Developmental Biology
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
CRISPR/Cas9-medieret højeffektiv genmålretning i embryonale stamceller til udvikling af genmanipulerede musemodeller
Chapters
Summary August 24th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en protokol for udvikling af genetisk modificerede musemodeller ved hjælp af embryonale stamceller, især til stor DNA-knock-in (KI). Denne protokol er indstillet ved hjælp af CRISPR / Cas9 genomredigering, hvilket resulterer i signifikant forbedret KI-effektivitet sammenlignet med den konventionelle homologe rekombinationsmedierede lineariserede DNA-målretningsmetode.
Transcript
At producere genetisk modificerede mus og analysere deres fænotype gør det muligt for os at forstå specifikke genfunktioner i detaljer in vivo. Talrige vigtige fund er blevet afdækket ved hjælp af genmodificerede dyremodeller. Den metode, vi beskriver her, gør det muligt for langt DNA at implantere stamceller med acceptabel effektivitet uden lægemiddelvalg.
Teknikken er ikke kun gavnlig for grundlæggende biovidenskab, men resultaterne vil også blive implementeret i anvendte videnskaber som medicinsk videnskab og husdyrvidenskab. Demonstrerer proceduren vil være Dr. Chihiro Emori, en adjunkt, og Dr.Manabu Ozawa, en lektor fra mit laboratorium. Efter tilberedning af musens embryonale fibroblast skal du forberede den gelatinebelagte cellekulturskål som beskrevet i manuskriptet og inkubere den i to timer i en fugtig inkubator.
Gelatineopløsningen fjernes, opvaskes to gange med PBS, og den opbevares ved stuetemperatur indtil brug. Optø mitotisk inaktiveret frossen MEF-bestand ved hjælp af et vandbad hærdet ved 37 grader Celsius i et minut. En dag før ESC-såning placeres MEF på en gelatinebelagt 60 millimeter skål.
Tø et frossent ESC-lagerrør som vist tidligere vist, og læg en gange 10 til den femte ESC'er på en 60 millimeter skål indeholdende forsået MEF. Tilsæt derefter fire milliliter ESC-kulturmedium og inkuber skålen, indtil ESC når 50 til 70% sammenløb. Efter vask af den dyrkede ESC med fire milliliter PBS, fordøjes dem med 800 mikroliter 0,25% trypsin EDTA-opløsning i fem minutter ved 37 grader Celsius.
Når trypsinen er inaktiveret med en milliliter ESCM, tilsættes en milliliter frisk ESCM til cellerne, overføres mediet til et rør og pelleteres cellerne ved centrifugering ved 280 G i fem minutter. Efter at have resueret cellerne i en milliliter frisk ESCM, tælles cellekoncentrationen ved hjælp af en celletæller med trypanblå farvning. Efter at have overført en gang 10 til den femte ESC'er til et nyt 1,5 milliliter rør og vasket dem tre gange med PBS ved centrifugering, suspenderer ESC-pelleten i 12 mikroliter Cas9 RNP DNA-blanding og blandes godt ved blid pipettering for at undgå boblende.
Server derefter den suspenderede ESC til elektroporation. Derefter dyrkes de elektroporerede ESC'er i en 60 millimeter skål indeholdende fire milliliter ECSM med mitotisk inaktiveret MEF og fortsætter med at skifte medium dagligt. Tre til fem dage efter elektroporationen vaskes ESC'erne med fire milliliter PBS og fordøjes derefter med 800 mikroliter 0,25% trypsin EDTA og kultur i en fugtig inkubator.
Derefter tilsættes to milliliter ESCM for at stoppe trypsinfordøjelsen. Når celleblandingen er pelleteret, suspenderes pelleten i en milliliter frisk ESCM og tælles cellekoncentrationen ved hjælp af en celletæller med trypanblå farvning. Passage af ESC'erne på en gang 10 til de tredje celler pr. 60 millimeter skål indeholdende ESCM og feeder MEF.
Sørg for at skifte mediet, indtil kolonien tager til. Fem til syv dage efter den første passage, når ESCM er aspireret fra ESC-kulturskålen, tilsættes fire milliliter PBS. Brug en 20-mikroliter pipette til at hente enkelte ESC-kolonier med fem mikroliter PBS under et stereomikroskop.
De enkelte kolonier anbringes i en brønd med en rundbundet 96-brøndplade indeholdende 15 mikroliter 0,25% trypsin EDTA-opløsning. Efter inkubation af 96-brøndspladen skal trypsinfordøjelsen stoppes ved at tilsætte 80 mikroliter ESCM og adskille ESC-kolonier i enkeltceller ved pipettering. Til PCR-genotypning overføres 40 mikroliter ESC-suspension til en gelatinebelagt, feederfri 96-brøndplade indeholdende 50 mikroliter ESCM pr. Brønd.
For at fremstille det frosne ESC-lager overføres de resterende 60 mikroliter ESC-suspension til en brønd af en gelatinebelagt 24-brøndplade indeholdende 500 mikroliter ESCM og feeder MEF. Lager individuelle ESC-kloner dyrket i 24-brøndspladen, indtil de når 60 til 80% sammenløb og genvinder individuelle ESC-kloner ved trypsinisering, som vist tidligere. Efter opnåelse af cellepellet ved centrifugering resuspenderes de i 500 mikroliter cellefrysningsmedium for at fryse cellerne ved minus 80 grader Celsius.
Til PCR-genotypning skal du dyrke ESC-kloner som vist tidligere og fjerne ESCM fra hver brønd ved aspiration, før du vasker den med 100 mikroliter PBS to gange. Efter aspirering af PBS tilsættes 100 mikroliter lysisbuffer indeholdende proteinase K og blandes godt. Overfør nu ESC-lysatet til et nyt 1,5 milliliter rør og opbevar det i et varmekammer ved 65 grader Celsius i mindst en time.
Når det genomiske DNA er opløst i 20 mikroliter DNase-frit vand, bestemmes renheden og koncentrationen af DNA ved hjælp af et spektrofotometer. Efter at have udført genomisk PCR ved hjælp af locus-specifikke primersæt til at forstærke målområdet, skal du kontrollere sekvensen og vælge ESC-klonerne med de ønskede knock-in-sekvenser. Efter parring af de hormonbehandlede hunner med ICR-hannerne og opsamling af ovidukten, anbringes de opsamlede ovidukter i FHM-dråber og genvinder de tocellede eller firecellede faseembryoner ved at skylle ovidukten med FHM ved hjælp af en skyllenål indsat i infundibulum.
Vask de opsamlede embryoner ved at flytte dem i flere friske FHM-dråber ved hjælp af en mundpipette. Kultur embryonerne i 50 mikroliter KSOM-dråber på en 35-millimeter cellekulturskål dækket med mineralolie som vist tidligere i en dag, indtil ottecelle- eller morulastadiet er nået. Forbered glaspipetter til at holde embryonerne og ESC-injektion ved hjælp af en trækker og mikroforge.
Når du har integreret en holdepipetette indeholdende FHM i en kapillærholder, der er forbundet til en mikroinjektor, skal du sætte den op på venstre side af mikromanipulatoren. Tilslut en injektionspipette til en anden mikroinjektor, og sæt den op på højre side. Juster de to pipetter lige i mikroskopets synsfelt.
Lav fem mikroliter dråber 12% polyvinylpyrrolidon og fem mikroliter dråber FHM på det samme låg af en 60 millimeter skål, side om side. Dæk dråberne med mineralolie. Overfør embryonerne i fem mikroliter FHM-dråbe, og tilsæt en til fem mikroliter ESC-suspensionen til det embryoholdige FHM-dråbe.
Når injektionspipetten er vasket med polyvinylpyrrolidon, flyttes injektionspipetten til dråben, der indeholder embryoner og ESC'er. Vælg tre individuelle ESC-dubletter, der netop har afsluttet deres celledeling i injektionspipetten. Brug holdepipetten til at holde et ottecelle- eller morula-stadiumembryo, der er afsluttet komprimering ved aspiration, og lav et hul i zona pellucida med en piezoelektrisk puls.
Udvis den sekscellede ESC inde i zona pellucida og træk pipetten ud af embryonerne. Vask de ESC-injicerede embryoner med flere KSOM-dråber forsigtigt ved hjælp af en mundpipette og inkuber dem i en ny 50-mikroliter KSOM-dråbe dækket med mineralolie, som vist tidligere, indtil embryonerne udviklede sig til blastocyststadiet. En PCR-amplikon af størrelse, der er specifik for knock-in-målet, opnås, og 9 ud af 22 kloner viste et knock-in-specifikt bånd.
Disse resultater er effektive og reproducerbare til genindføring uden valg af lægemidler. Afhentning af den optimale størrelse af ESC-kolonier er ret vigtig for denne procedure. Undgå at vælge kolonier, der er for store eller for små.
CRISPR Cas9-medieret direkte genomredigering ved hjælp af en zygote ville være anvendelig til fremstilling af enkle gen-knockout-mus. Denne CRISPR Cas9-medierede ESC-genmålretningsprotokol letter produktionen af forskellige genetisk modificerede mus til fremtidig analyse inden for biovidenskab.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
