Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

מקור ומסלול של זיהום אלקלואיד Pyrrolizidine בדגימות תה

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64375
Automatic Translation
1,2, 2, 1, 1,3, 4, 3, 3, 1, 1
1Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province, School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, 2State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Agricultural University, 3Key Laboratory of Tea Quality and Safety & Risk Assessment, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture, 4Department of Molecular Biosciences and Bioengineering, University of Hawaii at Manoa

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הזיהום של אלקלואידים פירוליזידין (PAs) בדגימות תה מעשבים המייצרים עשבים בשטחי הרשות הפלסטינית בגינות תה.

Abstract

אלקלואידים פירוליזידין רעילים (PAs) נמצאים בדגימות תה, אשר מהווים איום על בריאות האדם. עם זאת, המקור והתוואי של זיהום הרשות הפלסטינית בדגימות תה נותרו לא ברורים. בעבודה זו, פותחה שיטת ספיגה בשילוב עם UPLC-MS/MS כדי לקבוע 15 PAs בעשב Ageratum conyzoides L., A. conyzoides קרקע ריזוספרית, עלי תה טריים, ודגימות תה מיובש. ממוצע המחלימים נע בין 78%-111%, עם סטיות תקן יחסיות של 0.33%-14.8%. חמישה עשר זוגות של דגימות קרקע ריזוספריות של A. conyzoides ו-A. conyzoides ו-60 דגימות עלי תה טריים נאספו מגן התה Jinzhai בפרובינציית אנחווי, סין, ונותחו עבור 15 PAs. לא כל 15 ה-PAs התגלו בעלי תה טריים, למעט תחמוצת N (ImNO) וסנציונין (Sn). התוכן של ImNO (34.7 מיקרוגרם / ק"ג) היה גדול מזה של Sn (9.69 מיקרוגרם / ק"ג). בנוסף, הן ImNO והן Sn היו מרוכזים בעלים הצעירים של צמח התה, בעוד התוכן שלהם היה נמוך יותר בעלים הישנים. התוצאות הצביעו על כך שהרש"פ בתה הועברו דרך הדרך של עשבים שוטים המייצרים עשבים שוטים - אדמה - עלי תה טריים בגינות תה.

Introduction

כמטבוליטים משניים, אלקלואידים פירוליזידין (PAs) מגנים על צמחים מפני אוכלי עשב, חרקים ופתוגנים 1,2. עד כה, מעל 660 PAs ותחמוצות PA-N (PANOs) עם מבנים שונים נמצאו ביותר מ -6,000 מיני צמחים ברחבי העולם 3,4. צמחים המייצרים PA נמצאים בעיקר במשפחות מורכבים, Boraginaceae, Fabaceae ו- Apocynaceae 5,6. PAs מחומצנים בקלות לאלקלואידים לא יציבים של דהידרופירוליזידין, שיש להם אלקטרופיליות חזקה ויכולים לתקוף נוקלאופילים כגון DNA וחלבונים, וכתוצאה מכך נמק של תאי כבד, חסימות ורידיות, שחמת, מיימת ותסמינים אחרים 7,8. איבר המטרה העיקרי של רעילות הרשות הפלסטינית הוא הכבד. PAs יכולים גם לגרום לרעילות ריאות, כליות ואיברים אחרים ולרעילות מוטגנית, מסרטנת והתפתחותית 9,10.

