Участок отбора проб 1. (B) Участок отбора проб 2. (C) Место отбора проб 3. (D) Место отбора проб 4. (E) Место отбора проб 5. Полосы погрешности показывают стандартное отклонение, а проверка значимости была выполнена путем дисперсионного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: ПА, содержащиеся в сорняках, и их перенос в почву и свежие чайные листья. (A) Содержание и тип PA (пирролизидиновых алкалоидов), обнаруженных в сорняках, почве и свежих чайных листьях. (B) Содержание и тип ООПТ, обнаруженных в сорняках. Полосы погрешности показывают стандартное отклонение, а проверка значимости была выполнена путем дисперсионного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Сайт отбора проб Среднее содержание единичных ПА (± относительных стандартных отклонений), мкг/кг Содержание общих ПА (мкг/кг)
Он ОнНЕТ Им ИмНО Джб JbNO Ре Рено Сн SnNO Сп Сп
НЕТ		 Европейский Союз ЭуНО Ск
1 97.4 (2.43) 2731.1 (2.04) 2424.9 (1.84) 13754 (0.56) НД 1.92 (1.54) 21.2 (10.45) 4.01 (5.72) 58.4 (2.52) 17.2 (9.03) НД НД 224.0 (1.75) 6.9 (2.02) НД 19341.03
2 83.9 (1.21) 2518.6 (0.81) 2476.5 (1.15) 13945 (0.30) НД 2.60 (2.52) 28.8 (1.51) 4.82 (3.66) 63.7 (3.52) 19.8 (10.2) НД НД 248.6 (1.48) 7.0 (1.58) НД 19399.32
3 96.6 (1.67) 2470.4 (1.08) 2969.7 (1.02) 16829 (0.36) НД 2.12 (1.08) 20.9 (9.30) 2.94 (1.08) 51.0 (7.50) 14.9 (8.25) НД НД 252.1 (3.17) 5.91 (0.35) НД 22715.57
4 91.4 (1.98) 2638.6 (2.75) 2882.4 (1.98) 17345 (0.76) НД 2.42 (10.59) 15.4 (6.99) 2.67 (10.59) 51.6 (6.73) 15.0 (0.92) НД НД 281.3 (2.36) 6.78 (2.15) НД 23332.57
5 83.4 (3.79) 2446.7 (6.0) 2005.5 (3.79) 13535 (1.96) НД 1.68 (4.94) 15.2 (0.91) 2.70 (4.94) 49.4 (8.78) 16.9 (10.7) НД НД 215.2 (2.47) 5.99 (3.76) НД 18377.67

Таблица 1: Содержание единичных и общих ПА (пирролизидиновых алкалоидов) сорняков на пяти участках отбора проб. ND означает, что не обнаружено.

Дополнительная таблица 1: Содержание единичных и общих ПА в свежих чайных листьях, очищенных адсорбентным методом. ND означает, что не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Содержание единичных и общих ПА в свежих чайных листьях, очищенных SPE. ND означает, что не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 3: Содержание единичных и суммарных ПА в сушеном чае, очищенном адсорбентным методом. ND означает, что не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 4: Содержание единичных и общих ПА в сушеном чае, очищенном методом SPE. ND означает, что не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 5: Содержание единичных и общих ПА в сорняках, очищенных адсорбентным методом. ND означает, что не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 6: Содержание единичных и общих ПА в сорняках, очищенных с помощью SPE. ND означает, что не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 7: Содержание единичных и общих ПА в почвах, очищенных адсорбционным методом. ND означает, что не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 8: Содержание единичных и общих ООПТ почв на пяти участках отбора проб. ND означает, что не обнаружено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Настоящая работа была разработана для разработки эффективного, чувствительного метода изучения путей загрязнения и источников ПА в образцах чая, а также распределения ПА в различных частях чайных растений. Однако в этом исследовании только 15 ПА были успешно разделены на хроматографической колонке, что является очень небольшим числом по сравнению с большим количеством алкалоидов у видов растений 3,4. Это было связано не только с упаковочными свойствами самой колонны, но и со сложной матрицей исследуемых образцов чая. Таким образом, более совершенные методы разделения и очистки для обнаружения мульти-ПА все еще нуждаются в дальнейшем изучении.

Картриджи SPE и методы адсорбента применялись для обнаружения мульти-ПА в различных матрицах образцов, но в сложной матрице чая метод адсорбента не был зарегистрирован24. Поэтому в данной работе был разработан метод адсорбента с соотношением ГХБ:ПСА:С18 (10 мг:20 мг:15 мг), и извлечение 15 ПА соответствовало требованиям к детектированию ПА в разных матрицах образцов. Напротив, восстановление ImNO, Eu и Re составило в среднем 119%, 120% и 115% соответственно в сухом чае после очистки картриджами SPE, что показало значительный матричный эффект. Кроме того, по сравнению с картриджами SPE метод адсорбента (GCB:PSA:C18) имел более короткое время обработки образца, меньшую стоимость и лучшее извлечение для анализа PA (рис. 1B). Разработка методов обнаружения 15 ПА в образцах сушеного чая, свежих чайных листьях, сорняках и почве обеспечила эффективный метод обнаружения для изучения источника загрязнения ПА в образцах чая. Более того, согласно современным знаниям, в этом исследовании впервые был установлен метод обнаружения мульти-PA в почве.

