Summary
Настоящий протокол описывает простой и эффективный метод переноса перфторалкильных кислот в пшенице на большие расстояния.
Abstract
Большое количество перфторалкильных кислот (PFAA) было введено в почву и накоплено растениями, создавая потенциальные риски для здоровья человека. Крайне важно исследовать накопление и транслокацию PFAA внутри растений. Транспортировка на большие расстояния является важным путем для PFAA, переносимых из листьев растений в съедобные ткани через флоэму. Однако ранее было трудно оценить транслокационный потенциал органического загрязнения в краткосрочном периоде воздействия. Эксперимент с расщепленным корнем обеспечивает решение для эффективного раскрытия дальней транслокации PFAA с использованием гидропонного эксперимента, который в этом исследовании проводился в двух 50 мл центрифужных трубок (A и B), из которых центрифужная трубка A имела 50 мл стерильного питательного раствора Hoagland в одну четверть, в то время как центрифужная трубка B имела такое же количество концентрации питательных веществ, и целевые ПФАА (перфтороктановая сульфоновая кислота, ПФОС и перфтороктановая кислота, ПФОК), добавленные в данной концентрации. Цельный пшеничный корень вручную разделяли на две части и аккуратно вставляли в трубки А и В. Концентрацию PFAA в корнях, побегах пшеницы и растворах в трубках A и B оценивали с использованием LC-MS/MS, соответственно, после культивирования в инкубаторе в течение 7 дней и сбора урожая. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ПФОК и ПФОС подвергаются аналогичному процессу переноса на большие расстояния через флоэму от побега к корню и могут высвобождаться в окружающую среду. Таким образом, метод расщепления корней может быть использован для оценки переноса различных химических веществ на большие расстояния.
Introduction
Перфторалкиловые кислоты (PFAA) широко используются в различных коммерческих и промышленных продуктах благодаря их превосходным физико-химическим свойствам, включая поверхностную активность и термическую и химическую стабильность 1,2,3. Перфтороктановая сульфоновая кислота (ПФОС) и перфтороктановая кислота (ПФОК) являются двумя наиболее важными PFAA, используемыми во всем мире 4,5,6, хотя эти соединения были перечислены в международной Стокгольмской конвенции в 2009 и 2019 годах 7,8 соответственно. Благодаря своей стойкости и широкому применению ПФОС и ПФОК широко обнаруживаются в различных экологических матрицах. Концентрации ПФОК и ПФОС в поверхностных водах различных мировых рек и озер составляют соответственно 0,15-52,8 нг/л и 0,09-29,7 нг/л9. В связи с использованием грунтовых вод или регенерированной воды для орошения, а также использованием биотвердых веществ в качестве удобрений в почве широко присутствуют ПФОК и ПФОС в диапазоне от 0,01 до 123 мкг/кг до 0,003-162 мкг/кг, соответственно10, что может привести к образованию большого количества ПФЖК и создать потенциальную опасность для здоровья человека. Концентрации PFAA (C4-C8) в сельскохозяйственных почвах и зерновых (пшеница и кукуруза) показывают положительную линейную корреляцию11. Поэтому крайне важно исследовать накопление и транслокацию PFAA внутри растений.
Транслокация PFAA в растениях в первую очередь происходит от корней к надземным тканям, а транслокация PFAA от корней к съедобным тканям рассматривается как транспортировка на большие расстояния 12,13. Предыдущие исследования обнаружили бисфенол А, нонилфенол и природные эстрогены в овощах и фруктах14, что означает, что эти химические вещества могут мигрировать через флоэму. Следовательно, выявление транслокации PFAA в растениях важно для оценки их потенциального риска. Однако на накопление и транслокацию PFAA влияет их биодоступность в почве, поэтому нелегко оценить транслокационную способность целевых PFAA в растениях. Кроме того, гидропонные эксперименты, как правило, ограничены несколькими факторами, что затрудняет приобретение съедобных тканей растений. Как правило, флоэму собирали непосредственно с растений для наблюдения за транслокацией органических соединений на большие расстояния в растениях, тогда как из саженцев растений трудно приобрести флоэмы15. Следовательно, был введен простой и эффективный метод, метод расщепления корней, для изучения транслокации PFAA в растениях во время относительно краткосрочного воздействия. Что касается расщепленного корневого исследования, то корни в одном саженце растения разделены на две части; одну часть помещают в питательный раствор, содержащий целевые PFAA (трубка A), а другую помещают в питательный раствор в отсутствие PFAA (трубка B). После воздействия в течение нескольких дней PFAA в пробирке B измеряются с помощью LC-MS/MS. Концентрация PFAA в трубке B раскрывает транслокационный потенциал PFAA через флоэму внутри растений 16,17,18.
Сообщалось об эксперименте с расщепленным корнем для изучения транслокации на большие расстояния многих соединений в растениях, таких как наночастицы CuO17, стероидные эстрогены18 и сложные эфиры фосфорорганических соединений16. Эти исследования предоставили доказательства того, что эти соединения могут передаваться через флоэму в съедобные части растений. Однако необходимо дополнительно изучить вопрос о том, могут ли PFAA способствовать транслокации растений и влиянию свойств соединений. Основываясь на этих отчетах, в настоящем исследовании был проведен эксперимент с расщепленным корнем, чтобы выявить перенос PFAA в пшенице на большие расстояния.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Семена пшеницы, Triticum aestivum L., были закуплены (см. Таблицу материалов) и использованы для настоящего исследования.
1. Прорастание рассады пшеницы и гидропонная культура
- Выберите семена пшеницы аналогичного размера и продезинфицируйте их в течение 15 мин 8% (мас./мас.) раствором перекиси водорода.
- Тщательно промойте продезинфицированные семена деионизированной водой, а затем поместите их на влажную фильтровальную бумагу в темноте комнатной температуры, чтобы они проросли в течение 5 дней.
- Отбирают примерно девять проросших саженцев одинакового размера и переносят их в пластиковые стаканы с 250 мл питательного раствора (1/4 прочности раствора Хоугланда; его химический состав показан в таблице 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Из девяти семян три были отобраны для заготовки, ПФОК и ПФОС, соответственно. - Культивируют рассаду в камеры роста в течение 7 дней перед воздействием с циклом 14 ч при 22 °C и 10 ч при 27 °C.
2. Эксперимент по расщеплению корней
- Проводят выращивание рассады в двух центрифужных трубках по 50 мл (А и В).
ПРИМЕЧАНИЕ: В центрифужной трубке А присутствовало 50 мл стерильного раствора Хоагланда силой 1/4, и такое же количество питательного раствора присутствовало в центрифужной трубке В.- Растворить коммерческие ПФОК и ПФОС (см. Таблицу материалов) в метаноле и разбавить их стерильным питательным раствором в качестве исходного раствора. Затем добавить исходный раствор в пробирку В при концентрации ПФОК/ПФОС 100 мкг/л.
- Выполняйте обработку в трех экземплярах с помощью пустого контроля для мониторинга фонового загрязнения. Принципиальная схема экспериментов с разделенным корнем экспозиции показана на рисунке 1.
- Разделите целые корни саженца пшеницы пинцетом на две равные части так, чтобы корни все равно были привязаны к тому же побегу и аккуратно вставьте их в трубки А и В соответственно.
- Запечатайте две трубки алюминиевой фольгой и культивируйте их в инкубаторе в течение 7 дней. Поддерживать те же условия инкубации, которые указаны на этапе 1.4.
- Соберите рассаду пшеницы после 7 дней посева и разделите пшеницу на три части: побеги и корни, культивируемые в шипованном растворе PFAA и невыжатом растворе соответственно, используя стерилизованные ножницы.
- Сублимационная сушка образцов растений в лиофилизаторе при −55 °C в течение 48 ч.
- Гомогенизируйте и взвесьте образцы корней и побегов. Соберите образцы шипованного и несыпанного раствора.
3. Извлечение ПФОК и ПФОС из растительных тканей
- Добавьте 2 мл буфера карбоната натрия (0,25 моль/л), 1 мл сероводорода тетрабутиламмония (0,5 моль/л) и 5 мл метил-трет-бутилового эфира (см. Таблицу материалов) в полипропиленовую трубку объемом 15 мл, включая гомогенизированный корень или побег.
- Встряхните трубку при 250 об/мин в течение 20 мин и центрифугу при 2000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре для получения надосадочной органической фазы. Выполните процесс извлечения дважды.
- Смешайте собранные экстракты, испарите до сухости в мягком потоке азота (N2), а затем восстановите 5 мл метанола и вращайте их, поддерживая ту же скорость в течение примерно 30 с.
- Кондиционируйте картридж с пестицидом (см. Таблицу материалов) 5 мл 0,1% NH4OH в метаноле, 5 мл воды и 5 мл метанола.
- Добавьте 5 мл экстрагированного раствора метанола через картридж пестикарба (500 мг/6 мл) для удаления пигмента, элюируйте картридж 5 мл метанола и соберите в те же пробирки.
- Испаряют собранные 10 мл раствора метанола почти до сухости и восстанавливают с 200 мкл метанола с последующим вихрем и центрифугированием при 10 000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре.
4. Пробоподготовка из питательного раствора
- Состояние с 5 мл метанола и 5 мл воды для активации картриджа экстракции полярно-усиленного полимера (PEP) (60 мг/г, 3 мл) (см. Таблицу материалов).
- Добавьте 1 мл шипованного раствора или 50 мл образцов несыпанного раствора (этап 2.6) через картридж, соответственно.
- Элюируют целевые PFAA 10 мл метанола, выпаривают экстракт с мягкимN2, а затем восстанавливают 200 мкл метанола для анализа.
5. Инструментальный анализ
- Использовать сверхэффективную жидкостную хроматографию UPLC в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественной оценки целевых PFAA в многореакционном режиме (MRM) и отрицательной электрораспылительной ионизации (ESI-) (см. Таблицу материалов).
- Впрыскивайте 10 мкл образцов и отделяйте целевые PFAA с помощью жидкой хроматографической колонки C18 (1,7 мкм, 2,1 мм x 50 мм, см. Таблицу материалов) и используйте 2 мМ ацетата аммония в воде (фаза A) и метанол (фаза B) в качестве подвижной фазы для UPLC со скоростью потока 0,3 мл / мин. Поддерживайте температуру колонны на уровне 50 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ионные переходы ПФОК и ПФОС составляют соответственно 413-369 и 499-80. Программа градиентного элюирования и инструментальные параметры LC-MS/MS для количественной оценки целевых PFAA перечислены в таблице 2. - Обработка данных с помощью программного обеспечения для анализа данных (см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эксперимент с расщепленным корнем исследовал перенос PFAA в пшенице на большие расстояния. Как показано на рисунке 2А,С, как ПФОК, так и ПФОС могут быть поглощены корнем пшеницы и перенесены в побег. ПФОС и ПФОК не были обнаружены в корне пшеницы и растворе в пробирке А заготовительного контроля. Было установлено, что ПФОС и ПФОК были обнаружены в корнях пшеницы, культивируемых в невыжатом растворе, с концентрацией 0,26 нг/г ± 0,02 нг/г и 0,64 нг/г ± 0,05 нг/г сухого веса (dw) (n = 3), соответственно, на которые приходится 1,5% и 1,8% накопления в растении цельной пшеницы. Этот результат свидетельствует о том, что ПФОС и ПФОК могут подвергаться переносу на большие расстояния через флоэму от побега к корню. Следует отметить, что ПФОС и ПФОК были также обнаружены в несыпанном растворе питательных веществ с концентрацией соответственно 17,8 нг/л ± 0,28 нг/л и 28,5 нг/л ± 5,9 нг/л (n = 3), что позволяет предположить, что ПФОК и ПФОС могут проходить через корневую каспарианскую полосу19,20 и выбрасываться в окружающую среду. Результаты настоящей работы дают убедительные доказательства того, что перенос на большие расстояния также является важным путем для пшеницы для ликвидации PFAA.
Рисунок 1: Принципиальная схема экспериментов с разделенным корнем. Все корни саженца пшеницы были поровну разделены на две части и аккуратно вставлены в трубки (А) и (В). Гидропонный пластиковый корневой фиксатор с соответствующей губкой использовался для соединения двух трубок и фиксации рассады. Для пустой группы задано решение в A; Все трубки B не развязаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Распределение концентраций ПФОК и ПФОС в эксперименте с расщепленным корнем после 7 дней воздействия. Шипованный раствор (раствор, содержащий целевые PFAA), шипованный корень (корень в растворе с шипами PFAA) и побег (A) PFOA и (C) PFOS. Несыпанный раствор (раствор без PFAA) и невыжатый корень (корень в невыжатом растворе) (B) PFOA (D) и ПФОС. Полосы ошибок обозначают стандартные отклонения (n = 3). Аббревиатура: dw = сухой вес. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Компонент | Молекулярная масса | Консьюшн стокового раствора (г/л) | Объем запасного раствора на литр конечного раствора (мл) | Элемент | Окончательный вывод элемента в питательном растворе (ppm) |
| Макронутриенты | |||||
| КНО3 | 101.1 | 101.1 | 1.25 | K | 56 |
| Ca(NO3)2. 4Ч2О | 236.16 | 236.16 | 1 | N | 58.75 |
| NH4Ч2PO4 | 115.08 | 115.08 | 0.5 | Центр сертификации | 40 |
| МгСО4. 7Ч2О | 246.48 | 246.48 | 0.25 | P | 15.5 |
| Мг | 6 | ||||
| S | 8 | ||||
| Железо (ЭДТА-Фена) | |||||
| ЭДТА-Фена | 367.05 | 7.342 | 0.25 | Фе | 0.28 |
| Микроэлементы | |||||
| H3BO3 | 61.83 | 2.86 | B | 0.125 | |
| MnCl2. 4Ч2О | 197.91 | 1.81 | Мн | 0.125 | |
| ZnSO4. 7Ч2О | 287.56 | 0.22 | Зн | 0.0125 | |
| CuSO4 | 159.61 | 0.051 | Cu | 0.005 | |
| H2MoO4 (85% MoO3) | 161.97 | 0.017 | Мо | 0.0025 |
Таблица 1: Химические составы 1/4 силы питательного раствора Хоагланда. Этот питательный раствор представляет собой невыжатый раствор в эксперименте с расщепленным корнем.
| Температура колонны | 50 °С | |||||
| Мобильная фаза | 2 мМ ацетата аммония в воде рН = 9 (А) и метанол (В) | |||||
| Градиент | Время (мин) | Расход (мл/мин) | A (%) | B (%) | ||
| Начальный | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 0.5 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 5 | 0.3 | 15 | 85 | |||
| 5.1 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7.1 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 9 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| Параметры массы | Капиллярное напряжение: -1,5 кВ | |||||
| Температура растворения 500 °C | ||||||
| Расход газа для дезинструкции: 1000 л/ч | ||||||
| Расход конусного газа: 150 л/ч | ||||||
| Многократный | Соединений | Родительские ионы | Ионы продукта (м/з) | |||
| реакция | (м/з) | |||||
| контроль | ||||||
| (Управление записями сообщений) | ПФОКА | 413 | 369 | |||
| Переходы | ПФОС | 499 | 80 | |||
Таблица 2: Инструментальные параметры LC-MS/MS для количественной оценки целевых PFAA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы обеспечить точность этого метода, необходимо провести тщательную операцию, чтобы убедиться, что шипованный раствор в трубке В не загрязняет невыжатый раствор в трубке А. Данная концентрация целевых PFAA в настоящем исследовании была относительно выше, чем их концентрация в реальной среде, что обеспечивало мониторинг целевых PFAA в пшенице и неспирированном растворе с использованием LC-MS/MS.
У этого метода есть ограничения. Поскольку в каждой группе обработки использовался только один саженец пшеницы и корень был разделен пополам, если начальная концентрация шипованного раствора относительно низкая, то меньше биомассы, полученной в результате окончательной обработки, может привести к тому, что концентрация PFAA в корнях, культивируемых в невыжатом растворе, будет ниже предела обнаружения. Кроме того, из-за короткого времени воздействия не удалось определить транспорт PFAA от корней к съедобным частям пшеницы. Эксперимент с разделенным корнем мог проанализировать только перенос флоэмы PFAA с различными свойствами в растениях16.
Этот метод имеет большое значение для понимания переноса на большие расстояния12,13 загрязняющих веществ в тканях растений. Согласно полученным результатам, PFAA могут быть поглощены корнями и перенесены в побеги в основном через ксилему; однако следует отметить, что они могут быть перемещены из листьев в съедобные ткани, а также из побегов к корням через флоэму, что важно для оценки их потенциального риска транслокации в растениях. Кроме того, транслокация PFAA из надземных тканей в корни и последующее высвобождение в окружающую среду обеспечивает убедительные доказательства путей элиминации PFAA в растениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы с благодарностью выражаем финансовую поддержку со стороны Фонда естественных наук Китая (NSFC 21737003), Научного фонда китайских университетов (No 2452021103) и Китайского научного фонда постдокторантуры (No 2021M692651, 2021M702680).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACQUITY UPLC BEH C18 column | Waters, Milford, MA | Liquid chromatographic column | |
| Cleanert PEP cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| Clearnert Pesticarb cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S) | Waters, Milford, MA | Liquid chromatography and mass spectrometry | |
| Lyophilizer | Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China | FD-1A50 | Freeze-dried sample |
| Masslynx | Waters, Milford, MA | data analysis software | |
| Methyl tert-butyl ether | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| MPFAC-MXA | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXA0518 | the internal standards |
| PFAC-MXB | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXB0219 | mixture of PFAA calibration standards |
| PFOA | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 335-67-1 | a represent PFAAs |
| PFOS | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 2795-39-3 | a represent PFAAs |
| Sodium carbonate buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Tetrabutylammonium hydrogen sulfate | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Wheat seeds | Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China) | Triticum aestivum L. |
References
- Lindstrom, A. B., Strynar, M. J., Libelo, E. L. Polyfluorinated compounds: Past, present, and future. Environmental Science & Technology. 45 (19), 7954-7961 (2011).
- Kannan, K. Perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances: Current and future perspectives. Environmental Chemistry. 8 (4), 333-338 (2011).
- Cui, Q., et al. Occurrence and tissue distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids and legacy per/polyfluoroalkyl substances in black-spotted frog (Pelophylax nigromaculatus). Environmental Science & Technology. 52 (3), 982-990 (2018).
- Negri, E., et al. Exposure to PFOA and PFOS and fetal growth: a critical merging of toxicological and epidemiological data. Critical Reviews in Toxicology. 47 (6), 489-515 (2017).
- Chi, Q., Li, Z., Huang, J., Ma, J., Wang, X. Interactions of perfluorooctanoic acid and perfluorooctanesulfonic acid with serum albumins by native mass spectrometry, fluorescence and molecular docking. Chemosphere. 198, 442-449 (2018).
- Zhang, X., Chen, L., Fei, X. C., Ma, Y. S., Gao, H. W. Binding of PFOS to serum albumin and DNA: insight into the molecular toxicity of perfluorochemicals. Bmc Molecular Biology. 10, 16 (2009).
- Stockholm Convention. PFASs listed under the Stockholm Convention. , Switzerland. Available from: http://chm.pops.int/Implementation/IndustrialPOPs/PFOS/Overview/tabid/5221/Default.aspx (2009).
- Stockholm Convention. Chemicals proposed for listing under the Convention. , Switzerland. Available from: http://chm.pops.int/TheConvention/ThePOPs/ChemicalsProposedforListing/tabid/2510/Default.aspx (2019).
- Pan, Y. T., et al. Worldwide distribution of novel perfluoroether carboxylic and sulfonic acids in surface water. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7621-7629 (2018).
- Knight, E. R., et al. An investigation into the long-term binding and uptake of PFOS, PFOA and PFHxS in soil - plant systems. Journal of Hazardous Materials. 404, 124065 (2021).
- Liu, Z. Y., et al. Crop bioaccumulation and human exposure of perfluoroalkyl acids through multi-media transport from a mega fluorochemical industrial park, China. Environment International. 106, 37-47 (2017).
- Mei, W. P., et al. Per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) in the soil-plant system: Sorption, root uptake, and translocation. Environment International. 156, 106642 (2021).
- Wang, W., Rhodes, G., Ge, J., Yu, X., Li, H. Uptake and accumulation of per- and polyfluoroalkyl substances in plants. Chemosphere. 261, 127584 (2020).
- Lu, J., Wu, J., Stoffella, P. J., Wilson, P. C. Analysis of bisphenol A, nonylphenol, and natural estrogens in vegetables and fruits using gas chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (1), 84-89 (2013).
- Herschbach, C., Gessler, A., Rennenberg, H. Long Distance Transport and Plant Internal Cycling of N- and S-Compounds. Progress in Botany 73. Luttge, U., Beyschlag, W., Budel, B., Francis, D. , Springer. Berlin, Heidelberg. 161-188 (2012).
- Liu, Q., et al. Uptake kinetics, accumulation, and long-distance transport of organophosphate esters in plants: Impacts of chemical and plant properties. Environmental Science & Technology. 53 (9), 4940-4947 (2019).
- Wang, Z. Y., et al. Xylem- and phloem-based transport of CuO nanoparticles in maize (Zea mays L.). Environmental Science & Technology. 46 (8), 4434-4441 (2012).
- Chen, X., et al. Uptake, accumulation, and translocation mechanisms of steroid estrogens in plants. Science of the Total Environment. 753, 141979 (2021).
- Felizeter, S., McLachlan, M. S., de Voogt, P. Uptake of perfluorinated alkyl acids by hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa). Environmental Science & Technology. 46 (21), 11735-11743 (2012).
- Zhou, J., et al. Insights into uptake, translocation, and transformation mechanisms of perfluorophosphinates and perfluorophosphonates in wheat (Triticum aestivum L.). Environmental Science & Technology. 54 (1), 276-285 (2020).