מקרים של הרעלת בני אדם ובעלי חיים דווחו במדינות רבות כתוצאה מבליעה של עשבי תיבול מסורתיים, תוספי מזון או תה המכילים PAs או זיהום עקיף של מזונות כגון חלב, דבש או בשר (רעיל מבליעת מרעה המכיל PAs)11,12,13. ממצאי הרשות האירופית לבטיחות מזון (EFSA) מצביעים על כך שחומרים כגון תה (צמחי) הם מקור חשוב לחשיפה אנושית ל-PAs/PANOs14. דגימות תה אינן מייצרות PAs, בעוד שצמחים המייצרים PA נמצאים בדרך כלל בגני תה (למשל, Emilia sonchifolia, Senecio angulatus ו- Ageratum conyzoides)15. בעבר נחשד כי התה עלול להיות מזוהם בחומרי PA ממפעלי הייצור שלהם במהלך הקטיף והעיבוד. עם זאת, נמצאו גם כמה עלי תה שנקטפו ביד (כלומר, ללא צמחים המייצרים ברש"פ), דבר המצביע על כך שחייבים להיות נתיבים או מקורות זיהום אחרים16. נערך ניסוי גידול משותף של סמרטוט (Senecio jacobaea) עם מליסה (Melissa officinalis), נענע חריפה (Mentha piperita), פטרוזיליה (Petroselinum crispum), קמומיל (Matricaria recutita) וצמחים nasturtium (Tropaeolum majus), והתוצאות הראו כי PAs זוהו בכל הצמחים הללו17. הוכח כי הרש"פ אכן מועבר ומוחלף בין צמחים חיים דרך אדמה18,19. Van Wyk et al.20 מצאו כי תה רויבוס (Aspalathus linearis) היה מזוהם קשות באתרים עשירים בעשבים והכיל PAs מאותו סוג ופרופורציה. עם זאת, לא נמצאו PAs בתה רויבוש באתרים נטולי עשבים.

נכון לעכשיו, ספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC-MS/MS) עם סלקטיביות ורגישות גבוהות נמצאת בשימוש נרחב בניתוח האיכותי והכמותי של PAs במוצרים חקלאיים ומזון21,22. שיטת הטיפול לדוגמה מורכבת בדרך כלל מיצוי פאזה מוצקה (SPE) או ניקוי QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) של תמציות מטריצות מזון מורכבות, אשר יכול להשיג את הרגישות הגבוהה ביותר האפשרית12,19. עם זאת, שיטות אנליטיות חזקות המאפשרות זיהוי וכימות של PAs במטריצות מורכבות כמו אדמה, עשבים שוטים ועלי תה טריים עדיין חסרות.

מחקר זה ניתח 15 PAs בדגימות תה מיובש, עלי תה טריים, עשבים שוטים ודגימות קרקע ריזוספריות של עשבים עם UPLC-MS/MS בשילוב עם שיטת טיהור סופג. יתר על כן, 15 דגימות קרקע ריזוספריות של עשבים ועשבים ו-60 דגימות עלי תה טריים נאספו מחמישה אתרי דגימה בגן התה ג'ינז'אי במחוז אנחווי, סין, ונותחו עבור 15 PAs. תוצאות אלה יכולות לספק שיטת סקר ומידע מסוים על המקור והמסלול של PAs (זיהום) בדגימות תה כדי להבטיח את האיכות והבטיחות של תה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לצורך המחקר הנוכחי נאספו מיני העשבים הבאים: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. ו-Crassocephalum crepidioides (בנט.) ש. מור. עלי התה הטריים נקטפו ממגוון עצי התה Longjing 43#, ודגימות התה המיובש היו תה זמין מסחרית שעובד בהתאם לתהליך ייצור התה הירוק (ראה טבלת חומרים).

1. איסוף דוגמאות

  1. אספו 40 דגימות אמיתיות.
    1. אספו 10 עשבים שוטים, 10 קרקעות ו-10 עלי תה טריים באופן אקראי ממספר גינות תה.
      הערה: במחקר הנוכחי, הקרקע נדגמה בעומק של 20 ס"מ עם כמות מדגם של 200 גרם.
    2. אספו באופן אקראי 10 מוצרי תה מיובשים (250 גרם) מסופרמרקט.
  2. אספו דגימות של עשבים שוטים, אדמה ועלי תה טריים כדי לחקור את מקור הזיהום של PAs בתה.
    1. קבעו חמש נקודות דגימה באותו גן תה, עם שלושה עותקים משוכפלים בכל נקודה.
    2. אספו דגימות עשבים מסוג Ageratum conyzoides L. עם תכולת הרש"פ הגבוהה ביותר הנפוצה בגינות תה.
      הערה: כמות המדגם הייתה 250 גרם עבור המחקר הנוכחי.
    3. אספו את דגימות הקרקע.
      הערה: דגימות הקרקע היו קרקע קנה שורש A. conyzoides בעומק של 20 ס"מ עם כמות דגימה של 200 גרם.
    4. אספו את עלי התה הטריים מחלקים שונים של צמחי התה, כולל ניצן אחד עם שני עלים, ניצן אחד עם שלושה עלים, ניצן אחד עם ארבעה עלים ועלים בוגרים.
      הערה: כמות הדגימה הייתה 250 גרם.

2. טיפול לדוגמה

  1. טפל בדגימות לפי השלבים הבאים.
    1. טוחנים את דגימות התה והאדמה המיובשים במטחנה, מעבירים את הדגימות המרוסקות דרך מסננת של 200 רשתות, ומאחסנים אותן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: התה המיובש היה מוצר תה זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים), ולכן הוא נמעך ישירות ונופה לאחסון. דגימות הקרקע (200 גרם) הונחו במקום מאוורר בחושך לייבוש באוויר למשך כשבוע.
    2. הומוגניזציה של העשבים ועלי התה הטריים עם הומוגנייזר ואחסנו אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
  2. בצע טיפול לדוגמה של מוצרי תה מיובשים, עלי תה טריים, ועשבים שוטים.
    1. שוקלים 1.00 גרם מכל דגימה (מוצרי תה מיובשים, עלי תה טריים ועשבים שוטים) ומניחים אותה בצינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל.
    2. הוסף 10 מ"ל של תמיסת חומצה גופרתית 0.1 mol/L ומערבולת למשך 2 דקות למיצוי בשלב מוצק (באמצעות מחסנית SPE, ראה טבלת חומרים) ודקה לטיהור סופג. בצע חילוץ קולי23 במשך 15 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 10 דקות במהירות של 9,390 x גרם בטמפרטורת החדר.
      הערה: כוחו של המתנד הקולי היה 290 W, תדירות התנודה הייתה 35 קילוהרץ, והטמפרטורה נקבעה ל -30 מעלות צלזיוס.
    3. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל בעזרת טפטפת קצה פלסטיק.
    4. בצע את השלבים לעיל כדי לחזור על החילוץ פעם אחת. שלבו בין שני הסופרנאטנטים.
      1. הפעל את מחסניות SPE עם 5 מ"ל מתנול ו -5 מ"ל מים נטולי יונים. הוסף 10 מ"ל של supernatant למחסנית שהופעלה מראש ובצע ניקוי דגימה.
      2. לאחר שרמת התמיסה הדגימה הגיעה לשכבה העליונה של המחסניות, יש להדק את האנליטים עם 5 מ"ל של תמיסת חומצה פורמית 1% ולאחר מכן 5 מ"ל מתנול. השליכו את ה-eluate.
      3. יש לסנן עם 5 מ"ל מתנול (המכיל 0.5% מי אמוניה), לסנן את הפולט דרך מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר, ולנתח באמצעות UPLC-MS/MS (ראה טבלת חומרים).
    5. בצע ניקוי לדוגמה באמצעות adsorbents.
      1. קח 2 מ"ל של supernatant (שלב 2.2.4) לתוך צינור צנטריפוגה 10 מ"ל מלא adsorbents של GCB:PSA:C18 (10 מ"ג: 20 מ"ג: 15 מ"ג, ראה טבלה של חומרים), מערבולת במשך 1 דקות, וצנטריפוגה ב 9,390 x גרם במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר.
      2. להעביר 1 מ"ל של supernatant דרך מסנן קרום 0.22 מיקרומטר לפני ניתוח על ידי UPLC-MS/MS.
  3. לבצע טיפול בדגימות הקרקע.
    1. שוקלים דגימת קרקע של 1.00 גרם. מניחים אותו בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, ומוסיפים 0.1 מ"ל של תמיסת טריסודיום ציטראט 0.1 mol/L (ראה טבלת חומרים) כדי להתאים את ערך ה- pH של הקרקע ל- 6.0.
    2. אפשר לעמוד במשך 2 דקות, ולאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של 0.1 mol / L חומצה גופרתית מתנול פתרון, מערבולת במשך 2 דקות לנער במשך 30 דקות, ולאחר מכן לבצע מיצוי קולי במשך 30 דקות.
    3. צנטריפוגה במשקל 9,390 x גרם למשך 10 דקות, ומעבירים את הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל עם טפטפת קצה פלסטיק.
    4. בצע את השלבים לעיל כדי לחזור על החילוץ ולשלב את supernatant פעמיים.
      הערה: שיטת הטיהור הייתה זהה לשלב 2.2.5.1 ולשלב 2.2.5.2.

3. ניתוח אינסטרומנטלי

  1. זהה את 15 PAs בדגימות תה מיובש, עלי תה טריים, עשבים ואדמה (דגימות משלב 2) באמצעות מערכת UPLC-MS/MS זמינה מסחרית (2.1 מ"מ x 100 מ"מ, 1.8 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים).
  2. הגדר את טמפרטורת העמודה ל- 40°C, את קצב הזרימה ל- 0.250 מ"ל/דקה ואת נפח ההזרקה ל- 3 μL.
  3. הגדר את השלב הנייד A: מתנול (המכיל 0.1% חומצה פורמית + 1 mmol / L אמוניום formate), ונייד שלב B: מים (מכיל 0.1% חומצה פורמית + 1 mmol / L אמוניום formate).
  4. הגדר הליך הדחה הדרגתית: 10% A מ-0.0 דקות עד 0.25 דקות, 10%-30% A מ-0.25 דקות עד 6.0 דקות, 30%-40% A מ-6.0 דקות עד 9.0 דקות, 40%-98% A מ-9.0 דקות עד 9.01 דקות שנמשך 1.9 דקות, ו-98%-100% A מ-11.0 דקות עד 11.1 דקות שנמשך 2.9 דקות.
  5. הגדר את פרמטרי ספקטרומטר המסה: מצב יינון, מקור יונים חיובי אלקטרוספריי (ESI+); לחץ אטומייזר, 7.0 בר; מתח נימי, 4.0 קילו וולט; חור מתחדד חזרה נושבת זרימה, 150 L / h; זרימת גז ממס, 800 L/h; טמפרטורת ממס, 400 °C; זרימת גז אימפקט, 0.25 מ"ל/דקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת הטיהור והניתוח האופטימלית של 15 PAs בדגימות תה מיובש, עלי תה טריים, עשבים שוטים ואדמה נקבעה והושוותה לשיטת הטיהור הנפוצה באמצעות מחסנית SPE. התוצאות הראו כי השחזור של 15 PAs בדגימות תה מיובש, עשבים ועלי תה טריים באמצעות מחסנית SPE היה 72%-120%, בעוד שהשימוש בטיהור סופג היה 78%-98% (איור 1). ההשבה של 15 הרש"פ בקרקע באמצעות טיהור סופח הייתה 111%-79% (תרשים 1). ארבעים (40) דגימות אמיתיות נאספו באופן אקראי כדי לזהות את התוכן של PAs כדי להשוות בין שתי שיטות הניקוי (טבלאות משלימות 1-7). הליוטרין (He) זוהה בכל 10 דגימות התה המיובש בשיטת הספיגה עם תכולה של 1.3-22 מק"ג/ק"ג, בעוד שהוא זוהה רק בשלוש דגימות תה מיובש באמצעות מחסנית SPE עם תכולה של 1.8-24.6 מיקרוגרם/ק"ג (טבלאות משלימות 3-4).

שיטת טיהור הספיגה (GCB:PSA:C18) נבחרה כדי לזהות PAs בעשבים שוטים, קרקעות קנה שורש של עשבים ועלי תה טריים במערכות מטעי תה. חמישה אתרי דיגום נבחרו בגן תה אחד בג'ינז'אי. בנוסף ליעקובין (Jb), סניציפילין (Sp), סנציפילין N-אוקסיד (SpNO) וסנקירקין (Sk), התגלו בסך הכל 11 PAs בעשב A . conyzoides, מתוכם התכולה הגבוהה ביותר של PAs הייתה אינטרמדין (Im) (2,006-2,970 מיקרוגרם/ק"ג), הליוטרין-N-אוקסיד (HeNO) (2,446-2,731 מיקרוגרם/ק"ג) ואינטרמדין-N-אוקסיד (ImNO) (13,535-17,345 מיקרוגרם/ק"ג) (טבלה 1). בקרקע זוהה רק ImNO באתר דיגום 5, עם תכולה של 6.05 מק"ג/ק"ג (טבלה משלימה 8). ImNO ו-Sn התגלו בעלי תה טריים מחמשת אתרי הדגימה (איור 2). ImNO זוהה בחלקים שונים של צמחי התה, ותכולתו נעה בין 4.36 ל-26.5 מק"ג/ק"ג, שהיה גדול מזה של Sn, פרט לכך ש-Sn לא זוהה בעלים בוגרים מאתר דגימה 1 ומאתר דגימה 2. Sn זוהה בחלקים שונים של צמחי התה באתרי הדגימה האחרים, והתכולה נעה בין 1.0 ל-3.14 מק"ג/ק"ג (איור 2).