Изучен путь переноса ООПТ в системе чайных плантаций. Наши исследования показывают, что A. conyzoides был одним из сорняков с самым высоким общим содержанием PA в чайном саду Цзиньчжай, и он рос рядом с чайными растениями. Таким образом, корнесферная почва A. conyzoides, A. conyzoides и различные части свежих чайных листьев были собраны с пяти участков отбора проб в одном чайном саду в Цзиньчжае для анализа 15 ПА. На рисунке 3 показано, что из 11 ПА, продуцируемых в A. conyzoides, только ImNO был обнаружен в ризосферной почве A. conyzoides, в то время как ImNO и Sn были обнаружены в свежих чайных листьях. Это указывает на то, что не все содержание ПА, продуцируемых в A. conyzoides, может быть перенесено в чайные растения через почвенную среду. Некоторое содержание ООПТ, переносимых в почву, может разлагаться почвенными микроорганизмами.

ImNO и Sn были в основном распределены в одной почке с двумя листьями и одной почке с тремя листьями, в то время как содержание PA в зрелых листьях было относительно низким. На участке отбора проб 4 содержание ImNO в одном почке с двумя листьями достигло 26,5 мкг/кг, в то время как в других частях чайного растения оно колебалось в пределах 7,14-10,4 мкг/кг. Sn не был обнаружен в зрелых листьях на участке отбора проб 1 и участке отбора проб 2. Это указывает на то, что обогащенные части ПА в чайных растениях были в основном сосредоточены в молодых листьях, а содержание было намного ниже максимального предела остатков ПА в образцах чая, установленного Европейским союзом (150 мкг/кг для взрослых, 75 мкг/кг для младенцев и детей младшего возраста)25. Результаты показывают, что ПА в образцах чая могут поступать из сорняков, продуцирующих ПА в чайных садах через почву. Кроме того, результаты подтверждают передачу и обмен ООПТ между растениями17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам раскрывать нечего.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным естественно-научным фондом Китая (32102244), Национальным проектом оценки качества и безопасности сельскохозяйственной продукции и рисков (GJFP2021001), Естественно-научным фондом провинции Аньхой (19252002) и Министерством сельского хозяйства США (HAW05020H).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115197 CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 181210 CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%) Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) G0860050 CAS No:540-69-2
Carbon-GCB CNW B7760030 120-400 MESH, 10g. per box 
Centrifuge Z 36 HK HERMLE Z36HK 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea product Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun loose tea Green tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) BioCrick 323256 CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%) BioCrick 98222 CAS No:570-19-4
Formate (98.0%) Aladdin E2022005 CAS No:64-18-6
HC-C18 CNW D2110060 40-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%) BioCrick 906426 CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) BioCrick 22581 CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WS cence 203158000 Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 column Waters 186004976 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%) BioCrick 114843 CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) BioCrick 340066 CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%) BioCrick 132282048 CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) ChemFaces CFN00461 CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115100 CAS No:67-56-1
PSA Agela P19-00833 40-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%) BioCrick 5281743 CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) BioCrick 5281734 CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%) BioCrick 5280906 CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) BioCrick 5380876 CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) BioCrick 6442619 CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%) BioCrick 5281750 CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%) BioCrick 5281752 CAS No:2318-18-5
SPE PCX Agilent Technologies 12108206 Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 1003019 CAS No:7664-93-9
Trisodium citrate Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. 20121009 CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleaner Supmile KQ-600B Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMS Waters ZPLYY-003 Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillator Guoyu instrument SHY-2AHS Oscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498 (2019).
  2. EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed. EFSA Journal. 9 (11), 134 (2011).
  3. Ma, C., et al. Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).
  4. Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. Encyclopedia of Food Chemistry. Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. 1, Elsevier. 348-355 (2019).
  5. Huang, D. Y., et al. Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea. Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).
  6. Liang, A. H., Ye, Z. G. General situation of the toxicity researches on Senecio. China Journal of Chinese Materia Medica. 31 (2), 93-97 (2006).
  7. Li, Y. H., et al. Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats. Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).
  8. Jia, Z. J., et al. Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity. The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).
  9. Yang, M., et al. First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans. Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).
  10. Chen, Z., Huo, J. R. Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).
  11. Mattocks, A. R. Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloid. , Academic Press. London, UK. (1986).
  12. Picron, J. F., Herman, M., Van Hoeck, E., Goscinny, S. Analytical strategies for the determination of pyrrolizidine alkaloids in plant based food and examination of the transfer rate during the infusion process. Food Chemistry. 266, 514-523 (2018).
  13. Kowalczyk, E., Kwiatek, K. Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas. Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).
  14. EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA Journal. 15 (7), 04908 (2017).
  15. Han, H., et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk. Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).
  16. Nowak, M., et al. Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities. Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).
  17. Selmar, D., et al. Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations. Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).
  18. Izcara, S., et al. Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs. Food Chemistry. 380, 132189 (2022).
  19. Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples. Foods. 9 (9), 1319 (2020).
  20. Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis). South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).
  21. Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).
  22. Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea. Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).
  23. Han, H. L., et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds. Food control. 132, 108518 (2022).
  24. Bodi, D., et al. Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey. Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).
  25. European Union Commission. Commission Regulation (EU) 2020/2040 of 11 December 2020 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of pyrrolizidine alkaloids in certain foodstuffs. Official Journal of the European Union. 14 (12), 1-4 (2020).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 187 Источник загрязнение чайный сад пирролизидин алкалоиды адсорбент
Источник и путь загрязнения алкалоидами пирролизидина в образцах чая
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiao, W., Shen, T., Wang, L., Zhu,… More

Jiao, W., Shen, T., Wang, L., Zhu, L., Li, Q. X., Wang, C., Chen, H., Hua, R., Wu, X. Source and Route of Pyrrolizidine Alkaloid Contamination in Tea Samples. J. Vis. Exp. (187), e64375, doi:10.3791/64375 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter