Summary
वेंटिलेशन बनाए रखने और हाइपोक्सिया से बचने के दौरान बाएं फेफड़े के इस्किमिया रीपरफ्यूजन (आईआर) की चोट बनाने के लिए एक माउस सर्जिकल मॉडल।
Abstract
इस्केमिया रीपरफ्यूजन (आईआर) की चोट अक्सर उन प्रक्रियाओं से उत्पन्न होती है जिनमें बाधित रक्त प्रवाह की क्षणिक अवधि शामिल होती है। फेफड़ों में, पृथक आईआर निरंतर वायुकोशीय वेंटिलेशन के साथ इस विशिष्ट प्रक्रिया के प्रयोगात्मक अध्ययन की अनुमति देता है, जिससे हाइपोक्सिया और एटलेक्टेसिस की हानिकारक प्रक्रियाओं से बचा जा सकता है। नैदानिक संदर्भ में, फेफड़े की इस्किमिया रीपरफ्यूजन चोट (जिसे फेफड़े के आईआरआई या एलआईआरआई के रूप में भी जाना जाता है) कई प्रक्रियाओं के कारण होती है, जिसमें फुफ्फुसीय अन्त: शल्यता, पुनर्जीवित रक्तस्रावी आघात और फेफड़ों के प्रत्यारोपण तक सीमित नहीं है। वर्तमान में एलआईआरआई के लिए सीमित प्रभावी उपचार विकल्प हैं। यहां, हम फेफड़ों के आईआर का एक प्रतिवर्ती सर्जिकल मॉडल प्रस्तुत करते हैं जिसमें पहले ओरोट्राचेल इंटुबैशन शामिल है, जिसके बाद एकतरफा बाएं फेफड़े की इस्किमिया और संरक्षित वायुकोशीय वेंटिलेशन या गैस विनिमय के साथ पुनरावृत्ति होती है। चूहे एक बाएं थोराकोटॉमी से गुजरते हैं, जिसके माध्यम से बाईं फुफ्फुसीय धमनी को प्रतिवर्ती स्लिपनॉट का उपयोग करके उजागर, विज़ुअलाइज़, पृथक और संपीड़ित किया जाता है। सर्जिकल चीरा तब इस्केमिक अवधि के दौरान बंद हो जाता है, और जानवर को जागृत और निकाला जाता है। माउस के अनायास सांस लेने के साथ, फुफ्फुसीय धमनी के चारों ओर स्लिपनॉट जारी करके रीपरफ्यूजन स्थापित किया जाता है। यह नैदानिक रूप से प्रासंगिक उत्तरजीविता मॉडल फेफड़ों की आईआर चोट, संकल्प चरण, फेफड़ों के कार्य पर डाउनस्ट्रीम प्रभाव, साथ ही प्रयोगात्मक निमोनिया से जुड़े दो-हिट मॉडल के मूल्यांकन की अनुमति देता है। तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण होने के बावजूद, इस मॉडल को कुछ हफ्तों से महीनों के दौरान 80% -90% की अंतिम उत्तरजीविता या सफलता दर के साथ महारत हासिल की जा सकती है।
Introduction
इस्केमिया रीपरफ्यूजन (आईआर) की चोट तब हो सकती है जब कुछ समय की रुकावट के बाद रक्त प्रवाह को एक अंग या ऊतक बिस्तर पर बहाल किया जाता है। फेफड़ों में, आईआर अलगाव में या अन्य हानिकारक प्रक्रियाओं जैसे संक्रमण, हाइपोक्सिया, एटेलेक्टेसिस, वोलुट्रॉमा (यांत्रिक वेंटिलेशन के दौरान उच्च ज्वारीय मात्रा से), बैरोट्रॉमा (यांत्रिक वेंटिलेशन के दौरान उच्च शिखर या निरंतर दबाव), या कुंद (गैर-मर्मज्ञ) फेफड़ों की चोट 1,2,3 के साथ हो सकता है। . एलआईआरआई के तंत्र और एलआईआरआई परिणामों पर समवर्ती प्रक्रियाओं (जैसे, संक्रमण) के प्रभाव के बारे में हमारे ज्ञान में कई अंतराल हैं, और एलआईआरआई के लिए उपचार के विकल्प भी सीमित हैं। शुद्ध एलआईआरआई के एक इनविवो मॉडल को अलगाव में फेफड़ों की आईआर चोट के पैथोफिज़ियोलॉजी की पहचान करने और किसी भी बहु-हिट प्रक्रिया में इसके योगदान का अध्ययन करने की आवश्यकता होती है जिसमें फेफड़ों की चोट एक घटक है।
मुराइन फेफड़े आईआर मॉडल का उपयोग कई प्रक्रियाओं के फेफड़ों-विशिष्ट पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें फेफड़े के प्रत्यारोपण3, फुफ्फुसीय अन्त: शल्यता4, और पुनर्जीवन के साथ रक्तस्रावी आघात के बाद फेफड़ों की चोटशामिल है। वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले मॉडलमें सर्जिकल फेफड़े प्रत्यारोपण 6, हिलर क्लैंपिंग7, एक्स विवो फेफड़े छिड़काव8 और हवादार फेफड़े आईआर9 शामिल हैं। यहां, हम बाँझ फेफड़ों की चोट के मुराइन वेंटिलेटेड फेफड़े के आईआर मॉडल के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस दृष्टिकोण के कई लाभ हैं (चित्रा 2), जिसमें यह न्यूनतम हाइपोक्सिया और न्यूनतम एटेलेक्टेसिस को प्रेरित करता है, और यह एक उत्तरजीविता सर्जरी मॉडल है जो दीर्घकालिक अध्ययन की अनुमति देता है।
हिलर क्लैंपिंग और एक्स विवो छिड़काव मॉडल जैसे अन्य मॉडलों पर एलआईआरआई के इस मॉडल को चुनने के कारण निम्नलिखित हैं: यह मॉडल एटेलेक्टेसिस, मैकेनिकल वेंटिलेशन और हाइपोक्सिया के भड़काऊ योगदान को कम करता है; यह चक्रीय वेंटिलेशन को संरक्षित करता है; यह विवो परिसंचरण प्रतिरक्षा प्रणाली में एक बरकरार रखता है जो आईआर चोट का जवाब दे सकता है; और अंत में, एक जीवित रहने की प्रक्रिया के रूप में, यह द्वितीयक चोट उत्पादन (2-हिट मॉडल) और चोट समाधान के तंत्र के दीर्घकालिक विश्लेषण की अनुमति देता है। कुल मिलाकर, हमारा मानना है कि यह हवादार फेफड़े आईआर मॉडल आईआर चोट का "शुद्धतम" रूप प्रदान करता है जिसे प्रयोगात्मक रूप से अध्ययन किया जा सकता है।
अन्य प्रकाशनों ने आईटी इंजेक्शन या इंस्टॉलेशन10,11 करने के लिए चूहों के ओरोट्राचेल इंटुबैशन के उपयोग का वर्णन किया है, लेकिन जीवित रहने की सर्जरी के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में नहीं जैसा कि इस मॉडल में है। एक ओरोट्राचेल ट्यूब का प्लेसमेंट ऑपरेटिव फेफड़े के पतन की अनुमति देकर फेफड़ों की सर्जरी के प्रदर्शन की अनुमति देता है। यह प्रक्रिया के अंत में फेफड़ों के पुन: मुद्रास्फीति के लिए भी अनुमति देता है, जो न्यूमोथोरैक्स के लिए और प्रक्रियाओं के समापन पर सहज वेंटिलेशन पर लौटने के लिए माउस की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, सुरक्षित ओरोट्राचेल ट्यूब को हटाना एक सरल प्रक्रिया है, जो एक आक्रामक ट्रेकोटॉमी के विपरीत, जीवित रहने की सर्जरी के साथ संगत है। यह एलआईआरआई और संबंधित विकारों की प्रगति और समाधान को समझने के साथ-साथ पुरानी चोट मॉडल के निर्माण पर केंद्रित दीर्घकालिक शोध अध्ययनों की अनुमति देता है।
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Protocol
नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं और चरणों को कैलिफोर्निया सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। किसी भी माउस स्ट्रेन का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि कुछ उपभेदों में दूसरों की तुलना में अधिक मजबूत फेफड़े आईआर भड़काऊ प्रतिक्रियाहोती है। चूहे जो लगभग 12-15 सप्ताह (30-40 ग्राम) या उससे अधिक उम्र के हैं, युवा चूहों की तुलना में फेफड़ों की आईआर सर्जरी को बेहतर ढंग से सहन करते हैं और जीवित रहते हैं। इन सर्जरी के लिए नर और मादा दोनों चूहों का उपयोग किया जा सकता है।
1. माउस इंटुबैशन प्रोटोकॉल
- एनेस्थीसिया और इंटुबैशन की तैयारी
- इथेनॉल स्वैब के साथ माउस पेट को पोंछें। ट्राइब्रोमोएथेनॉल (250-400 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। पेडल वापसी रिफ्लेक्स की कमी से संज्ञाहरण की उचित गहराई का आकलन करें। आंख स्नेहन मरहम अभी या बाद में रखें (चरण 2.1.4)।
नोट: इस प्रक्रिया के लिए, ट्राइब्रोमोएथेनॉल (और एक वैकल्पिक विकल्प के रूप में एटोमिडेट) इस सर्जरी के लिए आवश्यक हेमोडायनामिक स्थितियों को प्रभावित किए बिना एक स्थिर एनेस्थेटिक विमान प्रदान करता है। पेरिटोनियल आसंजन के जोखिम से बचने के लिए इस एनेस्थेटिक का उपयोग केवल एक बार किया जाता है। आइसोफ्लुरेन का भी उपयोग किया जा सकता है, लेकिन हम इसे यहां उपयोग नहीं करते हैं। चिकित्सक जो भी एनेस्थेटिक नुस्खा वे फिट देखते हैं उसका उपयोग करने के लिए स्वतंत्र है। - एनेस्थेटाइज्ड माउस को एक इंटुबैशन स्टैंड या प्लास्टिक सपोर्ट पर एक लापरवाह स्थिति में रखें, जो दो समर्थन एंकरों में लूप 4-0 सीवन (रेशम या अन्य) पर इसके ऊपरी छेदक द्वारा निलंबित किया जाता है।
- इंटुबैशन प्रक्रिया के दौरान माउस को स्थिर रखने के लिए, छाती के निचले हिस्से (या दोनों ऊपरी अंगों) को प्लेटफॉर्म पर ढीले ढंग से टेप करें।
- फाइबरऑप्टिक लचीली रोशनी को माउस के श्वासनली पर धीरे से रखें, मुखर डोरियों से थोड़ा नीचे। रोशनी के स्तर को समायोजित करें ताकि माउस ऑरोफैरिंक्स में देखते समय केवल एक अंधेरा क्षेत्र दिखाई दे, सिवाय मुखर डोरियों के नीचे से निकलने वाली लाल रोशनी को छोड़कर, एंडोट्रैकियल ट्यूब के अंतिम प्लेसमेंट के लिए लक्ष्य का प्रदर्शन करें। ध्यान दें कि मुखर कॉर्ड आंदोलनों को नग्न आंखों से या यदि आवश्यक हो, तो आवर्धन के तहत दिखाई देना चाहिए।
- इथेनॉल स्वैब के साथ माउस पेट को पोंछें। ट्राइब्रोमोएथेनॉल (250-400 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें। पेडल वापसी रिफ्लेक्स की कमी से संज्ञाहरण की उचित गहराई का आकलन करें। आंख स्नेहन मरहम अभी या बाद में रखें (चरण 2.1.4)।
- इंटुबैशन प्रक्रिया
- प्रमुख हाथ से चिमटी को पकड़ें और उन्हें धीरे से पकड़ने और जीभ को मौखिक गुहा से बाहर खींचने के लिए उपयोग करें।
- गैर-प्रमुख हाथ द्वारा पकड़े गए बल का उपयोग करके निचले जबड़े को खोलें, और फिर एपिग्लोटिस को धीरे से उठाने के लिए स्वरयंत्र में बल को धक्का दें। इस समय, चिमटी से जीभ छोड़ दें।
- मुखर डोरियों की तलाश करें। उन्हें प्रत्येक सांस के अनुसार खोलना और बंद करना चाहिए। गाइड तार के साथ कैनुला को पकड़ते हुए, मुखर डोरियों के माध्यम से तार की नोक डालें।
- बहुत सावधान रहें कि तार के एक हिस्से को पकड़कर न हिलाएं जो कैनुला के बाहर है, लेकिन मुखर डोरियों के ठीक ऊपर है, कैनुला को वापस ले लें, जिससे श्वासनली के भीतर इसके बाहर के छोर के साथ सिर्फ तार को छोड़ दिया जाए।
- इस बिंदु पर, यह पुष्टि करने के लिए मुखर डोरियों का दूसरा विज़ुअलाइज़ेशन करें कि तार डिस्टल टिप रोशन मुखर डोरियों के माध्यम से और श्वासनली में पारित होती है, और अनलिट अन्नप्रणाली में नहीं है।
- बाएं हाथ में घुमावदार बल के साथ मुंह के बाहर तार को पकड़ें, एक कठोर सतह के खिलाफ स्थिर करें, और तार के ऊपर टेप पंखों के साथ 20 जी कैथेटर को सावधानीपूर्वक आगे बढ़ाएं।
- एक बार जब तार का बाहरी छोर 20 जी कैथेटर या एंडोट्रेकियल ट्यूब के पिछले छोर से निकलता है, तो उस छोर को घुमावदार बल के साथ पकड़ें और आसानी से 20 जी कैथेटर को श्वासनली में आगे बढ़ाएं।
- कैथेटर के प्लेसमेंट को हटाए बिना घुमावदार बल के साथ 20 जी कैथेटर के बाहर के छोर से तार को सावधानीपूर्वक हटा दें।
- श्वासनली में उचित प्लेसमेंट की पुष्टि करने के लिए कैथेटर को वेंटिलेटर से संक्षेप में कनेक्ट करें, न कि अन्नप्रणाली में। यांत्रिक वेंटिलेशन-निर्भर द्विपक्षीय छाती की दीवार आंदोलनों और पेट की मुद्रास्फीति की अनुपस्थिति के अवलोकन द्वारा श्वासनली प्लेसमेंट की पुष्टि करें।
- पोस्ट-इंटुबैशन
- कैथेटर को वेंटिलेटर से डिस्कनेक्ट कर दें। बाद की सभी प्रक्रियाओं /जोड़तोड़ के दौरान माउस में एंडोट्राचेल ट्यूब (ईटीटी) को मजबूती से सुरक्षित करने के लिए 4-0 वाइक्रिल सीवन का उपयोग करके माउस के निचले होंठ के माध्यम से टेप विंग्स (कैथेटर से जुड़े) को ठीक करें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, रेशम टेप या अन्य टेप का उपयोग ईटीटी को सुरक्षित करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि इंटुबैशन स्लेज से सर्जिकल सतह तक जानवर के आंदोलन के दौरान ईटीटी के विघटन से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। - इंटुबैशन स्लेज से माउस को सावधानीपूर्वक हटा दें। संक्षेप में कैथेटर को ज्वारीय मात्रा 0.2-0.225 एमएल पर वेंटिलेटर सेट से जोड़ें और ओरोट्राचेल ट्यूब के सही श्वासनली प्लेसमेंट की पुष्टि करने के लिए प्रति मिनट 120-150 सांस की श्वसन दर और फिर ओरोट्राचेल ट्यूब के माध्यम से सहज रूप से सांस लेने वाले माउस के साथ डिस्कनेक्ट करें।
- इस बिंदु से जानवर को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह प्रक्रिया के अंत में उरोस्थि पुनरावृत्ति बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
- कैथेटर को वेंटिलेटर से डिस्कनेक्ट कर दें। बाद की सभी प्रक्रियाओं /जोड़तोड़ के दौरान माउस में एंडोट्राचेल ट्यूब (ईटीटी) को मजबूती से सुरक्षित करने के लिए 4-0 वाइक्रिल सीवन का उपयोग करके माउस के निचले होंठ के माध्यम से टेप विंग्स (कैथेटर से जुड़े) को ठीक करें।
2. फेफड़े की इस्किमिया और रीपरफ्यूजन (आईआर) सर्जरी प्रोटोकॉल
- एनाल्जेसिया और सर्जिकल साइट की तैयारी
- एक इथेनॉल स्वैब के साथ माउस पेट को पोंछें और ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा) इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें।
- बाएं स्कैपुला तक बाएं वक्ष क्षेत्र पर बालों को शेव करें। अल्कोहल स्वैब का उपयोग करके अतिरिक्त मुंडा बालों को हटा दें।
नोट: चरण 2.1.1 और 2.1.2 को इंटुबैशन से पहले भी किया जा सकता है यदि रेशम टेप के साथ सुरक्षित होने पर ईटीटी के विघटन की चिंता है। - माउस को बाएं पार्श्व या 3/4 मुड़ी हुई स्थिति में वार्मिंग पैड पर रखें और वेंटिलेटर पर श्वासनली ट्यूब को 0.2-0.225 एमएल (~ 8 मिलीग्राम / किग्रा) की ज्वारीय मात्रा और प्रति मिनट 120-150 सांस की श्वसन दर के साथ कनेक्ट करें। इस प्रक्रिया के लिए पूरक ऑक्सीजन का उपयोग न करें।
- बाँझ कपास-टिप स्वैब के साथ आंख स्नेहक लागू करें। माउस को 3/4 बाईं ओर घुमाएं और प्रयोगशाला टेप के साथ सभी चार अंगों और पूंछ को स्थिर करें।
- पोविडोन-आयोडीन के साथ मुंडा त्वचा क्षेत्र और आसपास के फर को कीटाणुरहित करें और समाधान के सूखने की प्रतीक्षा करें। फिर सर्जिकल क्षेत्र को बाँझ ड्रेप या स्पष्ट प्लास्टिक फिल्म के साथ कवर करें और सर्जिकल क्षेत्र के लिए ड्रेप या प्लास्टिक फिल्म में एक आयताकार उद्घाटन बनाएं।
- शल्य चिकित्सा प्रक्रिया
- पैर की अंगुली की प्रतिक्रिया का परीक्षण करके संज्ञाहरण के उचित स्तर की पुष्टि करें (ट्राइब्रोमोएथेनॉल और ब्यूप्रेनोर्फिन के प्रशासन द्वारा प्रदान किया गया है जैसा कि पहले वर्णित है)।
- तेज कैंची की एक जोड़ी और बड़े बलों की एक जोड़ी (संकीर्ण पैटर्न बल या इसी तरह) का उपयोग करके, बाएं पार्श्व वक्ष में स्कैपुला के अवर कोण के नीचे 2 सेमी अनुप्रस्थ त्वचा चीरा बनाएं। मांसपेशियों की परत में काटने और पसलियों को विच्छेदित करने के लिए कैंची और बल की एक बेहतर जोड़ी (अतिरिक्त महीन ग्रेफ फोर्स या इसी तरह) का उपयोग करें।
- दूसरे इंटरकोस्टल स्पेस की पहचान करें और दूसरी पसली को अतिरिक्त महीन बल के साथ पकड़ें। पसली को ऊपर की ओर खींचते हुए, 2nd-3 अंतरिक्ष की इंटरकोस्टल मांसपेशियों को अलग करके और काटकर फुफ्फुस स्थान में प्रवेश करने के लिए एक बाँझ # 11 या # 12 (घुमावदार) स्केलपेल ब्लेड (कोई हैंडल आवश्यक नहीं) का उपयोग करें। बाएं फेफड़े के शीर्ष पर चोट को कम करने के लिए वेंटिलेशन को रोकने पर विचार करें।
- तीन निष्फल रिट्रैक्टर डालें। पसलियों के अभिविन्यास के साथ सबसे छोटे/सबसे संकीर्ण रिट्रैक्टर सेफलाड का उपयोग करें,दूसरी पसली के साथ बाईं ओर मध्यम आकार के रिट्रेक्टर का उपयोग करें,और 3 पसली की सतह के साथ दाईं ओर सबसे बड़े रिट्रैक्टर का उपयोग करें।
- लोचदार रिट्रैक्टर डोरियों का उपयोग करके धीमी और प्रगतिशील वापसी के साथ छाती खोलें। बाँझ कपास-टिप स्वैब के साथ बाएं फेफड़े के शीर्ष को दूर ले जाकर बाएं फुफ्फुसीय धमनी (पीए) को उजागर करें और पहचानें।
- दाएं हाथ में माइक्रो फोर्सप्स, अल्ट्राफाइन फोर्सप्स और बाएं हाथ में पीए या वेसल डायलेटिंग फोर्सप्स का उपयोग करें, धीरे से उजागर करने और उस क्षेत्र को बनाने के लिए जिसमें बाएं पीए और ब्रोन्कस दोनों दिखाई देते हैं।
- पीए फोर्सेस का उपयोग करके, बाएं पीए को उठाएं और नीचे पारदर्शी ब्रोंकस की कल्पना करने के लिए धीरे से लेकिन मजबूती से ऊपर की ओर खींचें। इस बिंदु पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर आवर्धन बढ़ाएं (अधिक जानकारी के लिए उपकरण सूची देखें) अधिकतम (2x)।
नोट: उपयोग से पहले सभी उपकरणों को निष्फल करें। इसके अतिरिक्त, बाँझपन बनाए रखने के लिए, केवल सर्जिकल उपकरणों की युक्तियों को बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र में प्रवेश करना चाहिए। - ब्रोंकस से पीए को दूर करते समय, बाएं पीए और ब्रोन्कस के बीच की जगह के माध्यम से बंद अल्ट्राफाइन फोर्स को सावधानीपूर्वक पारित करें। फिर, 7-0 या 8-0 को पकड़ने और खींचने के लिए इन बलों का उपयोग करें बाईं फुफ्फुसीय धमनी (ऊपर) और ब्रोंकस (नीचे) के बीच की जगह के माध्यम से प्रोलीन सीवन।
- पीए में एक रोड़ा बनाने के लिए स्लिपनॉट बांधकर बाएं पीए को घेर लें। माइक्रोस्कोप के तहत रक्त प्रवाह में रुकावट आसानी से देखी जाती है। यह इस्केमिक अवधि की शुरुआत को चिह्नित करता है।
- 24 जी -28 जी सुई का उपयोग करके पूर्ववर्ती बाएं वक्ष में एक अलग प्रवेश बिंदु के माध्यम से गाँठ के मुक्त छोर को बाहर करें और बाद में आसान पहचान के लिए टेप के एक छोटे टुकड़े के साथ सीवन के अंत को सुरक्षित करें।
- कृंतक वेंटिलेटर पर पीआईपी वाल्व / ट्यूबिंग का उपयोग करके छाती गुहा से जितना संभव हो उतना हवा बाहर निकालने के लिए फेफड़ों को फिर से फुलाएं। फिर, दो बाधित 4-0 नायलॉन सीवन के साथ रिबकेज बंद करें।
- 4-0 नायलॉन सीवन के साथ मांसपेशियों और चमड़े के नीचे की परत को बंद करें। फिर चीरा पर सामयिक बुपिवैकेन (0.5%) की दो या तीन बूंदें लागू करें। चलती सीवन के साथ त्वचा की परत को बंद करने के लिए 4-0 नायलॉन सीवन का उपयोग करें।
- ऑपरेशन के बाद की देखभाल
- जब सहज वेंटिलेशन फिर से शुरू हो जाता है, तो एंडोट्राचेल ट्यूब को वेंटिलेटर से डिस्कनेक्ट करें और माउस को बाहर निकाल दें।
- प्रारंभिक पोस्ट-एनेस्थीसिया रिकवरी के दौरान शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए वार्मिंग पैड पर माउस रखें।
- सामान्य संज्ञाहरण से उबरते समय माउस की सावधानीपूर्वक निगरानी करें। इस्केमिक अवधि (30 मिनट या 1 घंटे) के अंत में बाहरी स्लिपनॉट को धीरे से खींचें।
- माउस को वार्मिंग पैड से पिंजरे में ले जाएं जब यह वसूली के लक्षण प्रदर्शित करता है: आत्म-अधिकार और / या आंदोलन।
- रीपरफ्यूजन (1 घंटे या 3 घंटे) की अवधि के बाद, जानवर को इच्छामृत्यु करें और आगे के विश्लेषण के लिए कार्डियक पंचर और फेफड़ों के ऊतकों द्वारा रक्त एकत्र करें। 1 घंटे के लिए, एलिसा के लिए प्लाज्मा, आरएनए के लिए ऊतक और प्रोटीन विश्लेषण एकत्र करें; 3 घंटे के लिए, ऊतक विज्ञान के लिए ऊतक भी एकत्र करें।
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Representative Results
एकतरफा हवादार बाँझ फेफड़े की इस्किमिया (आईआर) चोट से उत्पन्न सूजन: इस्किमिया के 1 घंटे बाद, हमने एलिसा और क्यूआरटी-पीसीआर दोनों द्वारा सीरम और फेफड़ों के ऊतकों में साइटोकिन्स के स्तर में वृद्धि देखी, जो 1 घंटे के बाद चरम पर पहुंच गई और13 के बाद 12-24 घंटे के भीतर तेजी से बेसलाइन पर लौट आई। 3 घंटे बाद एकत्र किए गए नमूनों के लिए, हमने बाएं फेफड़े के ऊतकों के भीतर तीव्र न्यूट्रोफिल घुसपैठ देखी और नोट किया कि सूजन की तीव्रता माउस के तनाव पर निर्भर थी (चित्रा 1)। विशेष रूप से, सह-मौजूदा या बाद की संक्रामक प्रक्रिया की अनुपस्थिति में उत्पन्न होने वाली सूजन धीरे-धीरे हल हो जाती है और फेफड़े अपने सामान्य फेफड़ों की वास्तुकला (हिस्टोपैथोलॉजी द्वारा) में एफेरोसाइटोसिस के साथ वापस आ जाते हैं या13 के बाद 12-24 घंटे के भीतर घायल फेफड़ों से न्यूट्रोफिल का प्रवेश करते हैं। ध्यान दें, हमने हल्के लेकिन पता लगाने योग्य सूजन देखी, जो काफी हद तक न्यूट्रोफिलिक थी और गैर-ऑपरेटिव दाहिने फेफड़े में भी देखी गई थी, जिसे हम अनुमान लगाते हैं कि हाइपरपरफ्यूज़न चोट14 के कारण है।
इस फेफड़े के आईआर मॉडल के लिए ऊतक नमूना संग्रह अन्य फेफड़ों के आईआर मॉडल की तुलना में अलग नहीं है: कार्डियक पंचर या आईवीसी कैनुलाशन के माध्यम से प्लाज्मा तैयारी के लिए रक्त एकत्र किया जा सकता है; फेफड़ों के ऊतकों को प्रोटीन या आरएनए तैयारी के लिए काटा जा सकता है और फिर पश्चिमी धब्बा, एलिसा या क्यूपीसीआर द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए।
चित्रा 1: दो अलग-अलग उपभेदों के जंगली प्रकार के चूहों में फेफड़ों के वर्गों की हिस्टोलॉजी। (ए) सी 3 एच और (बी) सी 57बीएल / 6 चूहे। चूहों के दोनों उपभेदों को 1 एच इस्किमिया और 3 घंटे रीपरफ्यूजन प्राप्त हुआ, और ऊतक को 10 एक्स आवर्धन पर दिखाया गया है। 40x आवर्धन इनसेट में दिखाया गया है। दोनों उपभेदों में न्यूट्रोफिलिक घुसपैठ देखी गई, सी 3 एच तनाव ने सी 57बीएल / 6 की तुलना में सूजन का अधिक स्तर दिखाया, जैसा कि पहले12 में बताया गया था। स्केल पट्टी 200 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: तीन सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले माउस प्रयोगात्मक फेफड़ों की आईआर चोट (एलआईआरआई) मॉडल के फायदे (नीला पाठ) और नुकसान (लाल पाठ) की तुलना। यह तुलना शुद्ध फेफड़ों के आईआर का अध्ययन करने के लिए आदर्श मॉडल के रूप में हवादार फेफड़े के आईआर (इस पांडुलिपि में वर्णित) की पसंद पर प्रकाश डालती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यह पांडुलिपि डोड-ओ एट अल.9 द्वारा विकसित हवादार फेफड़े के आईआर मॉडल को करने में शामिल चरणों का विवरण देती है। इस मॉडल ने अलगाव14,15,16,17 में फेफड़ों के आईआर से सूजन के उत्पादन और समाधान में शामिल आणविक मार्गों की पहचान करने में मदद की है, सह-मौजूदा संक्रमण18 के साथ संयोजन में फेफड़े के आईआर, और आंत-फेफड़ों की धुरी के संबंध में फेफड़े के आईआर और आंत माइक्रोबायोम13,18,19 का योगदान . तकनीकी रूप से अधिक चुनौतीपूर्ण होने के बावजूद, वर्तमान मॉडल बाधित चक्रीय फेफड़ों की मुद्रास्फीति और हाइपोक्सिया के कंपाउंडिंग प्रभावों के बिना फेफड़ों के आईआर के मूल्यांकन की अनुमति देता है। यह पूर्व विवो छिड़काव मॉडल के विपरीत, यांत्रिक वेंटिलेटरी एक्सपोजर की अवधि को भी कम करता है, जो स्वयं फेफड़ों की चोट20 का कारण बन सकता है।
विधि की सीमाएं: जबकि माउस श्वासनली पर्याप्त रूप से पतली हो जाती है कि सकारात्मक अंत समाप्ति दबाव (पीआईपी) फेफड़ों के विस्तार की अनुमति देता है और ईटीटी के लिए एक स्नूग फिट प्रदान करता है, फेफड़ों के यांत्रिकी और प्रवाह-मात्रा लूप माप प्रतिवर्ती ओरोट्राचेल इंटुबैशन के इस संस्करण के साथ संभव नहीं हो सकते हैं। इन फेफड़ों के शरीर विज्ञान मापों को ट्रेकोटॉमी की आवश्यकता हो सकती है, जो इस विधि के विपरीत, जीवित फेफड़ों की सर्जरी के साथ असंगत है। प्रतिवर्ती ओरोट्राचेल इंटुबैशन चूहों द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जाता है, और यहां तक कि लकवाग्रस्त की अनुपस्थिति में भी बहुत कम माउस-वेंटिलेटर सिंक्रनाइज़ होता है बशर्ते मिनट वेंटिलेशन (एमवी = ज्वारीय मात्रा x श्वसन दर) सांस लेने से प्राकृतिक सीओ 2-संचालित ड्राइव को रोकने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च हो (यानी, अपने थ्रेशोल्ड से परे)।
इस प्रक्रिया के इस्किमिया-रीपरफ्यूजन (आईआर) भाग से संबंधित कई विचार हैं। सबसे पहले, आईआर प्रक्रिया को फेफड़ों को यथासंभव कम शारीरिक आघात के साथ किया जाना चाहिए। हम यांत्रिक वेंटिलेशन को रोकने और वक्ष गुहा में प्रवेश करते समय माउस को अनायास सांस लेने की अनुमति देने की सलाह देते हैं। नकारात्मक दबाव वेंटिलेशन, सर्जन द्वारा दूसरी या तीसरी पसली को पकड़ने और # 11 स्केलपेल ब्लेड के साथ छाती में सावधानीपूर्वक प्रवेश करते समय इसे फेफड़े से दूर खींचने के साथ, स्केलपेल के साथ फेफड़े को घायल करने की संभावना को कम कर देगा। वैकल्पिक रूप से, हमने पाया है कि # 12 घुमावदार स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, ताकि वक्र ऊपर की ओर हो, वक्ष गुहा में अधिक सावधानीपूर्वक प्रवेश की अनुमति देता है, संभावित रूप से अंतर्निहित बाएं फेफड़े की शीर्ष सतह पर चोट को कम करता है। इसके अतिरिक्त, बाएं पीए और ब्रोंकस के बीच का संबंध हिलम के करीब कम सुरक्षित है, जिससे इन दो संरचनाओं के बीच अल्ट्राफाइन फोर्सप्स का मार्ग आसान हो जाता है।
अगला महत्वपूर्ण कदम पीए को सीवन टाई के साथ घेरने के लिए नीचे ब्रोंकस से बाएं पीए को अलग करना है। यह आवश्यक है कि फेफड़ों के शीर्ष पर आघात से बचने के लिए इस कदम को सावधानीपूर्वक पूरा किया जाए। हम बाएं फेफड़े की मात्रा को कम करने के लिए थोरैसिक पिंजरे में यथासंभव सेफलाड में प्रवेश करने की सलाह देते हैं जिसे पीए और ब्रोंकस तक पहुंचने के लिए विस्थापित या वापस लेने की आवश्यकता होती है। फेफड़े का कोई भी हिस्सा जो कुंद आघात को बनाए रखता है, उसे पृथक आईआर चोट के मूल्यांकन से बाहर रखा जाना चाहिए। अक्सर, बाँझ फेफड़े की आईआर चोट के अंतिम विश्लेषण के लिए फेफड़ों को इकट्ठा करते समय बाएं फेफड़े के शीर्ष को हटा दिया जाता है। रक्तस्राव या खूनी मलिनकिरण के पंक्टा की उपस्थिति के कारण सर्जरी के दौरान फेफड़े के शीर्ष की चोट की कल्पना की जा सकती है।
पीए और ब्रोन्कस के बीच नीचे एक संयोजी ऊतक परत मौजूद है जिसे सीवन टाई के साथ धमनी को घेरने के लिए तोड़ा जाना चाहिए। बाएं पीए को ऊपर की ओर (यानी, वक्ष पिंजरे की ओर और ब्रोंकस से दूर) को पकड़ने और खींचने के दौरान कितना तनाव की अनुमति है, यह सीखना, बाएं हाथ में सपाट महीन बल को पकड़ने वाले गैर-सेरेटेड, गैर-हानिकारक पोत का उपयोग करके, मास्टर करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। बाएं पीए तनाव और खिंचाव की एक आश्चर्यजनक मात्रा को सहन कर सकता है क्योंकि इसे ऊपर की ओर खींचा जाता है। हमें दृश्य क्षेत्र के आवर्धन को अधिकतम और समायोजित फोकस तक बढ़ाने में मदद मिलती है ताकि संभावित स्थान (ब्रोन्कस के पीए का पालन करने वाले संयोजी ऊतक की एक सफेद रेखा) को स्पष्ट रूप से और तेजी से अल्ट्राफाइन फोर्सप्स (दाहिने हाथ में आयोजित) के साथ देखा जा सके। क्षेत्र को फोकस में रहने के लिए, बाएं पीए को ब्रोंकस से ऊपर और दूर खींचते हुए सर्जिकल सतह पर बाएं हाथ को स्थिर करना महत्वपूर्ण है। अल्ट्राफाइन फोर्स को तब दो संरचनाओं के बीच की जगह में पारित किया जा सकता है। बंद युक्तियों को बिना किसी वास्तविक प्रतिरोध के आसानी से पारित होना चाहिए, और एक बार बाएं पीए के दूसरी तरफ देखने के बाद, सीवन सामग्री के पारित होने के लिए जगह बनाने के लिए युक्तियों को धीरे से खोला जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है कि यह पूरी तरह से क्षतिग्रस्त अल्ट्राफाइन फोर्सप्स का उपयोग करके किया जाए, जिसे बंद युक्तियों के माध्यम से बाँझ अल्कोहल स्वैब खींचकर जल्दी से निर्धारित किया जा सकता है ताकि यह देखा जा सके कि क्या युक्तियां सामग्री पर फट जाती हैं। सर्जिकल माइक्रोस्कोप के अधिकतम आवर्धन के तहत फोर्सप्स को खोलकर और बंद करके क्षति युक्तियों की पहचान भी की जा सकती है।
उन्हें अलग करने का प्रयास करते समय बाएं पीए या बाएं मुख्य ब्रोंकस को होने वाली क्षति का पता लगाना आसान है। बाएं पीए को नुकसान के परिणामस्वरूप रक्त के साथ दृश्य क्षेत्र की बाढ़ आ जाती है और यदि क्षति पीए के भीतर एक छेद बनाती है तो गैर-बचाव योग्य सर्जरी हो सकती है। विशेष रूप से, पीए पर सतह सूक्ष्म रक्त वाहिकाएं होती हैं जो अल्ट्राफाइन फोर्स आंदोलन के दौरान घायल हो सकती हैं और संभावित रूप से दिखाई देने वाले रक्त को अवशोषित करने के लिए खेत पर एक सूखी बाँझ कपास-टिप स्वैब रखकर प्रबंधित की जा सकती हैं। यदि रक्तस्राव बंद हो जाता है, तो प्रक्रिया फिर से शुरू की जा सकती है। बाएं मुख्य ब्रोंकस को नुकसान हमेशा एक गैर-बचाव योग्य स्थिति है क्योंकि वायुमार्ग क्षति की मरम्मत का कोई सरल या तेज़ तरीका नहीं है।
पीए को अंतर्निहित ब्रोंकस से अलग करने के चरण को शुरू में समय के दबाव या हृदय गतिविधि की व्याकुलता और इसके कारण होने वाली गति के बिना एक मृत माउस पर अभ्यास किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, बाएं पीए में रक्त का ठहराव इसे अधिक आसानी से कल्पना करने की अनुमति देता है (मोटी और मोटा पोत), और फिर भी गैर-घायल फ्लैट पीए फोर्सप्स द्वारा उठाए जाने में सक्षम है। बाएं ब्रोंकस में क्षति का पता लगाने की क्षमता अभी भी संभव है, क्योंकि बाएं फेफड़े के वेंटिलेशन का उपयोग बाएं फेफड़े में एक बरकरार संचालन वायुमार्ग की उपस्थिति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इस अभ्यास स्थिति का उपयोग स्लिपनॉट के निर्माण को पूरा करने के लिए भी किया जा सकता है।
रोड़ा की एक सीमित अवधि है, जिसके आगे स्लिपनॉट को हटाने के बाद सहज पुनरावृत्ति की गारंटी नहीं है। पायलट अध्ययनों में, यह 6 और 10 घंटे के बीच कहीं होता है। इसके अलावा, स्लिपनॉट को हटाने के तुरंत बाद रीपरफ्यूजन कम होता है। जैसा कि इस्केमिक अवधि बढ़ती है, रक्त प्रवाह को फिर से स्थापित करने के लिए स्लिपनॉट हटाने के बाद पीए के हेरफेर की आवश्यकता होती है।
ये निम्नलिखित अवलोकन इस पेपर के पांच सह-लेखकों से प्राप्त किए गए हैं जो इस प्रक्रिया को सीखने, परिपूर्ण करने, समस्या निवारण और सुधारने में उनके सामूहिक अनुभव का प्रतिनिधित्व करते हैं जब उन्होंने इस माउस सर्जिकल मॉडल का संचालन किया था और नीचे दिए गए बिंदुओं में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है:
औसतन, इस शल्य चिकित्सा प्रक्रिया में महारत हासिल करने में 1-3 महीने लगे। एक प्रक्रियावादी ने अनुमान लगाया कि विभिन्न प्रक्रियाओं के साथ आसान बनने के लिए लगभग 50 सर्जरी होती हैं।
प्रक्रिया करने की शुरुआत में सफलता दर 20% -40% थी। प्रक्रिया को नियमित रूप से और परिचित होने के बाद, सफलता दर 80% -90% तक बढ़ गई।
सर्जरी का सबसे कठिन हिस्सा सर्वसम्मति से बाएं पीए और बाएं ब्रोंकस के बीच अल्ट्राफाइन फोर्सेस का पारित होना था, और फिर बाद में सीवन मोनोफिलामेंट को बल के साथ पकड़ना और दो संरचनाओं के बीच से गुजरना था।
पीए और बाएं मेनस्टेम ब्रोंकस के बीच मोनोफिलामेंट के पारित होने के दौरान गलतियां बाएं पीए के विनाशकारी रक्तस्राव या बाएं मुख्य ब्रोंकस में अपरिवर्तनीय चोट के साथ एक अपरिवर्तनीय सर्जरी का कारण बन सकती हैं।
1 दिन में संभव सर्जरी की अधिकतम संख्या 10 (लगभग 35-45 मिनट / सर्जरी पर) होने का अनुमान लगाया गया था, जबकि प्रक्रियात्मक आराम और शल्य चिकित्सा की सफलता के लिए आदर्श संख्या पांच या छह थी।
अन्य विविध युक्तियों और सुझावों में शामिल हैं:
स्थिर हाथ की स्थिति बनाए रखने के लिए सर्जिकल दिन शुरू करने से पहले अतिरिक्त कैफीन से बचें।
प्रक्रिया के उस हिस्से के दौरान माइक्रोस्कोप पर आवर्धन को अधिकतम करें जब सीवन को बाएं पीए और बाएं मुख्य ब्रोंकस के बीच पारित किया जा रहा हो।
बाएं पीए और बाएं मुख्य ब्रोंकस के बीच जगह बनाने के लिए ड्यूमोंट फोर्सप्स को आगे बढ़ाते समय कोमल और क्रमिक / वृद्धिशील आंदोलनों का उपयोग करें।
सभी महत्वपूर्ण चरणों का प्रदर्शन करते समय सर्जिकल सतह पर हाथों को स्थिर करें।
सुनिश्चित करें कि वेंटिलेटर पर श्वसन दर सहज सांसों से बचने के लिए पर्याप्त है, खासकर प्रक्रिया के प्रमुख / महत्वपूर्ण भागों (बाएं पीए और बाएं मुख्य ब्रोंकस के बीच से गुजरने वाली सीवन) के दौरान।
सर्जरी करने के लिए एक शांत और अबाधित वातावरण केंद्रित और अविचलित रहने के लिए आवश्यक है।
चित्रा 2 इस मॉडल की तुलना फेफड़ों की आईआर चोट के वैकल्पिक मॉडल से करता है। हवादार फेफड़े के इस्किमिया का यह मॉडल एटेलेक्टेसिस, हाइपोक्सिया और यांत्रिक वेंटिलेशन को कम करने के फायदे प्रदान करता है। महत्वपूर्ण रूप से, एक जीवित सर्जरी के रूप में, यह दूसरी चोट मॉडल (जैसे, प्रयोगात्मक निमोनिया मॉडल) और चोट के समाधान के विश्लेषण के साथ संगत है।
अंत में, हमने फेफड़ों की इस्किमिया की चोट के निर्माण से जुड़ी एक उत्तरजीविता सर्जरी का वर्णन किया है जो हमें विश्वास है कि फेफड़ों में शुद्ध आईआर चोट में शामिल तंत्र और सेलुलर मार्गों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।
Acknowledgments
इस काम को एनेस्थीसिया और पेरीओपरेटिव केयर विभाग, कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सैन फ्रांसिस्को और सैन फ्रांसिस्को जनरल अस्पताल से विभागीय समर्थन के साथ-साथ एनआईएच आर 01 पुरस्कार (एपी के लिए): 1 आर 01एचएल 146753 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fiber Optic Light Pipe | Cole-Parmer | UX-41720-65 | Fiberoptic light pipe |
| Fiber Optic Light Source | AmScope | SKU: CL-HL250-B | Light source for fiberoptic lights |
| Germinator 500 | Cell Point Scientific, Inc. | No.5-1450 | Bead Sterilizer |
| Heating Pad | AIMS | 14-370-223 | Alternative option |
| Lithium.Ion Grooming Kits(hair clipper) | WAHL home products | SKU 09854-600B | To remove mouse hair on surgical site |
| Microscope | Nikon | SMZ-10 | Other newer options available at the company website |
| MiniVent Ventilator | Havard Apparatus | Model 845 | Mouse ventilator |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | Clean tools that been used in operation |
| Warming Pad | Kent Scientific | RT-0501 | To keep mouse warm while recovering from surgery |
| Weighing Scale | Cole-Parmer | UX-11003-41 | Weighing scale |
| Surgery Tools | |||
| 4-0 Silk Suture | Ethicon | 683G | For closing muscle layer |
| 7-0 Prolene Suture | Ethicon Industry | EP8734H | Using for making a slip knot of left pulmonary artery |
| Bard-Parker (11) Scalpel (Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade, sterile, single use) | Aspen Surgical | 372611 | For entering thoracic cavity (option 1) |
| Bard-Parker (12) Scalpel | Aspen Surgical | 372612 | For entering thoracic cavity (option 2) |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | Muscle/rib holding forceps |
| Magnetic Fixator Retraction System | FST | 1. Base Plate (Nos. 18200-03) 2. Fixators (Nos. 18200-01) 3. Retractors (Nos. 18200-05 through 18200-12) 4. Elastomer (Nos.18200-07) 5. Retractor(No.18200-08) |
Small Animal Retraction System |
| Monoject Standard Hypodermic Needle | COVIDIEN | 05-561-20 | For medication delivery IP |
| Narrow Pattern Forceps | FST | 11002-12 | Skin level forceps |
| Needle holder/Needle driver | FST | 12565-14 | for holding needles |
| Needles | BD | 305110 | 26 gauge needle for externalizing slipknot (24 or 26 gauge needle okay too) |
| PA/Vessel Dilating forceps | FST | 00125-11 | To hold PA; non-damaging gripper |
| Scissors | FST | 14060-09 | Used for incision and cutting into the muscular layer durging surgery |
| Ultra Fine Dumont micro forceps | FST | 11295-10 (Dumont #5 forceps, Biology tip, tip dimension:0.05*0.02mm,11cm) | For passing through the space between the left pulmonary artery and bronchus |
| Reagents | |||
| 0.25% Bupivacaine | Hospira, Inc. | 0409-1159-02 | Topical analgesic used during surgical wound closure |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Anesthetic, using for anesthetize the mouse for IR surgery, the concentration used in IR surgery is 250-400 mg/kg. |
| Buprenorphine | Covetrus North America | 59122 | Analgesic: concentration used for surgery is 0.05-0.1 mg/kg |
| Eye Lubricant | BAUSCH+LOMB | Soothe Lubricant Eye Ointment | Relieves dryness of the eye |
| Povidone-Iodine 10% Solution | MEDLINE INDUSTRIES INC | SKU MDS093944H (2 FL OZ, topical antiseptic) | Topical liquid applied for an effective first aid antiseptic at beginning of surgery |
| Materials | |||
| Alcohol Swab | BD brand | BD 326895 | for sterilzing area of injection and surgery |
| Plastic film | KIRKLAND | Stretch-Tite premium | Alternative for covering the sterilized surgical field (more cost effective) |
| Rodent Surgical Drapes | Stoelting | 50981 | Sterile field or drape for surgical field |
| Sterile Cotton Tipped Application | Pwi-Wnaps | 703033 | used for applying eye lubricant |
| Top Sponges | Dukal Corporaton | Reorder # 5360 | Stopping bleeding from skin/muscle |
References
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