באתר דיגום 5 הודגמה תופעת ההעברה של PAs בין העשבים, אדמת קנה השורש של העשבים ועלי התה הטריים (איור 3). מבין 11 העשבים השוטים של הרשות הפלסטינית, רק ImNO זוהה בקרקע, עם תכולה של 6.05 מק"ג/ק"ג, בעוד ImNO ו-Sn זוהו בחלקים שונים של צמחי התה. התוכן של ImNO בניצן אחד עם שני עלים היה הגבוה ביותר, שהיה 12.6 מיקרוגרם לק"ג (איור 3).

Figure 1
איור 1: השוואת התאוששות. השוואה בין השחזור של 15 PAs (אלקלואידים פירוליזידין) בתמציות מ-(A) עלי תה טריים, (B) דגימות תה מיובש, (C) עשבים, ו-(D) דגימות אדמה לאחר ניקוי עם מחסניות ספיגה (רמת ספייק = 0.02 מ"ג/ק"ג) ומחסניות SPE (עמודות מיצוי משולבות של קטיונים בשלב מוצק, רמת ספייק = 0.01 מ"ג/ק"ג). פסי השגיאה מציגים את סטיית התקן, ומבחן המובהקות בוצע על ידי ניתוח שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התכולה והסוגים של PAs (אלקלואידים פירוליזידין) בחלקים שונים של צמחי התה שנאספו מחמשת אתרי הדגימה. (א) אתר דיגום 1. (ב) אתר דיגום 2. (ג) אתר דיגום 3. (ד) אתר דיגום 4. (ה) אתר דיגום 5. פסי השגיאה מציגים את סטיית התקן, ומבחן המובהקות בוצע על ידי ניתוח שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: PAs הכלולים בעשבים שוטים והעברתם לאדמה ולעלי תה טריים. (A) התוכן והסוג של PAs (אלקלואידים פירוליזידין) שזוהו בעשבים, באדמה ובעלי תה טריים. (ב) התוכן והסוג של הרש"פ שזוהו בעשבים השוטים. פסי השגיאה מציגים את סטיית התקן, ומבחן המובהקות בוצע על ידי ניתוח שונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

אתר דיגום התכולה הממוצעת של PAs בודדים (± סטיות תקן יחסיות), מק"ג/ק"ג תכולת סך כל הרש"פ (מק"ג/ק"ג)
הוא HeNO Im אימנו Jb JbNO מחדש רינו אנונימי סנו ספ ספ
לא		 האיחוד האירופי EuNO סק
1 97.4 (2.43) 2731.1 (2.04) 2424.9 (1.84) 13754 (0.56) ND 1.92 (1.54) 21.2 (10.45) 4.01 (5.72) 58.4 (2.52) 17.2 (9.03) ND ND 224.0 (1.75) 6.9 (2.02) ND 19341.03
2 83.9 (1.21) 2518.6 (0.81) 2476.5 (1.15) 13945 (0.30) ND 2.60 (2.52) 28.8 (1.51) 4.82 (3.66) 63.7 (3.52) 19.8 (10.2) ND ND 248.6 (1.48) 7.0 (1.58) ND 19399.32
3 96.6 (1.67) 2470.4 (1.08) 2969.7 (1.02) 16829 (0.36) ND 2.12 (1.08) 20.9 (9.30) 2.94 (1.08) 51.0 (7.50) 14.9 (8.25) ND ND 252.1 (3.17) 5.91 (0.35) ND 22715.57
4 91.4 (1.98) 2638.6 (2.75) 2882.4 (1.98) 17345 (0.76) ND 2.42 (10.59) 15.4 (6.99) 2.67 (10.59) 51.6 (6.73) 15.0 (0.92) ND ND 281.3 (2.36) 6.78 (2.15) ND 23332.57
5 83.4 (3.79) 2446.7 (6.0) 2005.5 (3.79) 13535 (1.96) ND 1.68 (4.94) 15.2 (0.91) 2.70 (4.94) 49.4 (8.78) 16.9 (10.7) ND ND 215.2 (2.47) 5.99 (3.76) ND 18377.67

טבלה 1: תכולת PAs בודדים ושלמים (אלקלואידים פירוליזידין) של עשבים שוטים בחמשת אתרי הדגימה. ND אינו מייצג אף אחד שזוהה.

טבלה משלימה 1: תכולת PAs בודדים ושלמים בעלי תה טריים מטוהרים בשיטת הספיגה. ND אינו מייצג אף אחד שזוהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 2: תכולת PAs בודדים ושלמים בעלי תה טריים מטוהרים על ידי SPE. ND אינו מייצג אף אחד שזוהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 3: תכולת PAs בודדים ושלמים בתה מיובש מטוהר בשיטת הספיגה. ND אינו מייצג אף אחד שזוהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 4: התוכן של PAs בודדים ומוחלטים בתה יבש מטוהר על ידי SPE. ND אינו מייצג אף אחד שזוהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 5: תכולת הרש"פ הבודד והכולל בעשבים שוטהרים בשיטת הספיגה. ND אינו מייצג אף אחד שזוהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 6: תכולת PAs בודדים ושלמים בעשבים מטוהרים על ידי SPE. ND אינו מייצג אף אחד שזוהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 7: תכולת הרשות הבודדת והכוללת בקרקעות שטוהרו בשיטת הספיגה. ND אינו מייצג אף אחד שזוהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 8: תכולת קרקעות בודדות ושלמות בחמשת אתרי הדיגום. ND אינו מייצג אף אחד שזוהה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

העבודה הנוכחית נועדה לפתח שיטה יעילה ורגישה לחקר נתיבי הזיהום והמקורות של PAs בדגימות תה, כמו גם את התפלגות הרש"פ בחלקים שונים של צמחי התה. עם זאת, במחקר זה, רק 15 PAs הופרדו בהצלחה על העמודה הכרומטוגרפית, שהוא מספר קטן מאוד בהשוואה למספר הגדול של אלקלואידים במיני צמחים 3,4. זה לא היה קשור רק לתכונות האריזה של העמודה עצמה, אלא גם למטריצה המורכבת של דגימות התה שנבדקו. לכן, שיטות הפרדה וטיהור טובות יותר לאיתור ריבוי PAs עדיין דורשות חקירה נוספת.

מחסניות SPE ושיטות ספיגה יושמו כדי לזהות multi-PAs במגוון מטריצות דגימה, אך במטריצה המורכבת של תה, שיטת הספיגה לא דווחה24. לכן, שיטת ספיגה עם יחס של GCB:PSA:C18 (10 מ"ג:20 מ"ג:15 מ"ג) פותחה בעבודה זו, והשחזור של 15 PAs עמד בדרישות הזיהוי עבור PAs במטריצות מדגם שונות. לעומת זאת, ההתאוששות של ImNO, Eu ו-Re הייתה בממוצע 119%, 120% ו-115%, בהתאמה, בתה מיובש לאחר ניקוי עם מחסניות SPE, שהראו אפקט מטריצה משמעותי. יתר על כן, בהשוואה למחסניות SPE, לשיטת הספיגה (GCB:PSA:C18) היה זמן טיפול קצר יותר בדגימה, עלות נמוכה יותר והתאוששות טובה יותר עבור ניתוח PA (איור 1B). קביעת שיטות איתור ל-15 PAs בדגימות תה מיובש, עלי תה טריים, עשבים שוטים ואדמה סיפקה שיטת איתור יעילה לחקר מקור הזיהום של PAs בדגימות תה. יתר על כן, על פי הידע הקיים, לראשונה במחקר זה נקבעה שיטת גילוי רב-רשותית בקרקע.

