Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מודל עכברי של אינטובציה אורוטרכאלית וניתוח איסכמיה ריאה מונשמת

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64383
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1, 3, 1
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco and San Francisco General Hospital, 2Department of Physiology, School of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, 3Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

מודל ניתוחי בעכבר ליצירת פגיעה באיסכמיה של הריאה השמאלית (IR) תוך שמירה על אוורור והימנעות מהיפוקסיה.

Abstract

פגיעה באיסכמיה רפרפוזיה (IR) נובעת לעתים קרובות מתהליכים הכוללים תקופה חולפת של הפסקת זרימת הדם. בריאה, IR מבודד מאפשר את המחקר הניסיוני של תהליך ספציפי זה עם אוורור מתמשך alveolar, ובכך למנוע את התהליכים המזיקים המורכבים של היפוקסיה ו atelectasis. בהקשר הקליני, פגיעה באיסכמיה רפרפוזיה של הריאות (הידועה גם בשם ריאה IRI או LIRI) נגרמת על ידי תהליכים רבים, כולל אך לא מוגבל לתסחיף ריאתי, טראומה דימומית שעברה החייאה והשתלת ריאות. קיימות כיום אפשרויות טיפול יעילות מוגבלות עבור LIRI. כאן, אנו מציגים מודל כירורגי הפיך של IR ריאה הכולל אינטובציה אורוטרכאלית ראשונה ואחריה איסכמיה חד-צדדית של הריאה השמאלית ו- reperfusion עם אוורור alveolar משומר או חילופי גזים. עכברים עוברים כריתת בית חזה שמאלית, שדרכה עורק הריאה השמאלי נחשף, מדומה, מבודד ודחוס באמצעות החלקה הפיכה. לאחר מכן החתך הניתוחי נסגר במהלך התקופה האיסכמית, ובעל החיים מתעורר ומופקר. כאשר העכבר נושם באופן ספונטני, reperfusion נוצר על ידי שחרור החלקה סביב עורק הריאה. מודל הישרדות רלוונטי מבחינה קלינית זה מאפשר הערכה של פגיעה ב-IR של הריאה, שלב הרזולוציה, השפעות במורד הזרם על תפקוד הריאות, כמו גם מודלים של שתי פגיעות המערבות דלקת ריאות ניסיונית. למרות שהוא מאתגר מבחינה טכנית, ניתן לשלוט במודל זה במשך מספר שבועות עד חודשים עם שיעור הישרדות או הצלחה בסופו של דבר של 80%-90%.

Introduction

פגיעה באיסכמיה רפרפוזיה (IR) יכולה להתרחש כאשר זרימת הדם משוחזרת למיטת איברים או רקמות לאחר תקופה מסוימת של הפרעה. בריאה, IR יכול להתרחש בבידוד או בשיתוף עם תהליכים מזיקים אחרים כגון זיהום, היפוקסיה, atelectasis, volutrauma (מנפחי גאות גבוהים במהלך אוורור מכני), barotrauma (שיא גבוה או לחצים מתמשכים במהלך אוורור מכני), או קהה (לא חודר) פגיעה חבלת ריאות 1,2,3 . קיימים מספר פערים בידע שלנו על המנגנונים של LIRI ועל ההשפעה של תהליכים מקבילים (למשל, זיהום) על תוצאות LIRI, וגם אפשרויות הטיפול ב-LIRI מוגבלות. מודל in vivo של LIRI טהור נדרש כדי לזהות את הפתופיזיולוגיה של פגיעה IR ריאה בבידוד ולחקור את תרומתו לכל תהליך מרובה פגיעות שבו פגיעה ריאה היא מרכיב.

ניתן להשתמש במודלים של IR ריאה מורין כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה הספציפית לריאות של תהליכים מרובים, כולל השתלת ריאות3, תסחיף ריאתי4, ופגיעה בריאות בעקבות טראומה דימומית עם החייאה5. מודלים המשמשים כיום כוללים השתלת ריאות כירורגית6, הידוק הילאר7, ex vivo ריאה perfusion8, וריאה מאווררת IR9. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מודל IR ריאה מאוורר של מורין של פגיעה ריאתית סטרילית. ישנם יתרונות רבים לגישה זו (איור 2), כולל העובדה שהיא משרה היפוקסיה מינימלית ואטלקטזיס מינימלי, וזהו מודל ניתוחי הישרדות המאפשר מחקרים ארוכי טווח.

הסיבות לבחור בדגם זה של LIRI על פני דגמים אחרים כגון הידוק הילאר ומודלים של פרפוזיה ex vivo הן כדלקמן: מודל זה ממזער את התרומות הדלקתיות של אטלקטזיס, אוורור מכני והיפוקסיה; הוא משמר אוורור מחזורי; הוא שומר על מערכת חיסונית במחזור הדם in vivo שלמה שיכולה להגיב לפגיעה ב-IR; ולבסוף, כהליך הישרדותי, הוא מאפשר ניתוח ארוך טווח של המנגנונים של יצירת פציעות משניות (מודלים של 2 פגיעות) ופתרון פציעות. באופן כללי, אנו מאמינים שמודל IR ריאות מאוורר זה מספק את הצורה "הטהורה" ביותר של פגיעת IR שניתן לחקור בניסוי.

