左冠状动脉结扎术：心肌梗死的外科小鼠模型

Summary

这里介绍的是小鼠左冠状动脉永久结扎的外科手术。该模型可用于研究心肌梗死后的病理生理学和相关炎症反应。

Abstract

缺血性心脏病和随后的心肌梗塞（MI）是美国和世界各地死亡的主要原因之一。为了探究心肌梗死后的病理生理变化并设计未来的治疗方法，需要心肌梗死的研究模型。小鼠左冠状动脉（LCA）的永久性结扎是研究心肌梗死后心脏功能和心室重塑的流行模型。在这里，我们描述了一种侵入性较小、可靠且可重复的手术鼠 MI 模型，通过永久连接 LCA。我们的手术模式包括易于逆转的全身麻醉、不需要气管切开术的气管插管和开胸术。应进行心电图和肌钙蛋白测量以确保心肌梗死。 心肌梗死后第 28 天的超声心动图可识别心功能和心力衰竭参数。心脏纤维化的程度可以通过Masson的三色染色和心脏MRI进行评估。该心肌梗死模型有助于研究心肌梗死后的病理生理和免疫学改变。

Introduction

心血管疾病是一个重大的公共卫生问题，每年夺走1790万人的生命，占^{全球死亡率的}31%1。最普遍的心血管异常类型是冠心病，心肌梗塞（MI）是冠^{心病的主要}表现之一2。心肌梗死通常是由脆弱斑块破裂引起的冠状动脉血栓闭塞引起的³.由此产生的缺血导致受影响的心肌发生深刻的离子和代谢变化，以及收缩功能的快速下降。心肌梗死导致心肌细胞死亡，可进一步导致心室功能障碍和心力衰竭⁴。

由于从MI⁵患者获得的组织稀缺，对患者心肌梗死的研究有限。因此，MI的小鼠模型可用于研究疾病机制以及开发潜在的治疗靶点。目前可用的MI小鼠模型包括不可逆缺血模型（LCA和消融方法）和再灌注模型（缺血/再灌注，I / R）⁶。小鼠左冠状动脉（LCA）的永久性结扎是最常用的方法，它模仿患者⁷，^8，9中MI的病理生理学和免疫学。永久性心肌梗死也可以通过消融方法诱发，包括电损伤或冷冻损伤。消融方法能够在精确位置¹⁰产生均匀大小的梗死。另一方面，瘢痕形成、梗死形态和分子信号传导机制可能因消融方法而异^10，11。鼠I/R方法是另一个重要的MI模型，因为它代表了再灌注治疗的临床场景¹²。I/R 模型存在各种挑战，例如梗死大小可变、难以区分初始损伤的反应和再灌注⁶。

虽然被广泛使用，但LCA结扎方法与低生存率和术后疼痛有关¹³。该协议展示了LCA结扎的小鼠手术MI模型，该模型涉及小鼠的准备和插管，LCA结扎，术后护理和MI的验证。 该方法不使用侵入性气管切开术¹⁴，而是采用气管插管。通过使用喉镜照亮口咽来对动物进行插管，使手术更容易、更安全、创伤更小¹⁵.在整个过程中，小鼠保持在呼吸机支持下并在异氟醚麻醉下。此外，进行超声心动图和Masson三色染色分别评估心肌梗死后的心脏功能和心肌纤维化。总体而言，该方法提供了一种可靠且可重复的MI手术鼠模型，可用于研究MI后的病理生理学和炎症。

Protocol

本研究方案由匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准。8只（假n = 4和MI n = 4）体重24-30g的1岁雌性C57BL / 6J小鼠用于这些实验。大约100%和至少80%的小鼠分别在前24小时和28天内存活。

1.小鼠的准备和气管插管

1. 将珠子灭菌器（见 材料表）预热至250°C，并将高压灭菌的手术器械放入其中几分钟。
2. 在含有3%异氟醚和1L / min氧气的诱导室中麻醉小鼠5分钟。
3. 通过检查对坚硬的脚趾捏的反应来确保鼠标的麻醉深度。
4. 称量小鼠以估计术前镇痛药丁丙诺啡（0.1mg / kg）的剂量。在Perperion内注射药物。
5. 使用电动剃须刀修剪胸部左侧的皮毛。
6. 此后用聚维酮碘和70%乙醇消毒手术部位三次。
7. 将鼠标仰卧放在倾斜板上。分别使用连接到上门牙和胶带的松紧带固定鼠标的头部和四肢。在麻醉下将无菌眼科润滑剂涂抹在眼睛上，以防止眼睛干燥。
8. 打开下颌，轻轻地将舌头拉出口腔。
9. 通过使用喉镜照亮口咽来识别喉部的开口（ 材料表）。
10. 从 24 G 导管针头上切下约 0.5 厘米，然后将钝针插入塑料防护罩中。将带有塑料护罩的钝针引导至气管中。取出针头，将塑料护罩留在气管中。
11. 将呼吸机（见 材料表）设置为每分钟137次的呼吸频率（针对本研究中使用的小鼠进行了优化），潮气量为0.18 cc。将呼吸器管连接到导管护罩，并通过寻找与呼吸机同步的胸部运动来确认插管正确。
12. 断开呼吸管与导管护罩的连接，并将动物仰卧在预热的温控手术板上。将鼠标重新连接到呼吸机。

2.左冠状动脉永久性结扎

1. 用聚维酮碘和70%酒精消毒手术部位。使用在中心有一个四分之一大小的孔的无菌窗帘，以固定手术部位。用一对镊子轻轻提起皮肤，用一把手术剪刀沿着左胸大肌和小胸肌之间的线做一个小（1.5-2厘米）的皮肤横向切口。
   注意：剪刀用于切口，因为它提供了对切割深度和方向的必要控制。
2. 用镊子和解剖剪刀分开下面的胸大肌。使用连接到松紧带的牵开器分离肌肉。
3. 按照胸腔的自然角度，用一把微型剪刀在第三肋间隙做一个切口。在这个阶段，必须格外小心，以防止对心脏和肺部造成伤害。
4. 使用牵开器轻轻地将肋骨分开，露出左心室。将心包脂肪移到一边并找到LCA，LCA从左心房边缘向心脏顶点延伸。
5. 传球8-0在持针器的帮助下，在LCA下进行尼龙缝合。用双结结连接LCA，然后打第二个结（改良的外科医生结）。
   注意：左下心室的漂白确认LCA结扎成功。除此之外，还建议进行肌钙蛋白测量、心电图监测（ST 段抬高）、超声/体内 心脏门控 MRI 或显微 CT 图像，以确认类似的心肌梗死病变。
6. 取下牵开器并将 22 G 导管针插入胸腔。取下针头，将塑料护罩的尖端留在胸腔中。使用4-0尼龙缝合线关闭胸腔。
7. 将注射器连接到22 G塑料护罩，并通过轻轻按压胸部以建立负气压来缓慢去除困在胸腔中的多余空气。取下塑料防护罩。
8. 用4-0尼龙缝合线闭合皮肤。
9. 关闭异氟醚供应。在这个阶段，小鼠在呼吸机上供氧。

3. 术后护理

1. 一旦自主呼吸开始，请关闭呼吸机。
   注意：从准备小鼠到此步骤，每只动物大约需要30-35分钟。
2. 将鼠标放在加热灯下并监视它，直到它唤醒。在动物恢复足够的意识以维持胸骨卧位之前，不应无人看管。
3. 手术后，将动物放在单独的笼子里，只有在完全康复后才能将其与其他动物一起放回原来的笼子。
4. 每天监测鼠标是否有任何疼痛或不适的迹象。
5. 手术后每6-8小时继续腹腔注射丁丙诺啡（0.1mg / kg），再持续2天。

4. 超声心动图评估

注意：心动图在心肌梗死后第28天进行超声心动图以评估心力衰竭的参数。

1. 手术后28天后，用3%异氟醚和1L / min氧气麻醉小鼠，在眼睛上涂抹无菌眼科润滑剂，并使用脱毛膏去除胸毛。用聚维酮碘和70%乙醇消毒胸部区域三次。
2. 将麻醉小鼠固定在成像平台（参见 材料表）顶部仰卧位，并在整个过程中使用连接到麻醉系统的鼻锥（1%-2%异氟醚和1L / min氧气）保持稳定的麻醉水平。
3. 用电极凝胶将四个爪子粘在心电图电极上（见 材料表）。通过插入直肠探针监测动物的温度（见 材料表）。
4. 将扫描凝胶（见 材料表）涂在胸部，垂直放置换能器，将其降低到胸骨旁线（平行于胸部），逆时针旋转35°以获得左心室的胸骨旁长轴视图。
5. 点击成像软件上的 B模式 成像按钮（参见 材料表）以获得心脏的完整长轴视图。调整浇口尺寸和亮度，并使用“保存剪辑”或 “ 保存 帧”保存 图像以供以后测量¹⁶.
6. 切换到 M 模式（运动模式）并将 M 模式轴放置在肌水平。调整浇口尺寸，然后点击 M 模式开始按钮。使用“保存剪辑”或“保存帧^16，17”保存图像。
7. 由于4D模式图像采集过程是自动化的，因此在获取数据之前，请验证ECG和呼吸信号是否有效（图1）。
8. 开始在 B 模式下获取数据。打开4D扫描面板并启动3D电机。在4D扫描面板中设置图像参数，然后点击 扫描 按钮开始扫描。在 2D 视图中查看图像后，使用加载到 4D 按钮将图像加载 到 4D 模式。

Representative Results

图1显示了假（图1A）和MI（图1B）小鼠超声心动图评估期间的代表性主动心电图和呼吸信号。在获取超声心动图数据之前，验证主动心电图和呼吸信号很重要。 图2显示了LCA结扎后28天心脏功能参数的超声心动图测量。图 2 显示了假心脏（图 2A）和 MI（图 2B）心脏的胸骨旁短轴视图的 M 模式图像。图2B显示了LCA结扎后有缺陷的心壁运动。与假手术组相比，MI组观察到心力衰竭的指标，例如左心室质量增加（图2C），射血分数降低（图2D）和心输出量减少（图2E）。

所有动物都根据标准方案使用过量的CO₂ 气体实施安乐死。将心脏固定并在最佳切割温度（OCT）化合物中冷冻。对三个不同的心室部分（下、中、上）进行了 Masson 的三色染色 18，并使用研究载玻片扫描仪在¹⁰ 倍放大镜下拍摄图像以检查心脏纤维化程度。 图3 显示梗死心脏中的胶原蛋白染色（蓝色）增加，表明纤维化增强。

图 1：超声心动图评估期间的主动心电图和呼吸信号。在（A）假和（B）MI小鼠的超声心动图评估期间具有代表性的主动心电图和呼吸信号。绿色 = 心电图信号，黄色 = 呼吸信号。请点击此处查看此图的大图。

图2：手术后第28天LCA结扎后心脏功能参数的超声心动图评估。（A）假小鼠和（B）MI小鼠的代表性胸骨旁短轴（PSAX）M型超声心动图图像。评估假心肌梗死小鼠的（C）左心室质量（mg），（D）射血分数（%）和（E）心输出量（mL / min）。 LVAW;d = 舒张期左心室前壁厚度;LVAW;s = 收缩期左心室前壁厚度;LVPW;d = 左心室后壁厚度（舒张期）;LVPW;s = 收缩期左心室后壁厚度;左心室;d = 左心室内径舒张;LVID;s = 左心室内径收缩期。数据显示为标准偏差±平均值* P < 0.05，** P < 0.01，**** P < 0.0001。请点击此处查看此图的大图。

图3：手术后第28天LCA结扎后的纤维化评估。 代表性图像显示手术后 28 天 Masson 的 （A） 假心脏和 （B） MI 心脏的三色染色。梗死心脏的纤维化区域的特征是胶原蛋白沉积，并在马森三色染色后染成蓝色。比例尺 = 500 μm。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

MI的小鼠模型在心血管研究实验室中越来越受欢迎，本研究描述了一种可重复且临床相关的MI模型。该协议以多种方式改进了LCA连接过程。首先，避免使用可注射的术前麻醉剂，例如甲苯噻嗪/氯胺酮或戊巴比妥钠^14，15 。仅使用异氟醚麻醉，这有助于提高动物存活率（术后28天存活率为>80%），最大限度地减少药物引起的并发症，并且与其他药物相比，心脏影响最小¹⁹。然而，异氟醚也确实减缓了心脏，尽管与其他麻醉剂相比程度较低²⁰。该方案涉及侵入性较小的气管插管，避免气管切开^术21，从而减轻术后疼痛和不适。既往小鼠 LCA 结扎研究建议做颈部中部切口以改善气管插管的可视化;然而，目前的协议使用喉镜来照亮口咽¹⁵。Lugrin等人最近展示了没有胸腔穿刺术的小鼠LCA MI模型¹⁴;然而，目前的方案包括有效的胸腔穿刺术，这将有助于从胸腔中去除多余的血液和空气，预防气胸¹⁹。此外，该方法使用无菌纱布代替烧灼器进行出血管理，因为使用烧灼器减少出血会导致医源性灼伤并可能改变炎症读数²¹。

该手术模型的关键步骤之一是LCA的识别和结扎。冠状动脉的位置可能因小鼠品系和基因型⁹ 而异。在大多数情况下，动脉在显微镜下是不可见的。根据经验，在左心房边缘下方2-4毫米处结扎心肌组织可有效焯烫左心室壁。此外，可以简单地修改该程序以诱导暂时性心肌缺血，然后通过去除连接²²进行再灌注（I / R）。该动物模型模拟经皮冠状动脉介入治疗后心肌梗死患者冠状动脉血流的恢复^23，24。由于永久性LCA闭塞模型在几个方面与I / R模型不同，例如梗死区域的大小，梗死的位置和炎症细胞的浸润，因此研究人员在^{根据研究7}，^14，25选择相关模型时必须谨慎。

有多种方法可以确保 LCA 的成功结扎和随后的心肌梗死发展。 观察左下心室立即变白是 LCA 结扎成功的最早确认。除此之外，可以通过用埃文蓝或 2，3，5-三苯基氯化四唑 （TTC） 染色整个心脏来可视化心肌梗死的范围和位置²⁶。循环心肌肌钙蛋白的测量可以进一步验证心肌组织损伤²¹。心电图可用作确认 MI¹⁷ 后 ST 段升高的非侵入性方法。与心肌梗死相关的心脏纤维化程度可以通过 Masson 三色染色和心脏^{MRI 27，28，29} 进行评估。超声心动图可用于评估心肌梗死后第 1 天和第 28 天的心力衰竭参数。为了检查心肌梗死后的心脏重塑，可以使用马森的毛状体染色和超声心动图¹⁷。也可以使用 qPCR 和免疫印迹来进一步研究和确认与 MI¹⁴ 后纤维化、炎症和心力衰竭有关的基因和蛋白质的表达。

LCA结扎术的主要局限性是死亡率高，这可能是由于术后心律失常，心室破裂，出血，气胸和术后不适^19，30。然而，成功的胸腔穿刺术、尽量减少非靶标组织损伤以及适当的术后疼痛和体温管理可能有助于减少动物的死亡。与任何其他手术模型一样，精确的可重复性是该手术模型的另一个限制。然而，研究人员可以通过严格的实践和经验重现心肌梗死，控制梗死大小并提高手术后的生存率。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G catheter needle	Exel INT	26741	Thoracentesis
24 G catheter needle	Exel INT	26746	Endotracheal intubation
4-0 nylon suture	Covetrus	29263	Suturing of muscles and skin
8-0 nylon suture	S&T	3192	Ligation of LAD
Anesthetic Vaporizers	Vet equip	VE-6047	Anesthetic support
Animal physiology monitor	Fujifilm	VEVO 3100	Monitor heart rate,respiration rate and body temperature
Betadine solution	PBS animal health	11205	Antispetic
Buprenorphine	Covetrus	55175	Analgesic
Disecting microscope	OMANO	OM2300S-V7	Binocular
Electric razor	Wahl	79300-1001M	Shaving
Electrode gel	Parker Laboratories	W60698L	Electrically conductive gel
Ethanol	Decon Laboratories	22-032-601	Disinfectant
Forceps	FST	11065-07	Stainless Steel
Gauze	Curity	CAR-6339-PK	Sterile
Heat lamp	Satco	S4998	Post surgery care
Heating pad	Kent scientific	Surgi-M	Temperature control
Hot Bead sterilizer	Germinator 500	11503	Sterilization of surgical instrument
Isoflurane	Covetrus	29405	Anesthesia
Masson’s trichrome staining kit	Thermoscientific	87019	Measurement of cardiac Fibrosis
Micro Needle Holder	FST	12500-12	Stainless Steel
Micro scissors	FST	15000-02	Stainless Steel
Ophthalmic ointment	Dechra	Puralube Vet	Sterile occular lubricant
Scanning Gel	Parker Laboratories	Aquasonic 100	Aqueous ultrasound transmission gel
Scissors	FST	14060-11	Stainless Steel
Small Animal Laryngoscope	Penn-Century	Model LS-2-M	Illuminating the oropharynx
Small animal ventilator	Harvard apparatus	557058	Ventilator support
Surgical light	Cole parmer	41723	Illuminator Width (in): 7
Vevo 3100 preclinical imaging platform	Fujifilm	VEVO 3100	Echocardiography
VevoLAB software	Fujifilm	VevoLAB 3.2.6	Echocardiography data analysis