נבדק מסלול המעבר של הרש"פ במערכת מטעי התה. המחקרים שלנו מצביעים על כך ש-A. conyzoides היה אחד העשבים עם תכולת הרש"פ הכוללת הגבוהה ביותר בגן התה של ג'ינז'אי, והוא גדל לצד צמחי התה. לכן, A. conyzoides, A. conyzoides rhizospheric soil, והחלקים השונים של עלי תה טריים נאספו מחמשת אתרי הדגימה בגן תה אחד בג'ינז'אי כדי לנתח את 15 PAs. איור 3 מראה כי מבין 11 PAs שיוצרו ב-A. conyzoides, רק ImNO זוהה בקרקע ריזוספרית של A. conyzoides , בעוד ש-ImNO ו-Sn זוהו בעלי תה טריים. הדבר מצביע על כך שלא כל תכולת הרש"פ המיוצרת ב-A. conyzoides יכולה להיות מועברת לצמחי התה דרך מדיום הקרקע. חלק מתכולת הרש"פ המועברת לקרקע עלולה להתפרק על ידי מיקרואורגניזמים בקרקע.

ImNO ו-Sn חולקו בעיקר בניצן אחד עם שני עלים וניצן אחד עם שלושה עלים, בעוד שתכולת PAs בעלים בוגרים הייתה נמוכה יחסית. באתר דגימה 4, תכולת ImNO בניצן אחד עם שני עלים הגיעה ל -26.5 מיקרוגרם / ק"ג, בעוד שבחלקים אחרים של צמח התה נעה בין 7.14-10.4 מיקרוגרם / ק"ג. Sn לא זוהה בעלים בוגרים באתר דיגום 1 ובאתר דגימה 2. הדבר מצביע על כך שהחלקים המועשרים של PAs בצמחי התה התרכזו בעיקר בעלים הצעירים, והתכולה הייתה נמוכה בהרבה מגבול השאריות המרבי של PAs בדגימות תה שקבע האיחוד האירופי (150 מיקרוגרם לק"ג למבוגרים, 75 מיקרוגרם לק"ג לתינוקות וילדים קטנים)25. התוצאות מגלות כי הרש"פ בדגימות תה עשוי להגיע מעשבים המייצרים עשבים בגינות תה דרך הקרקע. יתר על כן, התוצאות מאשרות העברה והחלפה של PAs בין מפעלים17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32102244), הפרויקט הלאומי לאיכות ובטיחות והערכת סיכונים של מוצרים חקלאיים (GJFP2021001), הקרן המדעית הטבעית של מחוז אנחווי (19252002) ומשרד החקלאות האמריקאי (HAW05020H).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115197 CAS No:75-05-8
Ammonia (25%-28%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 181210 CAS No:1336-21-6
Ammonium formate (97.0%) Anpel Laboratory Technoiogies (shanghai) G0860050 CAS No:540-69-2
Carbon-GCB CNW B7760030 120-400 MESH, 10g. per box 
Centrifuge Z 36 HK HERMLE Z36HK 30000 rpm (min:10 rpm), Dimensions (W x H x D): 71.5 cm× 42 cm × 51 cm
Commercially available tea product Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun loose tea Green tea
Europine N-oxid (EuNO) (98.0%) BioCrick 323256 CAS No:65582-53-8
Europine (Eu) (98.0%) BioCrick 98222 CAS No:570-19-4
Formate (98.0%) Aladdin E2022005 CAS No:64-18-6
HC-C18 CNW D2110060 40-63 μm,100g.per box
Heliotrine (He) (98.0%) BioCrick 906426 CAS No:303-33-3
Heliotrine-N-oxide (HeNO) (98.0%) BioCrick 22581 CAS No:6209-65-0
High speed centrifuge TG16-WS cence 203158000 Max:16000 r/min, 330 × 390 × 300 mm (L × W × H), Capacity: 6 × 50 mL
HSS T3 column Waters 186004976 ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 × 100 mm 1.8 μm)
Intermedine (Im) (98.0%) BioCrick 114843 CAS No:10285-06-0
Intermedine-N-oxide (ImNO) (98.0%) BioCrick 340066 CAS No:95462-14-9
Jacobine (Jb) (98.0%) BioCrick 132282048 CAS No:6870-67-3
Jacobine-N-oxide (JbNO) (98.0%) ChemFaces CFN00461 CAS No:38710-25-7
Methyl Alcohol (99.9%) Tedia Company,Inc. 21115100 CAS No:67-56-1
PSA Agela P19-00833 40-60 μm, 60 Å 100g.per box
Retrorsine (Re) (98.0%) BioCrick 5281743 CAS No:480-54-6
Retrorsine-N-oxide (ReNO) (98.0%) BioCrick 5281734 CAS No:15503-86-3
Senecionine (Sc) (98.0%) BioCrick 5280906 CAS No:130-01-8
Senecionine-N-oxide (ScNO) (98.0%) BioCrick 5380876 CAS No:13268-67-2
Seneciphylline N-oxid (SpNO) (98.0%) BioCrick 6442619 CAS No:38710-26-8
Seneciphylline (Sp) (98.0%) BioCrick 5281750 CAS No:480-81-9
Senkirkine (Sk) (98.0%) BioCrick 5281752 CAS No:2318-18-5
SPE PCX Agilent Technologies 12108206 Cation Mixed Mode, 6 mL
Sulfuric acid (97%) Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. 1003019 CAS No:7664-93-9
Trisodium citrate Sinpharm Chemical Reagent Co., Ltd. 20121009 CAS No:6132-04-3
Ultrasonic cleaner Supmile KQ-600B Inner slot size: 500 × 300 × 150 mm; Capacity: 22.5 L
UPLC-xevoTQMS Waters ZPLYY-003 Triple four-stage rod mass analyzer, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Liquid Phase System