פרסומים אחרים תיארו את השימוש באינטובציה אורו-טרכאלית של עכברים לביצוע הזרקות IT או התקנות10,11, אך לא כנקודת המוצא לניתוח הישרדות כפי שהוא במודל זה. המיקום של צינור אורוטרכאלי מאפשר ביצוע של ניתוח ריאות על ידי מתן אפשרות לקריסת הריאה הניתוחית. זה גם מאפשר reinflation של הריאה בסוף ההליך, אשר קריטי עבור pneumothorax ועל היכולת של העכבר לחזור אוורור ספונטני בסיום ההליכים. לבסוף, הסרת הצינור האורוטרכאלי המאובטח היא הליך פשוט, שבניגוד לטרכאוטומיה פולשנית, תואם לניתוח הישרדות. זה מאפשר מחקרים ארוכי טווח המתמקדים בהבנת ההתקדמות והפתרון של LIRI והפרעות נלוות, כמו גם יצירת מודלים של פציעות כרוניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים והשלבים המתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו. ניתן להשתמש בכל זן עכבר, אם כי לחלק מהזנים יש תגובה דלקתית IR ריאה חזקה יותר בהשוואה לאחרים12. עכברים שגילם כ-12-15 שבועות (30-40 גרם) או מבוגרים יותר סובלים ושורדים את ניתוח ה-IR הריאה טוב יותר מעכברים צעירים יותר. עכברים זכרים ונקבות כאחד יכולים לשמש לניתוחים אלה.

1. פרוטוקול אינטובציה של עכבר

  1. הרדמה והכנה לאינטובציה
    1. נגב את בטן העכבר עם מקלון אתנול. הרדמת העכבר עם הזרקה intraperitoneal של tribromoethanol (250-400 מ"ג / ק"ג). להעריך את העומק המתאים של הרדמה על ידי חוסר רפלקס נסיגה דוושה. יש להניח משחת סיכה לעיניים עכשיו או מאוחר יותר (שלב 2.1.4).
      הערה: עבור הליך זה, tribromoethanol (ו etomidate כאופציה חלופית) מספק מישור הרדמה יציב מבלי להשפיע על התנאים ההמודינמיים הדרושים לניתוח זה. הרדמה זו משמשת רק פעם אחת כדי למנוע את הסיכון של הידבקויות הצפק. איזופלוראן יכול לשמש גם, אבל אנחנו לא משתמשים בו כאן. המתרגל חופשי להשתמש בכל מתכון הרדמה שהוא רואה לנכון.
    2. הניחו את העכבר המרדים על מעמד אינטובציה או תמיכת פלסטיק במצב שכיבה, התלוי על ידי החותכות העליונות שלו על תפרים 4-0 לולאתיים (משי או אחרים) על פני שני עוגני תמיכה.
    3. כדי לשמור על העכבר משותק במהלך הליך אינטובציה, להדביק באופן רופף את החלק התחתון של החזה (או שתי הגפיים העליונות) על הרציף.
    4. הניחו את האור הגמיש הפיברופטי בעדינות על קנה הנשימה של העכבר, מעט מתחת למיתרי הקול. כוונן את רמת ההארה כך שרק שדה כהה נראה לעין כאשר מסתכלים לתוך הלוע של העכבר למעט אור אדום הנובע מתחת למיתרי הקול, ומדגים את המטרה למיקום הסופי של הצינור האנדוטרכאלי. שים לב שתנועות מיתרי הקול צריכות להיות גלויות בעין בלתי או, במידת הצורך, תחת הגדלה.
  2. הליך אינטובציה
    1. החזיקו את הפינצטה ביד הדומיננטית והשתמשו בהן כדי לאחוז בעדינות ולהוציא את הלשון מחלל הפה.
    2. פתח את הלסת התחתונה באמצעות מלקחיים המוחזקים על ידי היד הלא דומיננטית, ולאחר מכן דחף את המלקחיים לתוך הגרון כדי להרים בעדינות את האפיגלוטיס. בשלב זה, לשחרר את הלשון מן הפינצטה.
    3. חפשו את מיתרי הקול. הם צריכים להיפתח ולהיסגר בהתאם לכל נשימה. מחזיקים את הצינורית עם חוט ההנחיה טעון מראש, מכניסים את קצה החוט דרך מיתרי הקול.
    4. נזהרים מאוד לא להזיז את החוט על ידי החזקת חלק ממנו שנמצא מחוץ לצינורית אלא ממש מעל מיתרי הקול, מושכים את הצינורית, ומשאירים רק את החוט במקום עם הקצה הדיסטלי שלו בתוך קנה הנשימה.
    5. בשלב זה, בצע הדמיה שנייה של מיתרי הקול כדי לאשר כי קצה הדיסטלי של החוט נשאר מועבר דרך מיתרי הקול המוארים אל קנה הנשימה, ואינו נמצא בוושט הלא מואר.
    6. החזק את החוט מחוץ לפה עם המלקחיים המעוקלים ביד שמאל, התייצב על משטח קשה, וקדם בזהירות את קטטר 20G עם כנפי סרט על החוט.
    7. ברגע שהקצה הדיסטלי של החוט יוצא מהקצה האחורי של קטטר 20G או צינור אנדוטרכאלי, החזיקו את הקצה הזה עם המלקחיים המעוקלים וקדמו בצורה חלקה את קטטר ה-20G לתוך קנה הנשימה.
    8. הסר בזהירות את החוט מהקצה הדיסטלי של קטטר 20G עם המלקחיים המעוקלים מבלי לעקור את מיקום הקטטר.
    9. חברו לזמן קצר את הקטטר למכונת ההנשמה לפני שאתם מאבטחים אותו כדי לוודא מיקום נכון לקנה הנשימה ולא לוושט. אשר את מיקום קנה הנשימה על ידי תצפית על תנועות דופן בית החזה הדו-צדדיות התלויות באוורור מכני והיעדר אינפלציה של הבטן.
  3. לאחר אינטובציה
    1. נתק את הקטטר ממכונת ההנשמה. תקן את כנפי הקלטת (המחוברות לקטטר) דרך השפה התחתונה של העכבר באמצעות תפר 4-0 vicryl כדי להדק בחוזקה את הצינור האנדוטרכאלי (ETT) לעכבר במהלך כל ההליכים / המניפולציות הבאים.
      הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בנייר דבק משי או בקלטת אחרת כדי לאבטח את ה- ETT, אולם יש לנקוט בזהירות כדי למנוע פריקה של ה- ETT במהלך תנועת החיה ממזחלת האינטובציה למשטח הניתוח.
    2. הסר בזהירות את העכבר ממזחלת האינטובציה. לחבר לזמן קצר את הקטטר למכונת ההנשמה שנקבעה בנפח גאות 0.2-0.225 מ"ל וקצב נשימה של 120-150 נשימות לדקה כדי לאשר מיקום קנה הנשימה הנכון של צינור האורוטרצ'אל ולאחר מכן להתנתק עם העכבר נושם באופן ספונטני דרך צינור האורוטרצ'אל.
    3. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה מנקודה זו ואילך עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על משכיבה סטרנלית בסוף ההליך.

