Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

CRISPR/Cas9-medieret højeffektiv genmålretning i embryonale stamceller til udvikling af genmanipulerede musemodeller

Published: August 24, 2022 doi: 10.3791/64385
Automatic Translation
*1, *2, 1,2
1Laboratory of Reproductive Systems Biology, Center for Experimental Medicine and Systems Biology, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo, 2Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol for udvikling af genetisk modificerede musemodeller ved hjælp af embryonale stamceller, især til stor DNA-knock-in (KI). Denne protokol er indstillet ved hjælp af CRISPR / Cas9 genomredigering, hvilket resulterer i signifikant forbedret KI-effektivitet sammenlignet med den konventionelle homologe rekombinationsmedierede lineariserede DNA-målretningsmetode.

Abstract

CRISPR/Cas9-systemet har gjort det muligt at udvikle genmodificerede mus ved direkte genomredigering ved hjælp af befrugtede zygoter. Men selvom effektiviteten i udviklingen af gen-knockout-mus ved at inducere små indelmutationer ville være tilstrækkelig nok, er effektiviteten af embryogenomredigering til fremstilling af stort DNA-knock-in (KI) stadig lav. I modsætning til den direkte KI-metode i embryoner har genmålretning ved hjælp af embryonale stamceller (ESC'er) efterfulgt af embryoinjektion til udvikling af kimærmus derfor stadig flere fordele (f.eks. kan høj gennemstrømningsmålretning in vitro, multi-allelmanipulation og Cre - og flox-genmanipulation udføres på kort tid). Derudover kan stammer med vanskelige at håndtere embryoner in vitro, såsom BALB / c, også bruges til ESC-målretning. Denne protokol beskriver den optimerede metode til storstørrelse DNA (flere kb) KI i ESC'er ved at anvende CRISPR / Cas9-medieret genomredigering efterfulgt af kimærmusproduktion til udvikling af genmanipulerede musemodeller.

Introduction

At producere genetisk modificerede mus og analysere deres fænotype gør det muligt for os at forstå specifikke genfunktioner i detaljer in vivo. Talrige vigtige fund er blevet afdækket ved hjælp af genmodificerede dyremodeller inden for life science. Siden rapporten om genomredigeringsteknologi ved hjælp af CRISPR/Cas91 har forskning ved hjælp af genetisk modificerede mus desuden hurtigt spredt sig til mange laboratorier 2,3. Genomredigering af musezygoter af CRISPR/Cas9 har opnået acceptabel effektivitet til udvikling af kort DNA-modifikation, såsom indelmutationsorienteret genknockout 4, enkelt nukleotidudskiftning eller kort peptid-tag-indsættelse ved hjælp af enkeltstrengede oligonukleotider (ssODN'er) som knock-in (KI) donorer5. På den anden side forbliver KI for store DNA-fragmenter i zygoter ved genomredigering med en lav effektivitet sammenlignet med den korte DNA-modifikation 6,7. Derudover er det vanskeligt at bruge musestammer som BALB/c, som er en vigtig stamme for specifikke forskningsområder som immunologi, til zygotebaseret genomredigering, fordi deres præimplantationsembryoner er modtagelige for in vitro-manipulation.

En anden måde at udvikle genetisk modificerede musemodeller på er at bruge den embryonale stamcelle (ESC) målretningsteknik efterfulgt af ESC-injektion i præimplantationsembryoet til fremstilling af kimærer 8,9,10, som stadig rutinemæssigt anvendes som en konventionel metode. Selvom anskaffelsesraten for at opnå nøjagtige KI-ESC-kloner ikke er særlig høj i konventionelle ESC-målretningsmetoder, giver ESC-målretning nogle fordele sammenlignet med zygotegenomredigering, især for lang DNA KI. For eksempel er KI-effektiviteten af lange DNA-fragmenter (> flere kb) i zygotegenomet mindre tydelig6,7, og mange zygoter er nødvendige for at udvikle endnu en linje KI-mus, hvilket er uønsket i det nuværende perspektiv af dyreforsøg. I modsætning til zygotegenomredigering har lang DNA-målretning mod ESC'er efterfulgt af kimærproduktion brug for betydeligt færre embryoner end zygotegenomredigering. Selv om præimplantationsembryonerne fra BALB/c er modtagelige for in vitro-manipulation, kan deres økonomiske og sociale råd vedligeholdes og håndteres in vitro 11 som andre kompetente 129- eller F1-baggrunds-ESC'er, der derfor gælder for kimærproduktioner. Men selv om en målvektor indeholder 5' og 3' homologe arme og lægemiddelresistensgenkassetter til positiv eller negativ selektion, er den konventionelle KI-effektivitet af ESC'er generelt utilstrækkelig på grund af den høje frekvens af tilfældig genomisk integration 8,10, og der er derfor behov for en forbedret metode med præcis ESC-målretningseffektivitet. For nylig rapporterede vi en tunet ESC KI-metode ved hjælp af CRISPR / Cas9-baseret genomredigering for at opnå højere KI-effektivitet end konventionelle målretningsmetoder11. Den metode, vi beskriver her, er baseret på denne procedure, der muliggør lang DNA (> flere til 10 kb) KI til ESC'er med acceptabel effektivitet til rutinemæssige værker uden lægemiddelvalg; Således ville vektorkonstruktionsproceduren være meget lettere og have brug for en kortere periode, eller cellekulturperioden ville også blive betydeligt kortere.

Protocol

Alle museforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Tokyo (godkendelsesnummer PA17-63) og Osaka University (godkendelsesnummer Biken-AP-H30-01) og udført i henhold til deres retningslinjer samt ARRIVE-retningslinjerne (https://arriveguidelines.org).

1. Målretning mod vektorkonstruktion

  1. Forstærk en KI-kassette (CreERT her, skabelon-DNA til PCR er oprindeligt fra et kommercielt gensyntesefirma) og et ca. 1 kb fragment af 5'- eller 3'-homologiarme ved PCR. Til DNA-kloning (trin 1.3) tilsættes 15-mer overlapningssekvenser i 5' enden af hver PCR-primer. Oprense PCR-DNA-fragmenterne ved agarosegelelektroforese efterfulgt af ekstraktion af DNA-fragmentet ved hjælp af et DNA-rensningssæt.
  2. Lineariser rygradsplasmidet (f.eks. pUC19 eller pBS) ved hjælp af et passende restriktionsenzym (er), der unikt fordøjes et eller andet sted på multikloningsstedet til kloning. Rens derefter det fordøjede plasmid ved hjælp af et DNA-rensningssæt.
  3. Klon hvert PCR-fragment (f.eks. 5'-homologiarm, 3'-homologiarm) og KI-sekvens samtidigt ind i det fordøjede plasmid ved hjælp af et DNA-kloningssæt i henhold til producentens anvisninger.
  4. De kompetente celler omdannes ved hjælp af det konstruerede plasmid (trin 1.3) ved opvarmning ved 42 °C i 1 minut i et vandbad, og sås derefter på en LB-plade, der indeholder den passende koncentration af antibiotika, såsom ampicillin eller kanamycin. Kultur dem natten over for resistente klonvalg.
  5. Hent flere (fire til otte) individuelle kolonier ved hjælp af 200 μL pipettespidser og overfør spidserne til 3 ml flydende LB indeholdende passende antibiotika (100 μg / ml ampicillin eller 20 μL / ml kanamycin) og kultur natten over ved 37 ° C med omrystning.
  6. Rens plasmidet den følgende dag ved hjælp af et endotoksinfrit kommercielt plasmidrensningssæt i henhold til producentens anvisninger. Bekræft den klonede sekvens i plasmidet ved Sanger-sekventering. Plasmidkoncentrationen justeres ved 1 μg DNA/μL ved hjælp af nukleasefrit vand. Brug plasmidet som genmålretningsvektor.

2. Fremstilling af museembryonisk fibroblast (MEF) som fødeceller til ESC

  1. Ofre 8-10 uger gamle gravide ICR-hunmus (14,5 dage efter fødslen) ved cervikal forskydning. Tør maven godt ved hjælp af 70% (v / v) ethanol til sterilisering, skær maven ved hjælp af orbital saks og tang, og gendan den fosterholdige livmoder.
  2. Livmoderen anbringes i en 100 mm skål indeholdende 10 ml fosfatbovisrum (PBS) indeholdende 100 E/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin. Fjern moderkagen og ekstraembryonalt væv fra fostrene ved hjælp af orbital saks og tang. Hak fostrene ved hjælp af orbitalsaks og overfør PBS-opløsningen indeholdende de hakkede fosterceller til et 50 ml konisk rør.
  3. Der centrifugeres ved 280 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten kasseres ved aspiration. Tilsæt 10 ml 0,25% (w / v) trypsin-EDTA-opløsning, bland godt ved pipettering, og inkuber derefter i 10 minutter ved 37 ° C ved hjælp af et vandbad til trypsinfordøjelse.
  4. Tilsæt 20 ml MEF-medium (DMEM indeholdende 10% (v/v) føtalt bovint serum, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin) for at stoppe den enzymatiske reaktion, bland godt ved blid inversion, og centrifuge ved 280 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten ved aspiration, tilsæt 10 ml MEF-medium, og bland godt ved pipettering.
  5. Frø cellesuspensionen i flere nye 100 mm skåle (tilbered det samme antal retter som antallet af fostre med 10 ml MEF-medium til en 100 mm skål). Skift mediet 4 til 5 timer efter såning for at fjerne ikke-vedhæftede celler og lad den vedhæftede MEF vokse. Passage cellerne, når de når ~ 80% sammenløb ved hjælp af trypsin.
  6. Dyrkningsfadene indeholdende den prolifererende MEF anbringes i MEF-mediet, ca. 12-15 dage efter såning, i en røntgenbestrålingsanordning. Udsæt MEF med en 50 Gy røntgen (i alt) for at stoppe cellecyklussen i henhold til producentens instruktion.
  7. Trypsiniser den bestrålede MEF ved at tilføje 2 ml 0,25% trypsin-EDTA til en 100 mm skål i 5 minutter ved 37 ° C, tilsæt derefter 4 ml MEF-medium for at stoppe trypsinfordøjelsen og opsamling cellesuspensionen i et nyt 50 ml rør.
  8. MEF'en vaskes med et frisk MEF-medium ved centrifugering ved 280 x g i 5 minutter ved 4 °C, antallet af celler ved hjælp af en celletæller med trypanblå farvning og fryses ved 1,6 x 106 celler/rør i et cellefrysningsmedium. Opbevares indtil brug; celler kan opbevares stabilt i flydende nitrogen i flere år.

3. Fremstilling af Cas9-RNP-DNA-blanding

  1. Opløs tracrRNA og crisprRNA i fortyndingsbuffer (hver RNA-koncentration ved 200 μM) ved pipettering. Bland tracrRNA-opløsningen, crisprRNA-opløsningen og fortyndingsbufferen (volumenforhold ved 2: 2: 5) ved blid tapning og glødning af hvert RNA ved hjælp af en termisk cykler ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 1 ° C / min stepdown-cyklusser, indtil temperaturen når 4 ° C.
    BEMÆRK: GRNA-sekvensen blev designet ved hjælp af CRISPOR, http://crispor.tefor.net.
  2. Inkubere de udglødede RNA'er, 10 μg / μL Cas9-nuklease, og elektroporationsbufferen blandes i et volumenforhold på 5: 3: 2 ved 37 ° C i 20 minutter for at danne Cas9-RNP-komplekset. I rutinearbejde blandes og inkuberes 1,25 μL udglødet RNA, 0,75 μL Cas9-nuklease og 0,5 μL af elektroporationsbufferen til redigering af et locusgenom.
  3. Følgende materialer blandes i et 1,5 ml rør: 10 μL elektroporationsbuffer, 1 μL Cas9-RNP-kompleks (trin 3.2) og 1 μL cirkulær målretningsvektor (1 μg/μL, trin 1.6). Den samlede mængde Cas9-RNP-DNA-blanding er 12 μL. Hold Cas9-RNP-DNA-blandingen på is indtil elektroporation.
    BEMÆRK: For at forhindre genspaltning af gRNA'et efter KI skal du designe gRNA'et i en position, hvor gRNA-genkendelsessekvensen opdeles ved integration af KI-donoren. Hvis gRNA'et ikke kan designes på et sådant sted, inkluderes flere nukleotidtavse mutationer, hvorved aminosyresekvensen ikke ændres, i KI-donorens plasmid.

4. Genmålretning af økonomiske råd

  1. For at forberede de gelatinebelagte cellekulturretter tilsættes 0,1% (w / v) gelatineopløsning ved 2 ml til en 60 mm skål, 500 μL til en 24-brøndsplade, 100 μL til en 96-brøndplade og inkuberes i 2 timer i en fugtig inkubator. Gelatineopløsningen fjernes, vaskes to gange med den samme mængde PBS, og opbevares ved stuetemperatur indtil brug.
  2. Optø mitotisk inaktiveret frossen MEF-bestand (trin 2.2) ved hjælp af et 37 ° C vandbad i 1 min., og anbring MEF på en gelatinebelagt 60 mm skål (et frosset lagerrør med MEF indeholdende 1,6 x 106 celler til to 60 mm skåle, trin 2,2) 1 dag før ESC-såning.
  3. Optø et frossent ESC-lagerrør (opbevaret ved 2 x 10 5 ESC/rør; celletælling blev udført ved hjælp af en celletæller) ved hjælp af et 37 °C vandbad i 1 min., og anbring 1 x 105 ESC'er på en 60 mm skål indeholdende forsået MEF (trin 4.1).
  4. Kultur i 4 ml ESC-kulturmedium (ESCM, DMEM-baseret modificeret medium med 15% (v / v) føtalt bovint serum, 2 mM L-glutaminsubstrat, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,1 mM 2-mercaptoethanol, leukæmihæmmende faktor og t2i (0,2 μM PD0325901 og 3 μM CHIR99021), som opretholder pluripotens af ESC11) ved 37 ° C med 5% CO2 , indtil ESC når 50% til 70% sammenløb.
    BEMÆRK: Vi bruger tre forskellige linjer af ESC: JM8. A3 fra B6N, V6.5 fra B6-129 F1 og internt udviklet BALB/c ESC. De samme KI-protokoller i dette manuskript bruges til alle ESC-linjer.
  5. Dyrkning af ESC vaskes med 4 ml PBS, og derefter behandles med 800 μL 0,25% trypsin-EDTA-opløsning i 5 minutter ved 37 °C til fordøjelse. Tilsæt 1 ml ESCM for at inaktivere trypsinen og dissociere ESC'erne til enkeltceller ved pipettering.
  6. Centrifuger den ESC-holdige opløsning i 5 minutter ved 280 x g, kassér supernatanten, suspender esc'er i frisk 1 ml ESCM, og tæl antallet af celler ved hjælp af en celletæller med trypanblå farvning. Der overføres 1 x 10 5 ESC'er til et nyt1,5 ml rør, og de vaskes tre gange med PBS ved centrifugering ved 500 x g, 4 °C.
  7. Esc-pelleten resuspenderes i 12 μL Cas9-RNP-DNA-blanding (trin 3.3) og blandes godt ved skånsom pipettering for at undgå boblende. Server den resuspenderede ESC til elektroporation. Elektroporationssystemet bruger en enkelt puls ved 1.400 V og 30 ms til Cas9-RNP-DNA-transduktion (figur 1).
  8. De elektroporerede ESC'er dyrkes i en 60 mm skål indeholdende 4 ml ESCM med mitotisk inaktiveret MEF (afsnit 4.2). Skift mediet hver dag.
  9. Esspromillen vaskes med 4 ml PBS 3 til 5 dage efter elektroporationen, og derefter behandles med 800 μL 0,25% trypsin-EDTA og dyrkning ved 37 °C i 5 minutter i en fugtig inkubator til fordøjelse. Tilsæt 2 ml ESCM for at stoppe trypsinfordøjelsen og centrifugerer celleblandingen ved 280 x g i 5 min.
  10. Kassér supernatanten, suspender esc'erne i 1 ml frisk ESCM, og tæl cellekoncentrationen ved hjælp af en celletæller med trypanblå farvning. Passage af ESC'erne ved 1 x 103 ESC'er pr. 60 mm skål indeholdende ESCM og feeder MEF. Skift mediet hver dag, indtil kolonien tager til.
    BEMÆRK: Grunden til, at ESC er bestået en gang før afhentning, var, at genomredigering kan fortsætte med at forekomme efter ESC-opdeling, så den første koloni er ikke altid klonen i mange tilfælde. Derfor er den første passage af ESC før koloniens afhentning et vigtigt skridt til at hente enkelte kloner.

5. PCR-genotypebestemmelse af målrettede økonomiske og sociale råd

  1. Aspirer ESCM fra ESC-kulturskålen 5 til 7 dage efter den første passage (trin 4.9) og tilsæt 4 ml PBS. Hent enkelte ESC-kolonier med 5 μL PBS ved hjælp af en 20 μL pipette under et stereomikroskop (30x til 40x forstørrelse). De enkelte kolonier anbringes i en brønd med en rundbundet 96-brøndplade indeholdende 15 μL 0,25% trypsin-EDTA-opløsning.
  2. Opbevar 96-brøndspladen på is, indtil 48 individuelle kolonier er samlet op. Inkuber 96-brøndspladen i 5 minutter i en 37 °C fugtig 5% CO2 inkubator, tilsæt derefter 80 μL ESCM for at stoppe trypsinfordøjelsen og dissociere ESC-kolonier i enkeltceller ved pipettering.
    BEMÆRK: Da KI-effektiviteten af denne metode normalt er 10% -50%, henter vi rutinemæssigt 48 kloner og udfører først genotypning ved hjælp af 24 af dem. Hvis der ikke kan opnås flere KI-kloner på dette tidspunkt, screener vi yderligere for KI ved hjælp af de resterende 24 kloner.
  3. 40 μL ESC-suspension (trin 5) overføres til en gelatinebelagt feederfri 96-brøndplade indeholdende 50 μL ESCM pr. brønd til PCR-genotypebestemmelse. De resterende 60 μL ESC-suspension overføres til en brønd i en gelatinebelagt 24-brøndsplade, der indeholder 500 μL ESCM og feeder MEF, for at fremstille det frosne ESC-lager.
  4. Lager individuelle ESC-kloner dyrket i 24-brøndspladen (trin 5.3), indtil de når 60% til 80% sammenløb. Gendan individuelle ESC-kloner ved trypsinisering som nævnt ovenfor, saml celler i et nyt 1,5 ml rør og centrifuge ved 280 x g i 5 minutter. Supernatanten kasseres, cellerne gensusponeres i 500 μL cellefrysningsmedium, og de fryses med en dybfryser på -80 °C.
  5. Til PCR-genotypning dyrkes ESC-kloner i den 96-brønds feederfri plade (trin 5.3), indtil ESC når mere end 90% sammenløb. Fjern ESCM fra hver brønd ved aspiration og vask to gange med 100 μL PBS.
  6. Aspirer PBS og tilsæt 100 μL lysisbuffer indeholdende proteinase K, bland godt, og overfør ESC-lysatet til et nyt 1,5 ml rør. ESC-lysatet opvarmes ved 65 °C i mindst 1 time ved hjælp af et varmekammer. Ekstrahers og oprenses det genomiske DNA ved hjælp af en konventionel phenol-chloroform DNA-rensningsmetode efterfulgt af ethanoludfældning.
  7. Det udfældede DNA opløses i 20 μL DNasefrit vand og bestemmes renheden og koncentrationen af DNA ved hjælp af et spektrofotometer. Udfør genomisk PCR ved hjælp af locus-specifikke primersæt for at forstærke målområdet. Kontroller derefter sekvensen, og vælg ESC-klonerne med de ønskede KI-sekvenser.

6. Fremstilling af ottecellede embryoner og mikroinjektion af økonomiske og sociale råd

  1. Injicer 5 IE af gravid hoppe serum gonadotropin (PMSG) intraperitonealt i voksne ICR hunner. Efter 48 timer injiceres 5 IE humant choriongonadotropin (hCG) i de samme hunner, og parrer derefter de hormonbehandlede hunner med ICR-hannerne. Kontroller copulatorisk plug i skeden den følgende dag (embryonal dag 0,5, ED0,5).
    BEMÆRK: For at evaluere kimerisme efter pelsfarveforhold skal du bruge blastocyst fra ICR-stammen som modtager til en ESC, der har sort eller agouti pelsfarvebaggrund, eller blastocyst fra C57BL / 6-stammen som modtager til en ESC, der har albinobaggrunden.
  2. Opsamling ovidukten ved ED1.5 og læg den i HEPES buffered medium (FHM) dråber. Gendan de tocellede eller firecellede faseembryoner ved at skylle ovidukten med FHM ved hjælp af en skyllenål indsat i infundibulum.
  3. Vask de opsamlede embryoner ved at flytte dem i flere friske FHM-dråber ved hjælp af en mundpipette. Dyrkning af embryonerne i 50 μL KSOM-fald på en 35 mm cellekulturskål dækket med mineralolie ved 37 °C, 5% CO2 -inkubator i 1 dag, indtil ottecelle- eller morulastadiet (ED2.5) er nået.
  4. Hvis embryonerne ikke anvendes på den næste indsamlingsdag, fryses de ved vitrifikation i henhold til CARD-protokollen (http://card.medic.kumamoto-u.ac.jp/card/english/sigen/manual/ebvitri.html) og opbevares i flydende nitrogen indtil brug.
  5. Forbered glaspipetter til at holde embryonerne (80-100 μm ydre diameter) og ESC-injektion (ca. 13 μm diameter) ved hjælp af en aftrækker og mikroforge.
  6. Integrer en holdepipetette, der indeholder FHM, i en kapillærholder, der er forbundet til en mikroinjektor og sat op på venstre side af mikromanipulatoren. Tilslut en injektionspipette til en anden mikroinjektor, og sæt den op på højre side. Juster de to pipetter lige i mikroskopets synsfelt.
  7. Der udleveres 5 μL dråber 12% (w/v) polyvinylpyrrolidon (PVP) i FHM-medium og 5 μL dråber FHM på det samme låg på en 60 mm skål side om side, og dæk dråberne med mineralolie. Overfør embryoner i 5 μL FHM-dråbet, og tilsæt 1-5 μL ESC-suspensionen til FHM-dråben, der indeholder embryoner.
    BEMÆRK: Lad ESC- og MEF-suspensionen stå i 30 minutter i 4 ml ESM på 60 mm kulturskål før dråbeforberedelsen. Da MEF'er klæber til bunden hurtigere end ESC'er, giver denne 30-minutters inkubation mulighed for koncentrationen af ikke-vedhæftede ES-celler i supernatanten.
  8. Vask inde i injektionspipetten med PVP, og flyt derefter til dråben, der indeholder embryoner og ESC'er.
  9. Hent tre individuelle ECS-dubletter, der netop har afsluttet deres celledeling (seks celler) i injektionspipetten. Hold et otte-celle eller morula stadium embryo, som har afsluttet komprimering, med holdepinetten ved aspiration. Lav et hul i zona pellucida med en piezoelektrisk puls (intensitet: 3; hastighed: 3). Udvis den sekscellede ESC inde i zona pellucida og træk pipetten ud af embryonerne.
  10. Embryoner med ESC-injiceret med flere KSOM-dråber forsigtigt ved hjælp af en mundpipette og inkuberes i en ny 50 μL KSOM-dråbe dækket med mineralolie ved 37 °C, 5 % CO2 , indtil embryonerne udvikler sig til blastocyststadiet.
  11. Overfør de 10 ESC-injicerede blastocyster i hvert livmoderhorn hos pseudogravide hunmus (2,5 dage postcoitum, 20 blastocyster pr. Indbygger).
  12. Efter at surrogatmoren har født, skal du vælge mindst to mandlige kimærer med det højeste kimæreforhold (70% eller højere som bekræftet af pelsfarve) og derefter parre dem med passende stammehunner for at opnå F1 heterozygot KI.
  13. Opdræt individuelle KI-mus med passende partnere for at få mus med ønskelig genotype (er) eller genetisk baggrund, der er egnet til forskning.

Representative Results

Vi har målrettet specifikke gener i ESC efterfulgt af kimærproduktion for at udvikle genmanipuleret museproduktion i henhold til vores tidligere manuskript11. ESC-genotypning (beskrevet i afsnit 4) udføres rutinemæssigt ved PCR ved hjælp af primere. Primerne er designet på genomiske sekvenser uden for homologiarmene og de specifikke sekvenser i KI DNA-fragmentet (figur 2A). I så fald forstærkes ingen vildtype-allel, mens en PCR-amplicon af en bestemt størrelse kun detekteres, når det målrettede eksogene DNA er KI på målstedet. Repræsentative genotypebestemmelse PCR-resultater er vist i figur 2B. Ni ud af 22 kloner (40,9%) viste et KI-specifikt bånd i dette tilfælde. Tre repræsentative målretningsresultater, herunder resultatet vist i figur 2, er vist i tabel 1. Disse resultater indikerer, at metoden vist her er effektiv og reproducerbar for gen-KI uden lægemiddelvalg.

ESC afhentes i en injektionspipette, derefter laves et hul i zona pellucida ved hjælp af et piezoelektrisk plus, og ESC frigives mellem de embryonale celler (figur 3). Teknisk set svarer denne protokol til at injicere en ESC i et ottecelle- eller morula-stadiumembryo til protokollen for ESC-injektion i en blastocyst, der almindeligvis anvendes i mange musefaciliteter. Repræsentative kimære mus er vist i figur 4. Til pelsfarvevurdering af kimære blev embryoet fra ICR-stammen (albino, hvidt hår) brugt som modtager af B6 eller B6-129 F1 ESC, og B6-embryoner blev brugt som modtager af BALB/c ESC'er (figur 4).

Figure 1
Figur 1: En skematisk af CRISPR/Cas9 ribonukleoprotein (RNP)-medieret cirkulær plasmidintegration i det specifikke sted i et ESC-genom. Elektroporation introducerer et cirkulært plasmid som en målretningsvektor i ESC'er med Cas9-RNP. Forkortelser: GOI = gen af interesse, HA = homologiarm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Genomiske PCR-analyser til KI-screening af målrettede ESC-kloner. (A) KI-specifikke PCR-primere er designet på genomiske sekvenser uden for homologiarmene (fremad) og i de specifikke sekvenser i KI DNA-fragmentet (omvendt). B) Repræsentative genotypebestemmelse af PCR-resultater. Et vildtypegenom blev brugt som en negativ kontrol. Forkortelser: GOI = gen af interesse, HA = homologiarm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative billeder af ottecellede embryoinjektioner. (A) Til mikroinjektion afhentes tre dubletter af ESC'er (seks celler, pilespidser). (B) Et hul i zona pellucida er lavet med en piezoelektrisk puls, og ESC'er udvises mellem hver blastomere. Vist skalabjælke er 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative billeder af kimærmus . (A,B) ØSU afledt af C57BL/6N (JM8. A3, Agouti hår; A) eller B6-129 F1 (Agouti hår; B) injiceres i ICR-embryoner (albino, hvidt hår) efterfulgt af overførsel af embryonerne til modersurrogaterne. C) ESC afledt af BALB/c (albino, hvidt hår) injiceres i C57BL/6J (sort hår) embryoner efterfulgt af overførsel af embryoner til modersurrogater. Klik her for at se en større version af denne figur.

Projekt ID Koromosomat 5'HA længde (bp) 3'HA længde (bp) Indsæt størrelse (bp) Antal analyserede kloner Antal KI-kloner Effektivitet (%) Bemærkninger
R26-CC* Chr6 965 1006 5321 23 2 8.7% -
R4-03* Chr8 1000 997 3070 22 6 27.3% -
P4-01* Chr15 1000 1000 2569 22 9 40.9% Vist i figur 2

Tabel 1: KI-effektivitet på tre uafhængige genomiske lokaliteter i ESC. *Disse projekter er endnu ikke offentliggjort. Navnet på disse gener vil blive afsløret i uafhængige manuskripter i fremtiden.

Discussion

Genmålretning af ESC'er efterfulgt af kimærproduktion er traditionelt blevet brugt til udvikling af genmanipulerede mus. Ikke desto mindre forbliver gen-knock-in-effektiviteten lav, selvom målretningsvektoren indeholder lange (> flere kb i sædvanlige) homologiarme med positive eller negative lægemiddelselektionsgenkassetter. Vores protokol introducerede en tunet ESC KI-metode til langt eksogent DNA ved hjælp af et cirkulært plasmid uden lægemiddeludvælgelseskassetter som en målretningsvektor ledsaget af Cas9-RNP-medieret genomredigering med en acceptabel effektivitet til rutinemæssige værker. Denne protokol kan således bidrage væsentligt til at reducere den tid, det tager at producere genetisk modificerede kimære mus sammenlignet med den konventionelle ESC-målretning.

I denne protokol brugte vi CRISPR/Cas9-RNP til at inducere stedsspecifikke dobbeltstrengsbrud i genomet, og et cirkulært plasmid blev brugt som målretningsvektor i stedet for en lineariseret. Lineariserede plasmider anvendes konventionelt som en målretningsvektor for gen-KI på grund af deres øgede effektivitet af genomisk integration 8,9,10. Imidlertid er mange genomiske integrationer uspecifikke, selvom vektoren indeholder homologe arme9. På den anden side anvendes cirkulære plasmider sjældent som målretningsvektorer på grund af deres vanskelige at integrere funktion i genomet af ESC'er12 eller fibroblaster13. Det ville således være muligt, at anvendelse af et cirkulært plasmid som en målretningsvektor ledsaget af CRISPR / Cas9-medieret genomredigering minimerer uspecifik tilfældig integration, men maksimerer den stedsspecifikke integration i ESC-genomet. Det ville være bemærkelsesværdigt, at induktionseffektiviteten af dobbeltstrengsbruddet ved CRISPR / Cas9 er ret vigtig14, og det ville derfor være vigtigt at bruge gRNA, der inducerer et dobbeltstrengsbrud ved høj effektivitet. Det bør overvejes at re-designe gRNA, når KI-effektiviteten er for lav. I det tilfælde, der er vist i figur 2, viste 40,9% af ESC-klonerne et KI-specifikt bånd. Faktisk udfører vi som instituttets kernelaboratorium rutinemæssigt genmålretning ved hjælp af ESC'er ved hjælp af den her beskrevne metode og har opnået KI-effektiviteter på 10% -50% for 1-2 kb-sekvenser som Cre, CreERT eller fluorescerende journalister, selvom der er nogle variationer afhængigt af genstedet. De længste DNA-sekvenser, vi med succes har KI ved hjælp af denne metode, er ca. 11,2 kb i Rosa26-locus, og effektiviteten var 12,2% (fem KI-kolonier ud af 41 analyserede kolonier).

Det skal også bemærkes, at denne protokol anvender ottecellede eller morulastadiet embryoner som modtagere af ESC-mikroinjektion, men ikke blastocyst-stadiets embryoner. Selvom vi ikke har udført sammenligningseksperimenter i dette papir, har flere rapporter vist, at injektion af ESC'er i ottecellede eller morula-stadiumembryoner forbedrer effektiviteten af ESC-bidrag til kimære afkom signifikant sammenlignet med ESC-injektionen i blastocyster15,16,17,18 . Faktisk resulterede ESC-injektioner af forskellige ESC-linjer, herunder C57BL/6, B6-129 F1 og BALB/c, almindeligvis i udvikling af kimærer med høj pelsfarve hos nogle, men ikke alle, afkom (se figur 4). Begrænsningen ved metoden er, at de ESC'er, der injiceres i præimplantationsembryoet, ikke altid kunne bidrage til kimceller i en kimær 19,20. Overførsel af kønsceller vil afhænge af kvaliteten af hver ESC-klon19. Derfor vil det være en fordel at udvikle flere ESC-klonlinjer som backup til stabil kimæmisk museproduktion. Afslutningsvis bruger de protokoller, der præsenteres her, enkle målretningsvektorer, som kun inkluderer hver homologiarm og gen af interesse for KI uden nogen lægemiddelresistent kassette. Derfor ville vektorkonstruktionen være meget lettere, og kulturperioden kunne forkortes sammenlignet med den konventionelle ESC-målretningsteknik. Dette ville hjælpe med hurtigt og lettere at producere forskellige typer genetisk modificerede mus til fremtidig analyse inden for biovidenskab.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende interesser at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Saki Nishioka i Osaka University, Biotechnology Research and Development (nonprofit organisation) og Mio Kikuchi og Reiko Sakamoto i Institute of Medical Science, University of Tokyo, for deres fremragende tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af: Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (MEXT)/Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-tilskud til MI (JP19H05750, JP21H05033) og MO (20H03162); Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST), Japan Science and Technology Agency (JST) bevilling til MI (JPMJCR21N1); Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development til MI (R01HD088412); Bill & Melinda Gates Foundation til MI (Grand Challenges Explorations-bevilling INV-001902); og bevillingen til fælles forskningsprojekt fra Forskningsinstituttet for Mikrobielle Sygdomme, Osaka University til MI og MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BALB/c ESC - - ESC developed from BALB/c strain
Bambanker Nippon Genetics CS-02-001 Cell-freezeing medium. Section 2.6 and elsewhere
Cas9 Nuclease V3 IDT 1081059 Section 3.2 and elsewhere.
CHIR99021 FUJIFILM Wako 038-23101 Section 4.3
CreERT gene fragment GeneWiz Section 1.1.
CRISPR-Cas9 crisprRNA IDT crisprRNA. Section 3.1 and elsewhere.
CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072534 tracrRNA. Section 3.1 and elsewhere.
DMEM Nacalai 08458-45 MEF medium. Section 2.3 and elsewhere
Duplex buffer IDT 1072534 RNA dilution buffer. Section 3.1 and elsewhere.
FastGene Gel/PCR Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Section 1.1 and 1.2.
GlutaMax Thermo Fisher 35-050-061 L-glutatime substrate
hCG ASKA Animal Health Section 6.1.
In-Fusion HD Cloning Kit Clontech 639648 DNA cloning kit. Section 1.3 and elsewhere
JM8.A3 ESC EuMMCR - ESC developed from C57BL/6N strain
Knock-out DMEM Thermo Fisher 10829018 Section 4.3 and elsewhere, DMEM-based modified commercial medium.
KSOM Merck MR-121-D Section 6.3 and 6.9.
Leukemia inhibitory factor FUJIFILM Wako 125-05603 Section 4.3. No unit concentration data is supplied by the provider. Used 1,000-fold dilution in this protocol.
Neon Electroporation system Thermo Fisher MPK5000 Section 3.2, 4.5 and elsewhere. The system containes electroporation buffer as well used in section 3.2.
NucleoSpin Plasmid Transfection-grade Takara U0490B Section 1.6.
PD0325901 FUJIFILM Wako 162-25291 Section 4.3
PMSG ASKA Animal Health Section 6.1.
Tail lysis buffer Nacalai 06169-95 Section 5.5.
Trypsin-EDTA Nacalai 32777-15 Section 2.2 and elsewhere
V6.5 ESC - - ESC developed from B6J-129 F1 strain
X-ray irradiation device Hitachi MBR-1618R-BE Section 2.6.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  3. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  4. Oji, A., et al. CRISPR/Cas9 mediated genome editing in ES cells and its application for chimeric analysis in mice. Scientific Reports. 6, 31666 (2016).
  5. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  6. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nature Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  7. Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
  8. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336 (6197), 348-352 (1988).
  9. Johnson, R. S., et al. Targeting of nonexpressed genes in embryonic stem cells via homologous recombination. Science. 245 (4923), 1234-1236 (1989).
  10. Hasty, P., Ramires-Solis, R., Krumlauf, R., Bradley, A. Introduction of a subtle mutation into the Hox-2.6 locus in embryonic stem cells. Nature. 350 (6315), 243-246 (1991).
  11. Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. Gene targeting in mouse embryonic stem cells via CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) mediated genome editing. Genome Editing in Animals - Methods and Protocols 2nd edition. Hatada, I. , (2022).
  12. Yagi, M., et al. Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation. Nature. 548 (7666), 224-227 (2017).
  13. Gassmann, M., Donoho, G., Berg, P. Maintenance of an extrachromosomal plasmid vector in mouse embryonic stem cells. Proceedings of National Academy of Sciences. 92 (5), 1292-1296 (1995).
  14. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322 (5903), 949-953 (2008).
  15. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  16. Hu, M., et al. Efficient production of chimeric mice from embryonic stem cells injected into 4- to 8-cell and blastocyst embryos. Journal of Animal Science and Biotechnology. 4 (1), 1-7 (2013).
  17. Guo, J., et al. Contribution of Mouse Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Chimeras through Injection and Coculture of Embryos. Stem Cells International. 2014, 409021 (2014).
  18. Bodai, Z., Bishop, A. L., Gantz, V. M., Komor, A. C. Targeting double-strand break indel byproducts with secondary guide RNAs improves Cas9 HDR-mediated genome editing efficiencies. Nature Communications. 13 (1), 2351 (2022).
  19. Kobayashi, T., Goto, T., Oikawa, M., Sanbo, M., Yoshida, F., Terada, R., Niizeki, N., Kajitani, N., Kazuki, K., Kazuki, Y., Hochi, S., Nakauchi, H., Surani, A., Hirabayashi, M. Blastocyst complementation using Prdm14-deficient rats enables efficient germline transmission and generation of functional mouse spermatids in rats. Nature Communications. 12 (1), 1328 (2021).
  20. Miura, K., Matoba, S., Hirose, M., Ogura, A. Generation of chimeric mice with spermatozoa fully derived from embryonic stem cells using a triple-target CRISPR method for Nanos3. Biology of Reproduction. 104 (1), 223-233 (2021).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 186
CRISPR/Cas9-medieret højeffektiv genmålretning i embryonale stamceller til udvikling af genmanipulerede musemodeller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M.… More

Ozawa, M., Emori, C., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models. J. Vis. Exp. (186), e64385, doi:10.3791/64385 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter