Summary
Presentato qui è una procedura chirurgica per la legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra nei topi. Questo modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia e la risposta infiammatoria associata dopo infarto miocardico.
Abstract
La cardiopatia ischemica e il successivo infarto miocardico (IM) sono una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti e in tutto il mondo. Al fine di esplorare i cambiamenti fisiopatologici dopo infarto miocardico e progettare trattamenti futuri, sono necessari modelli di ricerca di IM. La legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra (LCA) nei topi è un modello popolare per studiare la funzione cardiaca e il rimodellamento ventricolare post MI. Qui descriviamo un modello di MI murino chirurgico meno invasivo, affidabile e riproducibile mediante legatura permanente dell'LCA. Il nostro modello chirurgico comprende un'anestesia generale facilmente reversibile, un'intubazione endotracheale che non richiede una tracheotomia e una toracotomia. L'elettrocardiografia e la misurazione della troponina devono essere eseguite per garantire l'infarto miocardico. L'ecocardiografia al giorno 28 dopo l'infarto miocardico discernerà la funzione cardiaca e i parametri di insufficienza cardiaca. Il grado di fibrosi cardiaca può essere valutato dalla colorazione tricromatica di Masson e dalla risonanza magnetica cardiaca. Questo modello di MI è utile per studiare le alterazioni fisiopatologiche e immunologiche dopo l'infarto miocardico.
Introduction
Le malattie cardiovascolari sono una delle principali preoccupazioni per la salute pubblica che mietono 17,9 milioni di vite ogni anno, rappresentando il 31% della mortalità globale1. Il tipo più diffuso di anomalia cardiovascolare è la malattia coronarica e l'infarto miocardico (MI) è una delle principali manifestazioni della malattia coronarica2. L'infarto miocardico è solitamente causato dall'occlusione trombotica di un'arteria coronaria dovuta alla rottura di una placca vulnerabile3. L'ischemia risultante provoca profondi cambiamenti ionici e metabolici nel miocardio interessato, nonché una rapida diminuzione della funzione sistolica. L'infarto miocardico provoca la morte dei cardiomiociti, che può ulteriormente portare a disfunzione ventricolare e insufficienza cardiaca4.
La ricerca sull'infarto miocardico nei pazienti è limitata a causa della scarsità di tessuti ottenuti da pazienti con infartomiocardico 5. Pertanto, i modelli murini di infarto miocardico sono utili sia nello studio dei meccanismi della malattia che nello sviluppo di potenziali bersagli terapeutici. I modelli murini di IM attualmente disponibili includono modelli di ischemia irreversibile (LCA e metodi di ablazione) e modelli di riperfusione (ischemia/riperfusione, I/R)6. La legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra (LCA) nei topi è il metodo più utilizzato e imita la fisiopatologia e l'immunologia dell'infarto miocardico nei pazienti 7,8,9. L'infarto miocardico permanente può anche essere indotto da metodi di ablazione, che comportano danni elettrici o criolesioni. I metodi di ablazione sono in grado di generare infarto di dimensioni uniformi nella posizione precisa10. D'altra parte, la formazione di cicatrici, la morfologia dell'infarto e i meccanismi di segnalazione molecolare possono variare tra i metodi di ablazione10,11. Il metodo I/R murino è un altro importante modello di MI in quanto rappresenta lo scenario clinico della terapia di riperfusione12. Il modello I/R è associato a sfide quali una dimensione variabile dell'infarto, difficoltà nel distinguere le risposte della lesione iniziale e riperfusione6.
Sebbene ampiamente utilizzati, i metodi di legatura LCA sono associati a bassi tassi di sopravvivenza e dolore post-operatorio13. Questo protocollo dimostra il modello di infarto miocardico chirurgico murino della legatura LCA che prevede la preparazione e l'intubazione dei topi, la legatura LCA, la cura post-operatoria e la convalida dell'infarto miocardico. Piuttosto che utilizzare una tracheotomia invasiva14, questo metodo impiega l'intubazione endotracheale. L'animale viene intubato illuminando l'orofaringe usando un laringoscopio, rendendo la procedura più facile, più sicura e meno traumatica15. Il topo viene tenuto sul supporto del ventilatore e in anestesia isoflurana durante tutta la procedura. Inoltre, l'ecocardiografia e la colorazione tricromatica di Masson vengono eseguite per valutare rispettivamente la funzione cardiaca e la fibrosi cardiaca dopo l'infarto miocardico. Nel complesso, questo metodo fornisce un modello murino chirurgico affidabile e riproducibile di MI che può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia e l'infiammazione dopo l'infarto miocardico.
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Protocol
Il presente protocollo di studio è stato esaminato e approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Pittsburgh. Per questi esperimenti sono stati utilizzati otto topi femmina C57BL / 6J di 1 anno del peso di 24-30 g. Circa il 100% e almeno l'80% dei topi sono sopravvissuti rispettivamente nelle prime 24 ore e 28 giorni.
1. Preparazione e intubazione endotracheale dei topi
- Preriscaldare uno sterilizzatore a sfere (vedere Tabella dei materiali) a 250 °C e posizionarvi strumenti chirurgici autoclavati per alcuni minuti.
- Anestetizzare il topo in una camera di induzione con isoflurano al 3% e 1 L/min di ossigeno per 5 min.
- Garantire la profondità dell'anestesia nel mouse controllando la risposta a un pizzico fermo del dito.
- Pesare il topo per stimare il dosaggio del farmaco analgesico preoperatorio, buprenorfina (0,1 mg/kg). Iniettare il farmaco per via intraperitoniale.
- Taglia la pelliccia sul lato sinistro del torace usando un rasoio elettrico.
- Disinfettare il sito chirurgico con povidone-iodio e etanolo al 70% tre volte.
- Posizionare il mouse in posizione supina su una tavola inclinata. Fissare la testa e gli arti del mouse utilizzando una fascia elastica attaccata rispettivamente agli incisivi superiori e al nastro adesivo. Applicare lubrificante oftalmico sterile sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Apri la mascella e tira delicatamente la lingua fuori dalla cavità orale.
- Identificare l'apertura della laringe illuminando l'orofaringe usando un laringoscopio (vedere Tabella dei materiali).
- Tagliare circa 0,5 cm da un ago del catetere da 24 G e inserire l'ago smussato nello schermo di plastica. Dirigere l'ago smussato con lo scudo di plastica nella trachea. Estrarre l'ago, lasciando lo scudo di plastica nella trachea.
- Impostare il ventilatore (vedi Tabella dei materiali) su una frequenza respiratoria di 137 battiti al minuto (ottimizzata per i topi utilizzati in questo studio) e volume corrente 0,18 cc. Collegare i tubi del respiratore allo schermo del catetere e confermare la corretta intubazione cercando un movimento toracico sincronizzato con il ventilatore.
- Scollegare il tubo del respiratore dalla protezione del catetere e posizionare l'animale in posizione supina su una tavola chirurgica preriscaldata a temperatura controllata. Ricollegare il mouse al ventilatore.
2. Legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra
- Disinfettare il sito chirurgico con povidone-iodio e alcool al 70%. Applicare un drappo sterile con un foro di dimensioni quarte al centro per fissare il sito chirurgico. Sollevare delicatamente la pelle con un paio di pinze e praticare una piccola incisione trasversale cutanea (1,5-2 cm) lungo la linea tra i muscoli pettorali maggiori e minori sinistro usando un paio di forbici chirurgiche.
NOTA: Le forbici sono state utilizzate per eseguire l'incisione in quanto fornisce il controllo richiesto sulla profondità e sulla direzione del taglio. - Separare i muscoli pettorali sottostanti con una pinza e forbici da dissezione. I muscoli sono stati separati usando divaricatori attaccati a elastici.
- Fai un'incisione nel terzo spazio intercostale con un paio di micro forbici seguendo l'angolo naturale della gabbia toracica. In questa fase, è necessario prestare estrema attenzione per prevenire lesioni al cuore e ai polmoni.
- Allungare delicatamente le costole usando i divaricatori per esporre il ventricolo sinistro. Spostare il grasso pericardico da parte e individuare l'LCA, che corre dal bordo dell'atrio sinistro verso l'apice del cuore.
- Passa un 8-0 sutura di nylon sotto l'LCA con l'aiuto di un portaaghi. Ligare la LCA con un doppio nodo seguito da un secondo nodo (un nodo del chirurgo modificato).
NOTA: Lo sbiancamento del ventricolo inferiore sinistro conferma una legatura LCA di successo. Oltre a questo, si consiglia anche la misurazione della troponina, il monitoraggio ECG (elevazione ST), la risonanza magnetica eco/cardio-dipendente in vivo o le immagini micro-CT per confermare le lesioni MI comparabili. - Rimuovere i divaricatori e inserire un ago da catetere da 22 G nella cavità toracica. Rimuovere l'ago, lasciando la punta dello scudo di plastica nella cavità toracica. Chiudere la gabbia toracica utilizzando una sutura di nylon 4-0.
- Collegare una siringa allo schermo di plastica da 22 G e rimuovere lentamente l'aria in eccesso intrappolata nella cavità toracica premendo delicatamente il torace per stabilire una pressione dell'aria negativa. Rimuovere lo scudo di plastica.
- Chiudere la pelle con una sutura di nylon 4-0.
- Spegnere l'alimentazione di isoflurano. In questa fase, il mouse è sul ventilatore che fornisce ossigeno.
3. Assistenza post-operatoria
- Spegnere il ventilatore una volta iniziata la respirazione spontanea.
NOTA: La procedura richiede circa 30-35 minuti per animale dalla preparazione dei topi fino a questa fase. - Tenere il mouse sotto una lampada di calore e monitorarlo fino a quando non è sveglio. L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non ha recuperato abbastanza coscienza per mantenere la recumbency sternale.
- Dopo l'intervento chirurgico, posizionare l'animale in una gabbia separata e riportarlo nella gabbia originale con altri animali solo dopo che si è completamente ripreso.
- Monitorare il mouse quotidianamente per qualsiasi segno di dolore o disagio.
- Continuare l'iniezione intraperitoneale di buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 6-8 ore per altri 2 giorni dopo l'intervento.
4. Valutazione ecocardiografica
NOTA: L'ecocardiografia è stata eseguita per valutare i parametri di insufficienza cardiaca il giorno 28 dopo l'infarto miocardico.
- Dopo 28 giorni dall'intervento, anestetizzare i topi con il 3% di isoflurano e 1 L/min di ossigeno, applicare un lubrificante oftalmico sterile sugli occhi e rimuovere i peli del torace con una crema depilatoria. Disinfettare l'area del torace con povidone-iodio e etanolo al 70% tre volte.
- Assicurare i topi anestetizzati in cima alla piattaforma di imaging (vedi Tabella dei materiali) in posizione supina e mantenere un livello costante di anestesia durante tutta la procedura utilizzando un cono nasale collegato al sistema anestetico (1% -2% di isoflurano e 1 L / min di ossigeno).
- Fissare le quattro zampe agli elettrodi ECG con gel per elettrodi (vedere la tabella dei materiali). Monitorare la temperatura dell'animale inserendo una sonda rettale (vedi Tabella dei materiali).
- Applicare il gel di scansione (vedi Tabella dei materiali) sul torace, posizionare il trasduttore verticalmente, abbassarlo sulla linea parasternale (parallela al torace) e ruotare di 35° in senso antiorario per ottenere la vista dell'asse lungo parasternale del ventricolo sinistro.
- Toccare il pulsante di imaging in modalità B sul software di imaging (vedere Tabella dei materiali) per ottenere una visione completa dell'asse lungo del cuore. Regolare le dimensioni e la luminosità del cancello e salvare le immagini utilizzando Save Clip o Save Frame per misurazioni successive16.
- Passare alla modalità M (modalità movimento) e posizionare l'asse M-mode a livello del muscolo papillare. Regola le dimensioni del gate e tocca il pulsante M-mode Start. Salvate le immagini utilizzando Save Clip o Save Frame16,17.
- Poiché il processo di acquisizione delle immagini in modalità 4D è automatizzato, verificare che i segnali ECG e respirazione siano attivi (Figura 1) prima di acquisire i dati.
- Inizia ad acquisire i dati in B-Mode. Aprire il pannello di scansione 4D e avviare il motore 3D. Impostare i parametri dell'immagine nel pannello di scansione 4D e toccare il pulsante Scansione per iniziare la scansione. Dopo aver esaminato le immagini nella vista 2D, caricarle in modalità 4D utilizzando il pulsante Carica in 4D .
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Representative Results
La Figura 1 mostra i segnali rappresentativi attivi dell'ECG e della respirazione durante la valutazione ecocardiografica dei topi sham (Figura 1A) e MI (Figura 1B). La verifica dei segnali attivi ECG e respirazione è importante prima di acquisire i dati ecocardiografici. La Figura 2 mostra la misurazione ecocardiografica dei parametri funzionali cardiaci dopo 28 giorni dopo la legatura LCA. La Figura 2 mostra le immagini M-mode della vista para sternale dell'asse corto dei cuori sham (Figura 2A) e MI (Figura 2B). La Figura 2B mostra il movimento difettoso della parete cardiaca dopo la legatura LCA. Indicatori di insufficienza cardiaca, come aumento della massa LV (Figura 2C), diminuzione della frazione di eiezione (Figura 2D) e diminuzione della gittata cardiaca (Figura 2E), sono stati osservati nel gruppo MI rispetto al gruppo sham.
Tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia secondo protocolli standard utilizzando una dose eccessiva di gas CO2 . I cuori sono stati fissati e congelati in un composto di temperatura di taglio ottimale (OCT). La colorazione tricromatica18 di Masson è stata eseguita per tre diverse sezioni del ventricolo (inferiore, centrale e superiore) e le immagini sono state scattate utilizzando uno scanner di vetrini di ricerca con ingrandimento 10x per esaminare il grado di fibrosi cardiaca. La figura 3 mostra un aumento della colorazione del collagene (blu) nel cuore infartuato, indicando un aumento della fibrosi.
Figura 1: ECG attivo e segnali respiratori durante la valutazione ecocardiografica. Segnali rappresentativi attivi ECG e respirazione durante la valutazione ecocardiografica di topi (A) sham e (B) MI. Verde = segnali ECG, giallo = segnali respiratori. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Valutazione ecocardiografica dei parametri funzionali cardiaci dopo la legatura LCA il giorno 28 dopo l'intervento. Immagini ecocardiografiche rappresentative parasternali ad asse corto (PSAX) in modalità M di topi (A) sham e (B) MI. Valutazione di (C) massa ventricolare sinistra (mg), (D) frazione di eiezione (%) e (E) gittata cardiaca (ml/min) di sham e topi con IM. LVAW;d = spessore della parete anteriore ventricolare sinistra in diastole; LVAW;s = spessore della parete anteriore ventricolare sinistra nella sistole; LVPW;d = spessore della parete posteriore ventricolare sinistra in diastole; LVPW;s = spessore della parete posteriore ventricolare sinistra nella sistole; LVID;d = diametro interno ventricolare sinistro in diastole; LVID;s = diametro interno ventricolare sinistro nella sistole. I dati sono indicati come media ± DS. * P < 0,05, ** P < 0,01, **** P < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Valutazione della fibrosi dopo legatura LCA il giorno 28 dopo l'intervento. Immagini rappresentative che mostrano la colorazione tricromatica di Masson di (A) finzione e (B) cuori MI 28 giorni dopo l'intervento. Le regioni fibrotiche nel cuore infartuato sono caratterizzate da deposizione di collagene e colorazione blu dopo la colorazione tricromatica di Masson. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il modello murino di infarto miocardico sta guadagnando popolarità nei laboratori di ricerca cardiovascolare e questo studio descrive un modello di infarto miocardico riproducibile e clinicamente rilevante. Questo protocollo migliora il processo di legatura LCA in diversi modi. Per cominciare, si evita l'uso di anestetici pre-operatori iniettabili come xilazina / ketamina o pentobarbital di sodio14,15. È stata utilizzata solo l'anestesia con isoflurano, che aiuta a migliorare i tassi di sopravvivenza degli animali (sopravvivenza del >80% 28 giorni dopo l'intervento), minimizzare le complicanze indotte dal farmaco e ha effetti cardiaci minimi rispetto ad altri agenti19. Tuttavia, l'isoflurano rallenta anche il cuore, anche se in misura inferiore rispetto ad altri agenti anestetici20. Questo protocollo prevede un'intubazione endotracheale meno invasiva evitando la tracheostomia21, che riduce il dolore e il disagio post-operatorio. Precedenti studi murini sulla legatura LCA hanno raccomandato di praticare un'incisione a metà collo per migliorare la visualizzazione dell'intubazione endotracheale; Tuttavia, il protocollo attuale utilizza invece un laringoscopio per illuminare l'orofaringe15. Lugrin et al. hanno recentemente dimostrato un modello murino di LCA MI senza toracentesi14; Tuttavia, l'attuale protocollo include un'efficace toracentesi, che aiuterà a rimuovere il sangue e l'aria in eccesso dalla cavità toracica, prevenendo il pneumotorace19. Inoltre, questo metodo utilizza garze sterili per la gestione del sanguinamento al posto di un cauterizzatore, poiché l'uso di un cauterizzatore per ridurre il sanguinamento può causare ustioni iatrogene e può alterare le letture infiammatorie21.
Uno dei passaggi critici in questo modello chirurgico è l'identificazione e la legatura della LCA. La posizione dell'arteria coronaria può variare a seconda dei ceppi di topo e dei genotipi9. Nella maggior parte dei casi, l'arteria non è visibile al microscopio. Per esperienza, legare il tessuto miocardico 2-4 mm sotto il bordo dell'atrio sinistro provoca un efficiente sbiancamento della parete ventricolare sinistra. Inoltre, la procedura può essere semplicemente modificata per indurre ischemia miocardica temporanea seguita da riperfusione (I / R) rimuovendo la legatura22. Questo modello animale imita il ripristino del flusso sanguigno coronarico nei pazienti con infarto miocardico dopo intervento coronarico percutaneo23,24. Poiché il modello di occlusione LCA permanente differisce dal modello I / R in diversi aspetti, come la dimensione dell'area infartuata, la posizione dell'infarto e l'infiltrazione delle cellule infiammatorie, i ricercatori devono essere cauti nella selezione del modello pertinente a seconda dello studio 7,14,25.
Esistono diversi approcci per garantire il successo della legatura dell'LCA e il successivo sviluppo dell'IM. Osservare l'immediato sbiancamento del ventricolo inferiore sinistro è la prima conferma del successo della legatura LCA. Oltre a questo, l'estensione e la posizione dell'infarto miocardico possono essere visualizzate colorando l'intero cuore con il blu di Evan o 2,3,5-trifeniltetrazolium cloruro (TTC)26. La misurazione della troponina cardiaca circolante può convalidare ulteriormente la lesione del tessuto miocardico21. L'elettrocardiografia può essere utilizzata come metodo non invasivo per confermare l'elevazione del segmento ST dopo MI17. Il grado di fibrosi cardiaca associata all'infarto miocardico può essere valutato mediante colorazione tricromatica di Masson e risonanza magnetica cardiaca27,28,29. L'ecocardiografia può essere utilizzata per valutare i parametri dell'insufficienza cardiaca nei giorni 1 e 28 dopo l'infarto miocardico. Per esaminare il rimodellamento cardiaco dopo l'infarto miocardico, è possibile utilizzare la colorazione dei tricomi e l'ecocardiografia di Masson17. È anche possibile utilizzare qPCR e immunoblot per indagare ulteriormente e confermare l'espressione dei geni e delle proteine implicati nella fibrosi, nell'infiammazione e nell'insufficienza cardiaca dopo MI14.
Il principale limite della legatura LCA è l'alta incidenza di mortalità, che potrebbe essere dovuta ad aritmie cardiache post-operatorie, rottura ventricolare, emorragia, pneumotorace e disagio post-operatorio19,30. Tuttavia, una toracentesi di successo, riducendo al minimo il danno tissutale non bersaglio, e una corretta gestione del dolore post-operatorio e della temperatura possono aiutare a ridurre la morte dell'animale. Come per qualsiasi altro modello chirurgico, l'esatta riproducibilità è un'altra limitazione di questo modello chirurgico. I ricercatori possono, tuttavia, riprodurre l'infarto miocardico, controllare le dimensioni dell'infarto e migliorare la sopravvivenza post-operatoria con una pratica e un'esperienza rigorose.
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Disclosures
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institute of Health (R01HL143967, R01HL142629, R01AG069399 e R01DK129339), AHA Transformational Project Award (19TPA34910142), AHA Innovative Project Award (19IPLOI34760566) e ALA Innovation Project Award (IA-629694) (a PD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter needle | Exel INT | 26741 | Thoracentesis |
| 24 G catheter needle | Exel INT | 26746 | Endotracheal intubation |
| 4-0 nylon suture | Covetrus | 29263 | Suturing of muscles and skin |
| 8-0 nylon suture | S&T | 3192 | Ligation of LAD |
| Anesthetic Vaporizers | Vet equip | VE-6047 | Anesthetic support |
| Animal physiology monitor | Fujifilm | VEVO 3100 | Monitor heart rate,respiration rate and body temperature |
| Betadine solution | PBS animal health | 11205 | Antispetic |
| Buprenorphine | Covetrus | 55175 | Analgesic |
| Disecting microscope | OMANO | OM2300S-V7 | Binocular |
| Electric razor | Wahl | 79300-1001M | Shaving |
| Electrode gel | Parker Laboratories | W60698L | Electrically conductive gel |
| Ethanol | Decon Laboratories | 22-032-601 | Disinfectant |
| Forceps | FST | 11065-07 | Stainless Steel |
| Gauze | Curity | CAR-6339-PK | Sterile |
| Heat lamp | Satco | S4998 | Post surgery care |
| Heating pad | Kent scientific | Surgi-M | Temperature control |
| Hot Bead sterilizer | Germinator 500 | 11503 | Sterilization of surgical instrument |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | Anesthesia |
| Masson’s trichrome staining kit | Thermoscientific | 87019 | Measurement of cardiac Fibrosis |
| Micro Needle Holder | FST | 12500-12 | Stainless Steel |
| Micro scissors | FST | 15000-02 | Stainless Steel |
| Ophthalmic ointment | Dechra | Puralube Vet | Sterile occular lubricant |
| Scanning Gel | Parker Laboratories | Aquasonic 100 | Aqueous ultrasound transmission gel |
| Scissors | FST | 14060-11 | Stainless Steel |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century | Model LS-2-M | Illuminating the oropharynx |
| Small animal ventilator | Harvard apparatus | 557058 | Ventilator support |
| Surgical light | Cole parmer | 41723 | Illuminator Width (in): 7 |
| Vevo 3100 preclinical imaging platform | Fujifilm | VEVO 3100 | Echocardiography |
| VevoLAB software | Fujifilm | VevoLAB 3.2.6 | Echocardiography data analysis |
References
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