2. פרוטוקול ניתוח איסכמיה ריאה ורפרפוזיה (IR)

  1. משכך כאבים והכנת האתר הכירורגי
    1. נגבו את בטן העכבר במקלון אתנול והזריקו בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג) באופן תוך-צפקי.
    2. לגלח את השיער מעל אזור בית החזה השמאלי עד עצם השכמה השמאלית. הסר שיער מגולח עודף באמצעות ספוגיות אלכוהול.
      הערה: ניתן לבצע שלבים 2.1.1 ו- 2.1.2 גם לפני אינטובציה אם יש חשש להתנתקות מה- ETT כאשר הוא מאובטח בנייר דבק משי.
    3. הניחו את העכבר על משטח חימום במצב רוחבי שמאלי או 3/4 מסתובב וחברו את צינור קנה הנשימה על מכונת ההנשמה עם נפח גאות של 0.2-0.225 מ"ל (~ 8 מ"ג / ק"ג) וקצב נשימה של 120-150 נשימות לדקה. אין להשתמש בתוספת חמצן לצורך הליך זה.
    4. יש למרוח חומר סיכה לעיניים עם צמר גפן סטרילי. סובבו את העכבר ל-3/4 צד שמאל למעלה ושיתקו את כל ארבעת הגפיים ואת הזנב בעזרת סרט מעבדה.
    5. יש לחטא את אזור העור המגולח והפרווה שמסביבו באמצעות פובידון-יוד ולהמתין לייבוש התמיסה. לאחר מכן מכסים את שדה הניתוח בווילון סטרילי או בסרט פלסטיק שקוף ויוצרים פתח מלבני בווילון או בסרט הפלסטיק לשדה הניתוח.
  2. הליך כירורגי
    1. אשר את הרמה המתאימה של הרדמה (המסופקת על ידי הממשל של tribromoethanol ו buprenorphine כפי שתואר קודם לכן) על ידי בדיקת התגובה צביטה הבוהן.
    2. באמצעות זוג מספריים חדים וזוג מלקחיים גדולים יותר (מלקחיים בדוגמה צרה או דומה), בצע חתך עור רוחבי באורך 2 ס"מ מתחת לזווית הנחותה של עצם השכמה בבית החזה הצדדי השמאלי. השתמשו במספריים ובזוג מלקחיים עדינים יותר (מלקחיים עדינים במיוחד או דומים) כדי לחתוך לשכבת השרירים ולנתח עד לצלעות.
    3. זהה את החלל האינטרקוסטלי השני והחזק את הצלע השנייה עם המלקחיים העדינים הנוספים. משיכת הצלע כלפי מעלה, השתמש בלהב אזמל סטרילי #11 או #12 (מעוקל) (אין צורך בידית) כדי להיכנס לחלל הצדר על ידי הפרדה וחיתוך על פני השרירים הבין-קוסטלייםשל החלל השני-3. שקול להשהות את האוורור כדי להפחית את הפגיעה בריאה השמאלית.
    4. הכנס שלושה retractors מעוקרים. השתמש בצפלד הקטן ביותר/הצר ביותר לאורך כיוון הצלעות, במחזיר בגודל בינוני שמאלה לאורך הצלעהשנייה , ובמשענת הגדולה ביותר מימין לאורך פני הצלעהשלישית .
    5. פתח את החזה עם נסיגה איטית ומתקדמת באמצעות מיתרי retractor אלסטי. חשוף וזהה את עורק הריאה השמאלי (PA) על ידי הזזת קצה הריאה השמאלית בעזרת צמר גפן סטרילי.
    6. השתמש במיקרו מלקחיים, מלקחיים דקים במיוחד ביד ימין ו- PA או מלקחיים מתרחבים ביד שמאל, כדי לחשוף בעדינות וליצור את השדה שבו ניתן לראות את הרשות השמאלית ואת הברונכוס.
    7. באמצעות מלקחיים של PA, הרימו את הרשות השמאלית ומשכו בעדינות אך בחוזקה כלפי מעלה וצפלאד כדי לדמיין את הברונכוס השקוף למטה. הגדל את ההגדלה במיקרוסקופ הדיסקציה (ראה רשימת ציוד לפרטים נוספים) בנקודה זו למקסימום (2x).
      הערה: יש לעקר את כל הציוד לפני השימוש. בנוסף, כדי לשמור על סטריליות, רק קצות כלי הניתוח צריכים להיכנס לשדה הניתוח הסטרילי.