Water bath thermostat oscillator Guoyu instrument SHY-2AHS Oscillation times:  60-300 times/min, Constant temperature range: room temperature to 100 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants. Molecules. 24 (3), 498 (2019).
  2. EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed. EFSA Journal. 9 (11), 134 (2011).
  3. Ma, C., et al. Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research. Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).
  4. Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. Encyclopedia of Food Chemistry. Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. 1, Elsevier. 348-355 (2019).
  5. Huang, D. Y., et al. Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea. Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).
  6. Liang, A. H., Ye, Z. G. General situation of the toxicity researches on Senecio. China Journal of Chinese Materia Medica. 31 (2), 93-97 (2006).
  7. Li, Y. H., et al. Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats. Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).
  8. Jia, Z. J., et al. Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity. The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).
  9. Yang, M., et al. First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans. Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).
  10. Chen, Z., Huo, J. R. Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).
  11. Mattocks, A. R. Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloid. , Academic Press. London, UK. (1986).
  12. Picron, J. F., Herman, M., Van Hoeck, E., Goscinny, S. Analytical strategies for the determination of pyrrolizidine alkaloids in plant based food and examination of the transfer rate during the infusion process. Food Chemistry. 266, 514-523 (2018).
  13. Kowalczyk, E., Kwiatek, K. Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas. Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).
  14. EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). Risks for human health related to the presence of pyrrolizidine alkaloids in honey, tea, herbal infusions and food supplements. EFSA Journal. 15 (7), 04908 (2017).
  15. Han, H., et al. Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk. Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).
  16. Nowak, M., et al. Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities. Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).
  17. Selmar, D., et al. Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations. Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).
  18. Izcara, S., et al. Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs. Food Chemistry. 380, 132189 (2022).
  19. Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples. Foods. 9 (9), 1319 (2020).
  20. Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis). South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).
  21. Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).
  22. Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea. Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).
  23. Han, H. L., et al. Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds. Food control. 132, 108518 (2022).
  24. Bodi, D., et al. Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey. Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).
  25. European Union Commission. Commission Regulation (EU) 2020/2040 of 11 December 2020 amending Regulation (EC) No 1881/2006 as regards maximum levels of pyrrolizidine alkaloids in certain foodstuffs. Official Journal of the European Union. 14 (12), 1-4 (2020).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 187 מקור זיהום גן התה פירוליזידין אלקלואידים סופג
מקור ומסלול של זיהום אלקלואיד Pyrrolizidine בדגימות תה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiao, W., Shen, T., Wang, L., Zhu,… More

Jiao, W., Shen, T., Wang, L., Zhu, L., Li, Q. X., Wang, C., Chen, H., Hua, R., Wu, X. Source and Route of Pyrrolizidine Alkaloid Contamination in Tea Samples. J. Vis. Exp. (187), e64375, doi:10.3791/64375 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter