Summary
En mus kirurgisk modell for å skape venstre lunge iskemi reperfusjon (IR) skade samtidig opprettholde ventilasjon og unngå hypoksi.
Abstract
Iskemi reperfusjon (IR) skade ofte resultater fra prosesser som involverer en forbigående periode med avbrutt blodstrøm. I lungen tillater isolert IR den eksperimentelle studien av denne spesifikke prosessen med fortsatt alveolær ventilasjon, og unngår dermed de sammensatte skadelige prosessene av hypoksi og atelektase. I klinisk sammenheng er lunge iskemi reperfusjonsskade (også kjent som lunge IRI eller LIRI) forårsaket av en rekke prosesser, inkludert men ikke begrenset til lungeemboli, gjenopplivet hemorragisk traume og lungetransplantasjon. Det er for tiden begrensede effektive behandlingsalternativer for LIRI. Her presenterer vi en reversibel kirurgisk modell for lunge-IR som involverer første orotrakeale intubasjon etterfulgt av ensidig venstre lungeiskemi og reperfusjon med bevart alveolær ventilasjon eller gassutveksling. Mus gjennomgår en venstre torakotomi, gjennom hvilken venstre lungearterie blir utsatt, visualisert, isolert og komprimert ved hjelp av en reversibel slipknot. Det kirurgiske snittet blir deretter lukket i den iskemiske perioden, og dyret blir vekket og ekstubert. Når musen puster spontant, etableres reperfusjon ved å frigjøre slipknuten rundt lungearterien. Denne klinisk relevante overlevelsesmodellen tillater evaluering av lunge-IR-skade, oppløsningsfasen, nedstrøms effekter på lungefunksjonen, samt to-hit-modeller som involverer eksperimentell lungebetennelse. Selv om det er teknisk utfordrende, kan denne modellen mestres i løpet av noen uker til måneder med en eventuell overlevelses- eller suksessrate på 80% -90%.
Introduction
Iskemi reperfusjon (IR) skade kan oppstå når blodstrømmen er gjenopprettet til et organ eller vev seng etter en periode med avbrudd. I lungen kan IR forekomme isolert eller i forbindelse med andre skadelige prosesser som infeksjon, hypoksi, atelektase, volutrauma (fra høye tidevannsvolumer under mekanisk ventilasjon), barotrauma (høyt topp eller vedvarende trykk under mekanisk ventilasjon) eller stump (ikke-penetrerende) lungekontusjonsskade 1,2,3 . Det er fortsatt flere hull i vår kunnskap om LIRIs mekanismer og virkningen av samtidige prosesser (f.eks. infeksjon) på LIRI-utfall, og også behandlingsalternativene for LIRI er begrensede. En in vivo-modell av ren LIRI er nødvendig for å identifisere patofysiologien til lunge-IR-skade isolert og for å studere dens bidrag til enhver multi-hit-prosess der lungeskade er en komponent.
Murine lunge IR-modeller kan brukes til å studere lungespesifikk patofysiologi av flere prosesser, inkludert lungetransplantasjon3, lungeemboli4 og lungeskade etter hemorragisk traume med gjenopplivning5. For tiden brukte modeller inkluderer kirurgisk lungetransplantasjon6, hilar klemming7, ex vivo lungeperfusjon8 og ventilert lunge IR9. Her gir vi en detaljert protokoll for en murine ventilert lunge IR-modell av steril lungeskade. Det er flere fordeler med denne tilnærmingen (figur 2), inkludert at den induserer minimal hypoksi og minimal atelektase, og det er en overlevelsesoperasjonsmodell som muliggjør langsiktige studier.
Grunner til å velge denne modellen av LIRI over andre modeller som hilar klemming og ex vivo perfusjonsmodeller er følgende: denne modellen minimerer de inflammatoriske bidragene til atelektase, mekanisk ventilasjon og hypoksi; det bevarer syklisk ventilasjon; det opprettholder et intakt in vivo sirkulasjonsimmunsystem som kan reagere på IR-skaden; og til slutt, som en overlevelsesprosedyre, tillater den langsiktig analyse av mekanismene for sekundær skadegenerering (2-hit-modeller) og skadeoppløsning. Samlet sett tror vi at denne ventilerte lunge-IR-modellen gir den "reneste" formen for IR-skade som kan studeres eksperimentelt.
Andre publikasjoner har beskrevet bruk av orotrakeal intubasjon av mus for å utføre IT-injeksjoner eller installasjoner10,11, men ikke som utgangspunkt for en overlevelseskirurgi som det er i denne modellen. Plasseringen av et orotrakealt rør tillater utførelsen av lungekirurgi ved å tillate sammenbrudd av den operative lungen. Det tillater også reinflasjon av lungen ved slutten av prosedyren, noe som er kritisk for pneumothorax og for musens evne til å gå tilbake til spontan ventilasjon ved avslutningen av prosedyrene. Endelig er fjerning av det sikrede orotrakealrøret en enkel prosedyre som, i motsetning til en invasiv trakeotomi, er kompatibel med en overlevelsesoperasjon. Dette muliggjør langsiktige forskningsstudier fokusert på å forstå progresjon og oppløsning av LIRI og tilhørende lidelser, samt opprettelse av kroniske skademodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer og trinn beskrevet nedenfor ble godkjent av den institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteen (IACUC) ved University of California San Francisco. Enhver musestamme kan brukes, selv om noen stammer har en mer robust lunge IR inflammatorisk respons sammenlignet med andre12. Mus som er omtrent 12-15 uker gamle (30-40 g) eller eldre tolererer og overlever lunge-IR-operasjonen bedre enn yngre mus. Både mannlige og kvinnelige mus kan brukes til disse operasjonene.
1. Musens intubasjonsprotokoll
- Anestesi og forberedelse til intubasjon
- Tørk musens mage med en etanolpinne. Bedøv musen med en intraperitoneal injeksjon av tribromoetanol (250-400 mg / kg). Vurder riktig anestesidybde ved mangel på pedaluttaksrefleks. Plasser øyesmørende salve nå eller senere (trinn 2.1.4).
MERK: For denne prosedyren gir tribromoetanol (og etomidat som et alternativt alternativ) et stabilt bedøvelsesplan uten å påvirke de hemodynamiske forholdene som kreves for denne operasjonen. Denne bedøvelsen brukes bare én gang for å unngå risiko for peritoneale adhesjoner. Isofluran kan også brukes, men vi bruker det ikke her. Utøveren står fritt til å bruke hvilken bedøvelsesoppskrift de måtte ønske. - Plasser den bedøvede musen på et intubasjonsstativ eller plaststøtte i en liggende stilling, suspendert av de øvre snittene på løkkede 4-0 suturer (silke eller annet) over to støtteankre.
- For å holde musen immobilisert under intubasjonsprosedyren, tape løst den nedre delen av brystet (eller begge øvre lemmer) til plattformen.
- Plasser det fiberoptiske fleksible lyset forsiktig på musens luftrør, litt under stemmebåndene. Juster belysningsnivået slik at bare et mørkt felt er synlig når du ser inn i musens oropharynx bortsett fra rødt lys som kommer fra under stemmebåndene, og demonstrer målet for eventuell plassering av endotrakealrøret. Legg merke til at stemmebåndsbevegelser skal være synlige med det blotte øye eller, om nødvendig, under forstørrelse.
- Tørk musens mage med en etanolpinne. Bedøv musen med en intraperitoneal injeksjon av tribromoetanol (250-400 mg / kg). Vurder riktig anestesidybde ved mangel på pedaluttaksrefleks. Plasser øyesmørende salve nå eller senere (trinn 2.1.4).
- Intubasjon prosedyre
- Hold pinsetten med den dominerende hånden og bruk dem til å forsiktig gripe og trekke tungen ut av munnhulen.
- Åpne underkjeven ved hjelp av tang som holdes av den ikke-dominerende hånden, og skyv deretter tangen inn i strupehodet for å løfte epiglottis forsiktig. På dette tidspunktet, slipp tungen fra pinsetten.
- Se etter stemmebåndene. De skal åpne og lukke i henhold til hvert pust. Hold kanylen med føringstråden forhåndslastet, og sett spissen av ledningen gjennom stemmebåndene.
- Vær veldig forsiktig så du ikke beveger ledningen ved å holde en del av den som er utenfor kanylen, men like over stemmebåndene, trekk ut kanylen, og la bare ledningen være på plass med den distale enden i luftrøret.
- På dette tidspunktet, utfør en andre visualisering av stemmebåndene for å bekrefte at tråddistale spissen forblir passert gjennom de opplyste stemmebåndene og inn i luftrøret, og er ikke i den uopplyste spiserøret.
- Hold ledningen utenfor munnen med de buede tangene i venstre hånd, stabilisert mot en hard overflate, og avanser forsiktig 20G-kateteret med tapevinger over ledningen.
- Når den distale enden av ledningen kommer ut fra baksiden av 20G-kateteret eller endotrakealrøret, hold den enden med de buede tangene og jevnt forskudd 20G-kateteret inn i luftrøret.
- Fjern ledningen forsiktig fra den distale enden av 20G-kateteret med de buede tangene uten å løsne plasseringen av kateteret.
- Koble kateteret kort til ventilatoren før du fester det for å bekrefte riktig plassering i luftrøret og ikke spiserøret. Bekreft trakeal plassering ved observasjon av mekaniske ventilasjonsavhengige bilaterale brystveggbevegelser og fravær av oppblåsing i magen.
- Post-intubasjon
- Koble kateteret fra ventilatoren. Fest båndvingene (festet til kateteret) gjennom musens underleppe ved hjelp av en 4-0 vicryl sutur for å sikre endotrakealrøret (ETT) til musen under alle påfølgende prosedyrer / manipulasjoner.
MERK: Alternativt kan silketape eller annen tape brukes til å sikre ETT, men det må utvises forsiktighet for å unngå at ETT løsner under bevegelse av dyret fra intubasjonssleden til operasjonsoverflaten. - Fjern musen forsiktig fra intubasjonssleden. Koble kateteret kort til ventilatorsettet med et tidevannsvolum 0,2-0,225 ml og en respirasjonsfrekvens på 120-150 pust per minutt for å bekrefte riktig trakealplassering av orotrakealrøret og koble deretter fra med musen som puster spontant gjennom orotrakealrøret.
- Ikke la dyret være uten tilsyn fra dette tidspunktet og fremover før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency ved slutten av prosedyren.
- Koble kateteret fra ventilatoren. Fest båndvingene (festet til kateteret) gjennom musens underleppe ved hjelp av en 4-0 vicryl sutur for å sikre endotrakealrøret (ETT) til musen under alle påfølgende prosedyrer / manipulasjoner.
2. Lunge iskemi og reperfusjon (IR) kirurgi protokoll
- Analgesi og forberedelse av operasjonsstedet
- Tørk av musemagen med en etanolpinne og injiser buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg) intraperitonealt.
- Barber håret over venstre thoraxområde opp til venstre scapula. Fjern overflødig barbert hår ved hjelp av alkoholpinner.
MERK: Trinn 2.1.1 og 2.1.2 kan også utføres før intubasjon hvis det er bekymring for fjerning av ETT når det er sikret med silketape. - Plasser musen på en varmepute i venstre lateral eller 3/4 dreid stilling og koble trakealrøret på ventilatoren med et tidevannsvolum på 0,2-0,225 ml (~ 8 mg / kg) og en respirasjonsfrekvens på 120-150 pust per minutt. Ikke bruk ekstra oksygen for denne prosedyren.
- Påfør øyesmøremiddel med en steril bomullspinne. Vri musen til 3/4 venstre side opp og immobiliser alle fire lemmer og halen med laboratorietape.
- Desinfiser det barberte hudområdet og omkringliggende pels med povidon-jod og vent til løsningen tørker. Dekk deretter det kirurgiske feltet med en steril drapering eller klar plastfilm og lag en rektangulær åpning i draperingen eller plastfilmen for det kirurgiske feltet.
- Kirurgisk prosedyre
- Bekreft riktig anestesinivå (gitt ved administrering av tribromoetanol og buprenorfin som beskrevet tidligere) ved å teste respons på tåklemme.
- Bruk en skarp saks og et par større tang (smalt mønster tang eller lignende), lage et 2 cm tverrgående hudinnsnitt under den nedre vinkelen på scapulaen i venstre laterale thorax. Bruk saksen og et finere par tang (ekstra fin graefe tang eller lignende) for å kutte i muskellaget og dissekere ned til ribbeina.
- Identifiser det andre interkostale rommet og hold den andre ribben med de ekstra fine tangene. Trekk ribben oppover, bruk et sterilt # 11 eller # 12 (buet) skalpellblad (ingen håndtak nødvendig) for å komme inn i pleuralrommet ved å skille og kutte over 2nd-3 rd mellomroms interkostale muskler. Vurder å pause ventilasjonen for å redusere skade på venstre lungetopp.
- Sett inn tre steriliserte retractors. Bruk den minste / smaleste retractor cephalad langs ribbens orientering, den mellomstore retractoren til venstre langs 2. ribbe, og den største retractoren til høyre langs overflaten av 3. ribben.
- Åpne brystet med langsom og progressiv tilbaketrekning ved hjelp av de elastiske tilbaketrekningssnorene. Utsett og identifiser venstre lungearterie (PA) ved å flytte venstre lungetopp bort med en steril bomullsspisspinne.
- Bruk mikrotang, ultrafine tang i høyre hånd og PA eller fartøy dilaterende tang i venstre hånd, for å forsiktig eksponere og skape feltet der venstre PA og bronkus begge er synlige.
- Bruk PA-tangen, plukk opp venstre PA og trekk forsiktig, men bestemt oppover og cephalad for å visualisere den gjennomsiktige bronkusen nedenfor. Øk forstørrelsen på disseksjonsmikroskopet (se utstyrslisten for flere detaljer) på dette tidspunktet til maksimum (2x).
MERK: Steriliser alt utstyr før bruk. I tillegg, for å opprettholde sterilitet, bør bare spissene av kirurgiske instrumenter komme inn i det sterile kirurgiske feltet. - Mens du trekker PA bort fra bronkusen, må du forsiktig passere de lukkede ultrafine tangene gjennom rommet mellom venstre PA og bronkus. Bruk deretter disse tangene til å holde og trekke en 7-0 eller 8-0 prolene sutur gjennom mellomrommet mellom venstre lungearterie (over) og bronkus (under).
- Omringe venstre PA ved å binde en slipknot for å skape en okklusjon i PA. Blodstrømsavbrudd visualiseres lett under mikroskopet. Dette markerer initieringen av den iskemiske perioden.
- Eksternaliser den frie enden av knuten gjennom et annet inngangspunkt i fremre venstre thorax ved hjelp av en 24G-28G-nål og fest enden av suturen med et lite stykke tape for enklere identifisering senere.
- Gjenoppblås lungen for å utvise så mye luft ut av brysthulen som mulig ved hjelp av en PEEP-ventil / slange på gnagerventilatoren. Lukk deretter brystkassen med to avbrutte 4-0 nylonsuturer.
- Lukk muskel- og subkutant lag med en løpende 4-0 nylonsutur. Påfør deretter to eller tre dråper aktuell bupivakain (0,5%) til snittet. Bruk en 4-0 nylon sutur for å lukke hudlaget med en løpende sutur.
- Postoperativ behandling
- Når spontan ventilasjon er gjenopptatt, kobler du endotrakealrøret fra ventilatoren og ekstuberer musen.
- Plasser musen på varmeputen for å opprettholde kroppstemperaturen under tidlig gjenoppretting etter anestesi.
- Overvåk musen nøye mens du gjenoppretter fra generell anestesi. Trekk den eksternaliserte slipknot forsiktig på slutten av den iskemiske perioden (30 min eller 1 time).
- Flytt musen fra varmeputen til et bur når den har vist tegn på utvinning: selvretting og / eller bevegelse.
- Etter reperfusjonsperioden (1 time eller 3 timer), avlive dyret og samle blod ved hjertepunksjon og lungevev for videre analyse. For 1 time reperfusjon, samle plasma for ELISA, vev for RNA og proteinanalyse; For 3 timers reperfusjon, samle i tillegg vev for histologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inflammasjon generert av ensidig ventilert steril lungeiskemireperfusjon (IR)-skade: Etter 1 time iskemi observerte vi økte nivåer av cytokiner i serum og i lungevevvet av både ELISA og qRT-PCR som nådde en topp på 1 time etter reperfusjon og raskt returnerte til baseline innen 12-24 timer etter reperfusjon13. For prøver tatt 3 timer etter reperfusjon observerte vi intens nøytrofil infiltrasjon i venstre lungevev og bemerket at intensiteten av inflammasjonen var avhengig av musestammen som ble brukt (figur 1). Spesielt løser betennelsen som genereres i fravær av en sameksisterende eller påfølgende smittsom prosess gradvis, og lungene vender tilbake til sin normale lungearkitektur (ved histopatologi) med efferocytose eller utgang av nøytrofiler fra de skadede lungene innen 12-24 timer etter reperfusjon13. Merk at vi observerte mild, men påvisbar betennelse, som i stor grad var nøytrofil og ble observert også i den ikke-operative høyre lungen, som vi antar skyldes hyperperfusjonsskade14.
Vevsprøveinnsamling for denne lunge-IR-modellen er ikke annerledes enn for andre lunge-IR-modeller: blod kan samles inn for plasmapreparasjon via hjertepunksjon eller IVC-kanylering; lungevev kan høstes for protein- eller RNA-forberedelse og deretter for videre analyse av western blot, ELISA eller qPCR.
Figur 1: Histologi av lungesnitt hos villtypemus av to forskjellige stammer. (A) C3H og (B) C57BL/6 mus. Begge musestammene fikk 1 h iskemi og 3 timers reperfusjon, og vevet er vist ved 10x forstørrelse. 40x forstørrelsen vises i innfellingen. Neutrofil infiltrasjon ble observert i begge stammene, med C3H-stammen som viste markant større nivåer av betennelse sammenlignet med C57BL / 6 som rapportert tidligere12. Skalaen er 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammenligning av fordeler (blå tekst) og ulemper (rød tekst) ved de tre mest brukte museeksperimentelle lunge-IR-skademodellene (LIRI). Denne sammenligningen fremhever valget av ventilert lunge-IR (beskrevet i dette manuskriptet) som den ideelle modellen for å studere ren lunge-IR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver trinnene som er involvert i å utføre den ventilerte lunge-IR-modellen utviklet av Dodd-o et al.9. Denne modellen har bidratt til å identifisere molekylære veier involvert i generering og oppløsning av betennelse fra lunge-IR isolert 14,15,16,17, lunge-IR i kombinasjon med sameksisterende infeksjon 18, og lunge-IR i forhold til tarm-lungeaksen og bidraget fra tarmmikrobiomet13,18,19 . Selv om det er teknisk mer utfordrende, tillater den nåværende modellen evaluering av lunge-IR uten de sammensatte effektene av avbrutt syklisk lungeinflasjon og hypoksi. Det minimerer også perioden med mekanisk ventilasjonseksponering, i motsetning til ex vivo perfusjonsmodellen, som i seg selv kan føre til lungeskade20.
Begrensninger av metoden: Mens musens luftrør er avsmalnet nok til at positivt endeekspiratorisk trykk (PEEP) tillater utvidelse av lungene og gir en tettsittende passform for ETT, kan det hende at lungemekanikk og strømningsvolumsløyfemålinger ikke er mulig med denne versjonen av reversibel orotrakeal intubasjon. Disse lungefysiologiske målingene kan kreve trakeotomi, som i motsetning til denne metoden er uforenlig med en overlevelseslungeoperasjon. Reversibel orotrakeal intubasjon tolereres godt av mus, og selv i fravær av paralytika er det svært lite mus-ventilator asynkroni forutsatt at minuttventilasjonen (MV = tidevannsvolum x respirasjonsfrekvens) er tilstrekkelig høy nok til å forhindre den naturlige CO2-drevne stasjonen ved at pusten tar over (dvs. like utenfor den apnetiske terskelen).
Det er flere hensyn knyttet til iskemi-reperfusjon (IR) del av denne prosedyren. For det første bør IR-prosedyren utføres med så lite fysisk traumer til lungen som mulig. Vi anbefaler at du setter den mekaniske ventilasjonen på pause og lar musen puste spontant når den kommer inn i brysthulen. Den negative trykkventilasjonen, sammen med kirurgens grep om den andre eller tredje ribben og trekker den bort fra lungen mens den forsiktig kommer inn i brystet med et # 11 skalpellblad, vil redusere sjansen for å skade lungen med skalpellen. Alternativt har vi funnet ut at bruk av et # 12 buet skalpellblad, plassert slik at kurven vender oppover, gir mulighet for mer forsiktig inngang i brysthulen, noe som potensielt reduserer skade på den underliggende venstre lungetoppoverflaten. I tillegg er forbindelsen mellom venstre PA og bronkus mindre sikker nærmere hilum, noe som gjør passasje av de ultrafine tangene mellom disse to strukturene lettere her.
Det neste kritiske trinnet er å isolere venstre PA fra bronkusen nedenfor for å omringe PA med et suturbånd. Det er viktig at dette trinnet oppnås nøye for å unngå traumer til lungespissen. Vi anbefaler å gå inn i thoraxburet så cephalad som mulig for å minimere mengden av venstre lunge som må forskyves eller trekkes tilbake for å få tilgang til PA og bronkus. Enhver del av lungen som opprettholder stump traume må utelukkes fra evaluering for isolert IR-skade. Ofte blir toppen av venstre lunge skåret bort når du samler lungene for endelig analyse av steril lunge IR-skade. Skader på lungens topp kan visualiseres under operasjonen på grunn av tilstedeværelsen av puncta av blødning eller blodig misfarging.
Mellom PA og bronkusen nedenfor eksisterer et bindevevslag som må brytes for å omringe arterien med suturbåndet. Å lære hvor mye spenning som er tillatt mens du griper og trekker venstre PA oppover (dvs. mot thoraxburet og bort fra bronkusen), ved hjelp av det ikke-serrerte, ikke-skadelige fartøyet som griper flate fine tang i venstre hånd, er et viktig første skritt å mestre. Den venstre PA tåler overraskende mye spenning og strekk når den trekkes oppover. Vi synes det er nyttig å øke forstørrelsen av synsfeltet til maksimum og justere fokus slik at det potensielle rommet (en hvit bindevevslinje som fester PA til bronkusen) tydelig og skarpt kan visualiseres sammen med de ultrafine tangene (holdt i høyre hånd). For at feltet skal forbli i fokus, er det viktig å stabilisere venstre hånd på den kirurgiske overflaten mens du trekker venstre PA opp og bort fra bronkusen. De ultrafine tangene kan deretter føres i rommet mellom de to strukturene. De lukkede spissene skal passere lett uten noen reell motstand, og når de er sett på den andre siden av venstre PA, kan spissene åpnes forsiktig for ytterligere å skape plass til passasjen av suturmaterialet. Det er viktig at dette utføres ved hjelp av helt uskadet ultrafine tang, som raskt kan bestemmes ved å trekke en steril alkoholpinne gjennom de lukkede spissene for å observere om spissene rives av materialet. Skadespisser kan også identifiseres ved å åpne og lukke tangen under maksimal forstørrelse av det kirurgiske mikroskopet.
Det er lett å oppdage skader som oppstår på enten venstre PA eller venstre hovedbronkus mens du prøver å skille dem. Skader på venstre PA resulterer i oversvømmelse av synsfeltet med blod og kan resultere i en ikke-bergbar kirurgi hvis skaden skaper et hull i selve PA. Spesielt er det overflatemikroskopiske blodkar på PA som kan bli skadet under ultrafine tangbevegelsen, og kan potensielt styres ved å plassere en tørr steril bomullspinne over feltet for å absorbere blodet som vises. Hvis blødningen stopper, kan prosedyren gjenopptas. Skader på venstre hovedbronkus er alltid en ikke-bergbar situasjon siden det ikke er noen enkel eller rask måte å reparere luftveisskader på.
Trinnet med å skille PA fra den underliggende bronkusen kan i utgangspunktet praktiseres på en død mus uten tidspress eller distraksjon av hjerteaktivitet og bevegelsen det forårsaker. I tillegg gjør stasis av blod i venstre PA at det lettere kan visualiseres (tykt og klumpete fartøy), og likevel i stand til å bli plukket opp av de ikke-skadende flate PA-tangene. Evnen til å oppdage skade i venstre bronkus er fortsatt mulig, siden ventilasjonen av venstre lunge kan brukes til å vurdere tilstedeværelsen av en intakt ledende luftvei til venstre lunge. Denne praksissituasjonen kan også brukes til å perfeksjonere opprettelsen av slipknot.
Det er en endelig varighet av okklusjon, utover hvilken spontan reperfusjon etter fjerning av slipknot ikke er garantert. I pilotstudier skjer dette et sted mellom 6 og 10 timer. Utover dette skjer reperfusjon mindre umiddelbart etter fjerning av slipknot. Etter hvert som den iskemiske perioden strekker seg, krever reperfusjon manipulering av PA etter fjerning av slipknot for å gjenopprette blodstrømmen.
Disse følgende observasjonene er hentet fra fem medforfattere av dette papiret som representerer deres kollektive erfaring med å lære, perfeksjonere, feilsøke og forbedre denne prosedyren i løpet av perioden da de gjennomførte denne musekirurgiske modellen og har blitt oppsummert i punktene nedenfor:
I gjennomsnitt tok det 1-3 måneder å mestre denne kirurgiske prosedyren. En proceduralist anslo at det tar omtrent 50 operasjoner å bli lett med de forskjellige prosedyrene.
Suksessrate ved starten av å utføre prosedyren var 20% -40%. Etter å ha utført prosedyren regelmessig og med kjennskap, økte suksessraten til 80% -90%.
Den vanskeligste delen av operasjonen var enstemmig passering av de ultrafine tangene mellom venstre PA og venstre bronkus, og deretter den påfølgende fangsten av suturmonofilamentet med tangen og dens passering mellom de to strukturene.
Feil under passering av monofilamentet mellom PA og venstre hovedstamme bronkus kan føre til en unsalvageable kirurgi med katastrofal blødning av venstre PA eller irreversibel skade på venstre hovedbronkus.
Maksimalt antall operasjoner gjennomførbart i 1 enkelt dag ble estimert til å være 10 (ca. 35-45 min / kirurgi), mens det ideelle antallet for proceduralist komfort og kirurgisk suksess var fem eller seks.
Andre diverse tips og forslag inkluderer:
Unngå overflødig koffein før du starter operasjonsdagen for å opprettholde jevn håndstilling.
Øk forstørrelsen på mikroskopet til maksimum under delen av prosedyren når suturen føres mellom venstre PA og venstre hovedbronkus.
Bruk milde og gradvise / inkrementelle bevegelser når du fremmer Dumont-tangen for å skape mellomrom mellom venstre PA og venstre hovedbronkus.
Stabiliser hendene på den kirurgiske overflaten når du utfører alle kritiske trinn.
Sørg for at respirasjonsfrekvensen på ventilatoren er høy nok til å unngå spontane åndedrag, spesielt under de viktigste / kritiske delene av prosedyren (sutur som går mellom venstre PA og venstre hovedbronkus).
Et rolig og uforstyrret miljø for å utføre operasjonene er viktig for å holde fokus og uhindret.
Figur 2 sammenligner denne modellen med alternative modeller for lunge-IR-skade. Denne modellen av ventilert lunge iskemi reperfusjon gir fordelene ved å minimere atelektase, hypoksi og mekanisk ventilasjon. Det er viktig at den som overlevelseskirurgi er kompatibel med andre skademodeller (f.eks. Eksperimentelle lungebetennelsesmodeller) og analyse av skadeoppløsningen.
Avslutningsvis har vi beskrevet en overlevelseskirurgi med etablering av lungeiskemi reperfusjonsskade som vi mener kan gi verdifull innsikt i mekanismene og celleveiene som er involvert i ren IR-skade i lungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av avdelingsstøtte fra Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco og San Francisco General Hospital, samt av en NIH R01-pris (til AP): 1R01HL146753.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fiber Optic Light Pipe | Cole-Parmer | UX-41720-65 | Fiberoptic light pipe |
| Fiber Optic Light Source | AmScope | SKU: CL-HL250-B | Light source for fiberoptic lights |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific, Inc. | No.5-1450 | Bead Sterilizer |
| Heating Pad | AIMS | 14-370-223 | Alternative option |
| Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) | WAHL home products | SKU 09854-600B | To remove mouse hair on surgical site |
| Microscope | Nikon | SMZ-10 | Other newer options available at the company website |
| MiniVent Ventilator | Havard Apparatus | Model 845 | Mouse ventilator |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | Clean tools that been used in operation |
| Warming Pad | Kent Scientific | RT-0501 | To keep mouse warm while recovering from surgery |
| Weighing Scale | Cole-Parmer | UX-11003-41 | Weighing scale |
| Surgery Tools | |||
| 4-0 Silk Suture | Ethicon | 683G | For closing muscle layer |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Industry | EP8734H | Using for making a slip knot of left pulmonary artery |
| Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) | Aspen Surgical | 372611 | For entering thoracic cavity (option 1) |
| Bard-Parker (12) Scalpel | Aspen Surgical | 372612 | For entering thoracic cavity (option 2) |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | Muscle/rib holding forceps |
| Magnetic Fixator Retraction System | FST | 1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08) |
Small Animal Retraction System |
| Monoject Standard Hypodermic Needle | COVIDIEN | 05-561-20 | For medication delivery IP |
| Narrow Pattern Forceps | FST | 11002-12 | Skin level forceps |
| Needle holder/Needle driver | FST | 12565-14 | for holding needles |
| Needles | BD | 305110 | 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too) |
| PA/Vessel Dilating forceps | FST | 00125-11 | To hold PA; non-damaging gripper |
| Scissors | FST | 14060-09 | Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery |
| Ultra Fine Dumont micro forceps | FST | 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) | For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus |
| Reagents | |||
| 0.25% Bupivacaine | Hospira, Inc. | 0409-1159-02 | Topical analgesic used during surgical wound closure |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg. |
| Buprenorphine | Covetrus North America | 59122 | Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg |
| Eye Lubricant | BAUSCH+LOMB | Soothe Lubricant Eye Ointment | Relieves dryness of the eye |
| Povidone-Iodine 10% Solution | MEDLINE INDUSTRIES INC | SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) | Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery |
| Materials | |||
| Alcohol Swab | BD brand | BD 326895 | for sterilzing area of injection and surgery |
| Plastic film | KIRKLAND | Stretch-Tite premium | Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective) |
| Rodent Surgical Drapes | Stoelting | 50981 | Sterile field or drape for surgical field |
| Sterile Cotton Tipped Application | Pwi-Wnaps | 703033 | used for applying eye lubricant |
| Top Sponges | Dukal Corporaton | Reorder # 5360 | Stopping bleeding from skin/muscle |
References
- Shen, H., Kreisel, D., Goldstein, D. R. Processes of sterile inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 2857-2863 (2013).
- Fiser, S. M., et al. Lung transplant reperfusion injury involves pulmonary macrophages and circulating leukocytes in a biphasic response. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 121 (6), 1069-1075 (2001).
- Lama, V. N., et al. Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop. JCI Insight. 2 (9), 93121 (2017).
- Miao, R., Liu, J., Wang, J. Overview of mouse pulmonary embolism models. Drug Discovery Today: Disease Models. 7 (3-4), 77-82 (2010).
- Mira, J. C., et al. Mouse injury model of polytrauma and shock. Methods in Molecular Biology. 1717, 1-15 (2018).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: Tricks of the trade. The Journal of Surgical Research. 194 (2), 659-666 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Faraday, N., Pearse, D. B. Effect of ischemia and reperfusion without airway occlusion on vascular barrier function in the in vivo mouse lung. Journal of Applied Physiology. 95 (5), 1971-1978 (2003).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).
- Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702 (2011).
- Dodd-o, J. M., Hristopoulos, M. L., Welsh-Servinsky, L. E., Tankersley, C. G., Pearse, D. B. Strain-specific differences in sensitivity to ischemia-reperfusion lung injury in mice. Journal of Applied Physiology. 100 (5), 1590-1595 (2006).
- Prakash, A., et al. Lung ischemia reperfusion (IR) is a sterile inflammatory process influenced by commensal microbiota in mice. Shock. 44 (3), 272-279 (2015).
- Prakash, A., et al. Alveolar macrophages and toll-like receptor 4 mediate ventilated lung ischemia reperfusion injury in mice. Anesthesiology. 117 (4), 822-835 (2012).
- Dodd-o, J. M., et al. The role of natriuretic peptide receptor-A signaling in unilateral lung ischemia-reperfusion injury in the intact mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (4), 714-723 (2008).
- Prakash, A., Kianian, F., Tian, X., Maruyama, D. Ferroptosis mediates inflammation in lung ischemia-reperfusion (IR) sterile injury in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201, (2020).
- Tian, X., et al. NLRP3 inflammasome mediates dormant neutrophil recruitment following sterile lung injury and protects against subsequent bacterial pneumonia in mice. Frontiers in Immunology. 8, 1337 (2017).
- Tian, X., Hellman, J., Prakash, A. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Frontiers in Microbiology. 10, 159 (2019).
- Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids' immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 65-78 (2021).
- Dodd-o, J. M., et al. Interactive effects of mechanical ventilation and kidney health on lung function in an in vivo mouse model. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 296 (1), 3-11 (2009).