    8. תוך כדי התרחקות הרשות מהברונכוס, מעבירים בזהירות את המלקחיים האולטרה-דקים הסגורים דרך החלל שבין הרשות השמאלית לברונכוס. לאחר מכן, השתמש במלקחיים אלה כדי להחזיק ולמשוך 7-0 או 8-0 תפר פרולן דרך החלל שבין עורק הריאה השמאלי (מעל) לברונכוס (להלן).
    9. הקיפו את הרש"פ השמאלית על ידי קשירת תלוש כדי ליצור חסימה ברשות. הפרעה בזרימת הדם ניתנת להדמיה בקלות תחת המיקרוסקופ. זה מסמן את תחילת התקופה האיסכמית.
    10. החצנת הקצה החופשי של הקשר דרך נקודת כניסה שונה בבית החזה השמאלי הקדמי באמצעות מחט 24G-28G ואבטחת קצה התפר באמצעות פיסת נייר דבק קטנה לזיהוי קל יותר בהמשך.
    11. יש לנפח מחדש את הריאה כדי להוציא כמה שיותר אוויר מחלל בית החזה באמצעות שסתום/צינורות PEEP במאוורר המכרסמים. לאחר מכן, סגרו את הצלעות עם שני תפרים מניילון 4-0 מופרעים.
    12. סגור את השריר ואת השכבה התת עורית עם תפר ניילון פועל 4-0. לאחר מכן יש למרוח שתיים או שלוש טיפות של בופיווקאין מקומי (0.5%) על החתך. השתמשו בתפר ניילון 4-0 כדי לסגור את שכבת העור עם תפר רץ.
  3. טיפול לאחר הניתוח
    1. כאשר האוורור הספונטני התחדש, נתק את הצינור האנדוטרכאלי ממכונת ההנשמה והוציא את העכבר.
    2. הניחו את העכבר על משטח החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך ההתאוששות המוקדמת שלאחר ההרדמה.
    3. בזהירות לפקח על העכבר תוך התאוששות מהרדמה כללית. משוך את החלקה המוחצנת בעדינות בסוף התקופה האיסכמית (30 דקות או שעה).
    4. הזיזו את העכבר ממשטח החימום לכלוב לאחר שהפגין סימני התאוששות: ימין עצמי ו/או תנועה.
    5. לאחר תקופת reperfusion (1 שעה או 3 שעות), להרדים את החיה ולאסוף דם על ידי נקב לב ורקמת ריאות לניתוח נוסף. במשך שעה אחת reperfusion, לאסוף פלזמה עבור ELISA, רקמה עבור RNA, וניתוח חלבונים; עבור 3 שעות reperfusion, בנוסף לאסוף רקמות עבור היסטולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

דלקת שנוצרת כתוצאה מפגיעה חד-צדדית באיסכמיה סטרילית של הריאות הסטריליות (IR): לאחר שעה אחת של איסכמיה, ראינו רמות גבוהות יותר של ציטוקינים בסרום ובתוך רקמת הריאה הן על ידי ELISA והן על ידי qRT-PCR שהגיעו לשיא של שעה לאחר רפרפוזיה וחזרו במהירות לנקודת ההתחלה תוך 12-24 שעות לאחר רפרפוזיה13. עבור דגימות שנאספו ב-3 שעות לאחר רפרפוזיה, צפינו בחדירת נויטרופילים אינטנסיבית לתוך רקמת הריאה השמאלית וציינו שעוצמת הדלקת הייתה תלויה בזן של העכבר שבו נעשה שימוש (איור 1). יש לציין כי הדלקת שנוצרת בהיעדר תהליך זיהומי משותף או לאחר מכן נפתרת בהדרגה והריאות חוזרות לארכיטקטורת הריאות הרגילה שלהן (על ידי היסטופתולוגיה) עם אפרוציטוזה או יציאה של נויטרופילים מהריאות הפצועות תוך 12-24 שעות לאחר רפרפוזיה13. יש לציין כי צפינו בדלקת קלה אך ניתנת לזיהוי, שהייתה ברובה נויטרופילית ונצפתה גם בריאה הימנית הלא ניתוחית, שאנו משערים שהיא נובעת מפגיעה בהיפרפרפוזיה14.

איסוף דגימות רקמה עבור מודל IR ריאה זה אינו שונה מזה של מודלים אחרים של IR ריאות: ניתן לאסוף דם להכנת פלזמה באמצעות ניקור לב או קנולציה IVC; ניתן לקצור רקמת ריאה להכנת חלבון או RNA ולאחר מכן לניתוח נוסף על ידי כתם מערבי, ELISA או qPCR.

Figure 1
איור 1: היסטולוגיה של מקטעי ריאות בעכברים מסוג בר משני זנים שונים. (A) עכברי C3H ו-(B) C57BL/6. שני זני העכברים קיבלו איסכמיה של שעה ו-3 שעות, והרקמה מוצגת בהגדלה של פי 10. ההגדלה של 40x מוצגת בכניסה. חדירה נויטרופילית נצפתה בשני הזנים, כאשר זן C3H הראה רמות גבוהות יותר באופן ניכר של דלקת בהשוואה ל-C57BL/6 כפי שדווח קודםלכן 12. סרגל קנה המידה הוא 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: השוואה בין יתרונות (טקסט כחול) וחסרונות (טקסט אדום) של שלושת המודלים הנפוצים ביותר של פגיעת IR ריאה ניסיונית בעכבר (LIRI). השוואה זו מדגישה את הבחירה ב-IR ריאה מאוורר (המתואר בכתב יד זה) כמודל האידיאלי לחקר IR ריאה טהור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כתב יד זה מפרט את השלבים הכרוכים בביצוע מודל IR הריאה המאווררת שפותח על ידי Dodd-o et al.9. מודל זה סייע לזהות מסלולים מולקולריים המעורבים ביצירה ובפתרון של דלקת מ-IR ריאה בבידוד 14,15,16,17, IR ריאה בשילוב עם זיהום קיים 18, ו-IR ריאה ביחס לציר המעיים-ריאה ותרומת מיקרוביום המעי13,18,19 . למרות שמבחינה טכנית הוא מאתגר יותר, המודל הנוכחי מאפשר להעריך את IR הריאה ללא ההשפעות המורכבות של אינפלציית ריאות מחזורית מופרעת והיפוקסיה. זה גם ממזער את תקופת החשיפה להנשמה מכנית, בניגוד למודל ex vivo perfusion, שבעצמו יכול להוביל לפגיעה בריאות20.

מגבלות השיטה: בעוד שקנה הנשימה של העכבר מחודד מספיק כדי שלחץ פקיעה חיובי בקצה (PEEP) מאפשר הרחבה של הריאות ומספק התאמה נוחה ל- ETT, מכניקת ריאות ומדידות לולאת נפח זרימה עשויות שלא להיות אפשריות עם גרסה זו של אינטובציה אורוטרכאלית הפיכה. מדידות פיזיולוגיות ריאה אלה עשויות לדרוש טרכאוטומיה, אשר, בניגוד לשיטה זו, אינה עולה בקנה אחד עם ניתוח ריאות הישרדותי. אינטובציה אורו-טרכאלית הפיכה נסבלת היטב על ידי עכברים, ואפילו בהיעדר משותקים יש מעט מאוד אסינכרוניזציה של מונשמת עכברים בתנאי שהאוורור הדק (MV = נפח גאות x קצב נשימה) גבוה מספיק כדי למנוע את הדחף הטבעי של CO2 על ידי השתלטות הנשימה (כלומר, ממש מעבר לסף האפני).

ישנם מספר שיקולים הקשורים לחלק איסכמיה-reperfusion (IR) של הליך זה. ראשית, יש לבצע את הליך ה- IR עם כמה שפחות טראומה פיזית לריאה. מומלץ להשהות את האוורור המכני ולאפשר לעכבר לנשום באופן ספונטני בעת הכניסה לחלל בית החזה. אוורור הלחץ השלילי, יחד עם אחיזת הצלע השנייה או השלישית על ידי המנתח ומשיכתה הרחק מהריאה תוך כניסה זהירה לחזה עם להב אזמל #11, יפחיתו את הסיכוי לפגיעה בריאה עם האזמל. לחלופין, מצאנו כי שימוש בלהב אזמל מעוקל #12, הממוקם כך שהעקומה פונה כלפי מעלה, מאפשר כניסה זהירה יותר לחלל בית החזה, מה שעשוי להפחית את הפגיעה במשטח הריאות השמאלי התחתון. בנוסף, החיבור בין הרשות השמאלית לברונכוס פחות בטוח קרוב להילום, מה שהופך את המעבר של המלקחיים האולטרה-דקים בין שני מבנים אלה לקל יותר כאן.

השלב הקריטי הבא הוא בידוד הרשות השמאלית מהברונכוס למטה כדי להקיף את הרשות בעניבת תפר. זה חיוני כי צעד זה להתבצע בזהירות כדי למנוע טראומה לשיא הריאה. אנו ממליצים להיכנס לכלוב החזה ככל האפשר כדי למזער את כמות הריאה השמאלית שיש לעקור או לסגת כדי לגשת לרשות הפלסטינית ולברונכוס. כל חלק של הריאה שסובל מטראומה קהה חייב להיות מחוץ להערכה עבור פגיעה IR מבודדת. לעתים קרובות, השיא של הריאה השמאלית נכרת בעת איסוף הריאות לניתוח סופי של פגיעה סטרילית בריאה IR. פגיעה של שיא הריאה ניתן לדמיין במהלך הניתוח בשל נוכחות של puncta של דימום או שינוי צבע דמי.

בין הרש"פ לברונכוס למטה קיימת שכבת רקמת חיבור שיש לפרוץ כדי להקיף את העורק בעניבת התפר. ללמוד כמה מתח מותר בזמן אחיזה ומשיכה של הרשות השמאלית כלפי מעלה (כלומר, לכיוון כלוב החזה והרחק מהברונכוס), באמצעות כלי לא משונן ולא מזיק האוחז מלקחיים עדינים שטוחים ביד שמאל, הוא צעד ראשון חשוב לשלוט בו. הרשות השמאלית יכולה לסבול כמות מפתיעה של מתח ומתיחה כשהיא נמשכת כלפי מעלה. אנו מוצאים את זה מועיל להגדיל את ההגדלה של שדה הראייה למקסימום ולהתאים את המיקוד כך שניתן יהיה לדמיין את החלל הפוטנציאלי (קו לבן של רקמת חיבור הנצמדת את הרשות הפלסטינית לברונכוס) בצורה ברורה וחדה יחד עם המלקחיים האולטרה-דקים (המוחזקים ביד ימין). כדי שהשדה יישאר בפוקוס, חשוב לייצב את יד שמאל על משטח הניתוח תוך משיכת הרשות השמאלית כלפי מעלה והרחק מהברונכוס. לאחר מכן ניתן להעביר את המלקחיים האולטרה-דקים בחלל שבין שני המבנים. הקצוות הסגורים אמורים לעבור בקלות ללא התנגדות אמיתית, וברגע שרואים אותם בצד השני של הרשות השמאלית, ניתן לפתוח את הקצוות בעדינות כדי ליצור מקום נוסף למעבר חומר התפר. זה קריטי כי זה להתבצע באמצעות מלקחיים אולטרה דק לחלוטין undamageed, אשר ניתן לקבוע במהירות על ידי משיכת ספוגית אלכוהול סטרילית דרך הקצוות הסגורים כדי לבחון אם הקצוות לקרוע את החומר. ניתן לזהות את קצוות הנזק גם על ידי פתיחה וסגירה של המלקחיים תחת הגדלה מקסימלית של המיקרוסקופ הכירורגי.

קל לזהות נזק המתרחש לרשות השמאלית או לברונכוס הראשי השמאלי תוך ניסיון להפריד ביניהם. פגיעה ברשות השמאלית גורמת להצפה של שדה הראייה בדם ועלולה לגרום לניתוח שאינו ניתן להצלה אם הנזק יוצר חור בתוך הרשות עצמה. יש לציין כי ישנם כלי דם מיקרוסקופיים על פני השטח על הרשות הפלסטינית שעלולים להיפצע במהלך תנועת המלקחיים האולטרה-דקים, וניתן לנהל אותם על ידי הנחת צמר גפן סטרילי יבש מעל השדה כדי לספוג את הדם שמופיע. אם הדימום נפסק, ניתן לחדש את ההליך. נזק לסמפונות הראשיים השמאליים הוא תמיד מצב שאינו ניתן להצלה מכיוון שאין דרך פשוטה או מהירה לתקן נזק לדרכי הנשימה.

את השלב של הפרדת הרשות הפלסטינית מהברונכוס הבסיסי ניתן לתרגל בתחילה על עכבר מת ללא לחץ הזמן או הסחת הדעת של פעילות הלב והתנועה שהיא גורמת. בנוסף, קיפאון הדם ברשות הפלסטינית השמאלית מאפשר לדמיין אותו ביתר קלות (כלי דם עבה ושמנמן), ועדיין מסוגל להיקלט על ידי מלקחיים שטוחים שאינם נפגעים. היכולת לזהות נזק ברונכוס שמאל עדיין אפשרי, שכן אוורור של הריאה השמאלית ניתן להשתמש כדי להעריך את נוכחותו של נתיב אוויר מוליך שלם לריאה השמאלית. מצב תרגול זה יכול לשמש גם כדי לשכלל את היצירה של slipknot.

יש משך סופי של חסימה, שמעבר לו reperfusion ספונטנית לאחר הסרת slipknot אינו מובטח. במחקרי פיילוט, זה קורה איפשהו בין 6 ל 10 שעות. מעבר לכך, reperfusion מתרחשת פחות מיד לאחר הסרת slipknot. ככל שהתקופה האיסכמית מתארכת, reperfusion דורש מניפולציה של הרשות לאחר הסרת slipknot על מנת לבסס מחדש את זרימת הדם.

תצפיות אלה התקבלו מחמישה מחברים שותפים של מאמר זה המייצגים את החוויה הקולקטיבית שלהם בלמידה, שכלול, פתרון בעיות ושיפור הליך זה במהלך התקופה שבה הם ערכו את המודל הכירורגי הזה בעכבר וסוכמו בנקודות שלהלן:

בממוצע, זה לקח 1-3 חודשים כדי לשלוט בהליך כירורגי זה. פרוצדורליסט אחד העריך כי נדרשים כ-50 ניתוחים כדי להשלים עם ההליכים השונים.

אחוזי ההצלחה בתחילת ביצוע ההליך היו 20%-40%. לאחר ביצוע ההליך באופן קבוע ועם היכרות, שיעור ההצלחה עלה ל 80%-90%.

החלק הקשה ביותר של הניתוח היה פה אחד העברת המלקחיים האולטרה-דקים בין הרשות השמאלית לברונכוס השמאלי, ולאחר מכן לכידתו של מונופילמנט התפר עם המלקחיים והעברתו בין שני המבנים.

טעויות במהלך המעבר של monofilament בין הרשות הפלסטינית לבין ברונכוס mainstem שמאל יכול להוביל לניתוח בלתי ניתן להצלה עם דימום קטסטרופלי של הרשות השמאלית או פגיעה בלתי הפיכה ברונכוס הראשי השמאלי.

מספר הניתוחים המרבי שניתן לבצע ביום אחד הוערך ב-10 (בערך 35-45 דקות לניתוח), בעוד שהמספר האידיאלי לנוחות פרוצדורליסטית והצלחה כירורגית היה חמישה או שישה.

טיפים והצעות שונות אחרות כוללים:

הימנעו מעודף קפאין לפני תחילת יום הניתוח כדי לשמור על תנוחת ידיים יציבה.

הגדל את ההגדלה על המיקרוסקופ למקסימום במהלך החלק של ההליך כאשר התפר מועבר בין הרשות השמאלית לבין ברונכוס הראשי השמאלי.

השתמש בתנועות עדינות והדרגתיות/מצטברות בעת התקדמות מלקחיים של דומונט כדי ליצור רווח בין הרשות השמאלית לבין הברונכוס הראשי השמאלי.

ייצוב הידיים על משטח הניתוח בעת ביצוע כל השלבים הקריטיים.

יש לוודא שקצב הנשימה במכונת ההנשמה גבוה מספיק כדי למנוע נשימות ספונטניות, במיוחד במהלך החלקים המרכזיים/קריטיים של ההליך (תפר העובר בין הרשות השמאלית לברונכוס הראשי השמאלי).

סביבה שקטה וללא הפרעה לביצוע הניתוחים חיונית כדי להישאר ממוקדים ולא מעוותים.

איור 2 משווה את המודל הזה למודלים חלופיים של פגיעה ב-IR בריאה. מודל זה של איסכמיה ריאה מאווררת מציע את היתרונות של מזעור אטלקטזיס, היפוקסיה ואוורור מכני. חשוב לציין שכניתוח הישרדות, הוא תואם מודלים של פציעה שנייה (למשל, מודלים ניסיוניים של דלקת ריאות) וניתוח של פתרון הפציעה.

לסיכום, תיארנו ניתוח הישרדותי הכולל יצירת פגיעה באיסכמיה של הריאה, שאנו מאמינים שיכולה לספק תובנה רבת ערך לגבי המנגנונים והמסלולים התאיים המעורבים בפגיעה טהורה ב-IR בריאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי תמיכה מחלקתית ממחלקת ההרדמה והטיפול הפריאופרטיבי, אוניברסיטת קליפורניה סן פרנסיסקו ובית החולים הכללי של סן פרנסיסקו, כמו גם על ידי פרס NIH R01 (ל- AP): 1R01HL146753.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Fiber Optic Light Pipe Cole-Parmer UX-41720-65 Fiberoptic light pipe
Fiber Optic Light Source AmScope SKU: CL-HL250-B Light source for fiberoptic lights
Germinator 500 Cell Point Scientific, Inc. No.5-1450 Bead Sterilizer
Heating Pad AIMS 14-370-223 Alternative option
Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) WAHL home products SKU 09854-600B To remove mouse hair on surgical site
Microscope Nikon SMZ-10 Other newer options available at the company website
MiniVent Ventilator Havard Apparatus Model 845 Mouse ventilator
Ultrasonic Cleaner Cole-Parmer UX-08895-05 Clean tools that been used in operation
Warming Pad Kent Scientific RT-0501 To keep mouse warm while recovering from surgery
Weighing Scale Cole-Parmer UX-11003-41 Weighing scale
Surgery Tools
4-0 Silk Suture Ethicon 683G For closing muscle layer
7-0 Prolene Suture Ethicon Industry EP8734H Using for making a slip knot of left pulmonary artery
Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) Aspen Surgical 372611 For entering thoracic cavity (option 1)
Bard-Parker (12) Scalpel Aspen Surgical 372612 For entering thoracic cavity (option 2)
Extra Fine Graefe Forceps FST 11150-10 Muscle/rib holding forceps
Magnetic Fixator Retraction System FST 1. Base Plate (Nos. 18200-03)
2. Fixators (Nos. 18200-01)
3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12)
4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08)		 Small Animal Retraction System
Monoject Standard Hypodermic Needle COVIDIEN 05-561-20 For medication delivery IP
Narrow Pattern Forceps FST 11002-12 Skin level forceps
Needle holder/Needle driver FST 12565-14 for holding needles
Needles BD 305110 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too)
PA/Vessel Dilating forceps FST 00125-11 To hold PA; non-damaging gripper
Scissors FST 14060-09 Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery
Ultra Fine Dumont micro forceps FST 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus
Reagents
0.25% Bupivacaine Hospira, Inc. 0409-1159-02 Topical analgesic used during surgical wound closure
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) Sigma-Aldrich T48402-25G Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg.
Buprenorphine Covetrus North America 59122 Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg
Eye Lubricant BAUSCH+LOMB Soothe Lubricant Eye Ointment Relieves dryness of the eye
Povidone-Iodine 10% Solution MEDLINE INDUSTRIES INC SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery
Materials
Alcohol Swab BD brand  BD 326895 for sterilzing area of injection and surgery
Plastic film KIRKLAND Stretch-Tite premium Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective)
Rodent Surgical Drapes Stoelting 50981 Sterile field or drape for surgical field
Sterile Cotton Tipped Application Pwi-Wnaps 703033 used for applying eye lubricant
Top Sponges Dukal Corporaton Reorder # 5360 Stopping bleeding from skin/muscle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, H., Kreisel, D., Goldstein, D. R. Processes of sterile inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 2857-2863 (2013).
  2. Fiser, S. M., et al. Lung transplant reperfusion injury involves pulmonary macrophages and circulating leukocytes in a biphasic response. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 121 (6), 1069-1075 (2001).
  3. Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), 93121 (2017).
  4. Miao, R., Liu, J., Wang, J. Overview of mouse pulmonary embolism models. Drug Discovery Today: Disease Models. 7 (3-4), 77-82 (2010).
  5. Mira, J. C., et al. Mouse injury model of polytrauma and shock. Methods in Molecular Biology. 1717, 1-15 (2018).
  6. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
  7. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: Tricks of the trade. The Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
  8. Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
  9. Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Faraday, N., Pearse, D. B. Effect of ischemia and reperfusion without airway occlusion on vascular barrier function in the in vivo mouse lung. Journal of Applied Physiology. 95 (5), 1971-1978 (2003).
  10. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
  11. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
  12. Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Welsh-Servinsky, L. E., Tankersley, C. G., Pearse, D. B. Strain-specific differences in sensitivity to ischemia-reperfusion lung injury in mice. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1590-1595 (2006).
  13. Prakash, A., et al. Lung ischemia reperfusion (IR) is a sterile inflammatory process influenced by commensal microbiota in mice. Shock. 44 (3), 272-279 (2015).
  14. Prakash, A., et al. Alveolar macrophages and toll-like receptor 4 mediate ventilated lung ischemia reperfusion injury in mice. Anesthesiology. 117 (4), 822-835 (2012).
  15. Dodd-o, J. M., et al. The role of natriuretic peptide receptor-A signaling in unilateral lung ischemia-reperfusion injury in the intact mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (4), 714-723 (2008).
  16. Prakash, A., Kianian, F., Tian, X., Maruyama, D. Ferroptosis mediates inflammation in lung ischemia-reperfusion (IR) sterile injury in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201, (2020).
  17. Tian, X., et al. NLRP3 inflammasome mediates dormant neutrophil recruitment following sterile lung injury and protects against subsequent bacterial pneumonia in mice. Frontiers in Immunology. 8, 1337 (2017).
  18. Tian, X., Hellman, J., Prakash, A. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Frontiers in Microbiology. 10, 159 (2019).
  19. Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids' immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 65-78 (2021).
  20. Dodd-o, J. M., et al. Interactive effects of mechanical ventilation and kidney health on lung function in an in vivo mouse model. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (1), 3-11 (2009).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 187
מודל עכברי של אינטובציה אורוטרכאלית וניתוח איסכמיה ריאה מונשמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, W. I., Maruyama, D., Kianian,… More

Liao, W. I., Maruyama, D., Kianian, F., Tat, C., Tian, X., Hellman, J., Dodd-o, J. M., Prakash, A. A Mouse Model of Orotracheal Intubation and Ventilated Lung Ischemia Reperfusion Surgery. J. Vis. Exp. (187), e64383, doi:10.3791/64383 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter